王鵬程，楊揚，崔明珠，李治松

1.黃淮學(xué)院直屬附屬駐馬店市中心醫(yī)院，河南 駐馬店 463000； 2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003； 3.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450014

麻醉是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診療過程中重要的輔助手段，但全身麻醉可能會對機體產(chǎn)生不良的影響，甚至誘發(fā)神經(jīng)毒性[1]。既往研究證實，麻醉引發(fā)的神經(jīng)毒性與氧化應(yīng)激、神經(jīng)性炎癥及神經(jīng)元凋亡等密切相關(guān)，但其具體作用機制尚不清楚[2-4]。七氟烷是目前臨床上使用較為廣泛的吸入性麻醉劑，長時間及過量的七氟烷吸入會嚴重損害神經(jīng)系統(tǒng)功能，包括神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、空間學(xué)習(xí)記憶能力等[5-7]。海馬作為大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為復(fù)雜的部位，其損傷時會引起學(xué)習(xí)減退、記憶能力降低及認知功能障礙等[8-9]。既往研究顯示，七氟烷能夠通過促進炎性因子表達，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致大鼠認知功能障礙[10]。但是，有關(guān)七氟烷對海馬神經(jīng)損傷的調(diào)控機制尚不完全清楚，因此，探尋七氟烷對認知功能障礙的機制并予以干預(yù)治療尤為重要。

中醫(yī)藥干預(yù)治療對于改善大鼠麻醉后炎癥反應(yīng)和認知功能障礙具有重要作用。2020年版《中華人民共和國藥典》記載牛蒡子具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、解毒利咽的功效，治療感冒發(fā)熱、癰腫化膿、丹毒痄腮等疾病效果顯著。新近研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡子具有抗炎和改善學(xué)習(xí)記憶等作用[11]。牛蒡子苷元是從中藥牛蒡子中提取得到的木脂類化合物，具有抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護等作用[12]。研究表明，牛蒡子苷元能夠通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)信號通路改善阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力障礙[13]。在弓形蟲誘導(dǎo)的BALB/c小鼠神經(jīng)精神疾病模型中，牛蒡子苷元能夠通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信號通路減輕小鼠神經(jīng)性炎癥[14]。C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6(C1q/tumor necrosis factor-related protein 6，CTRP6)是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的一類脂肪因子蛋白超家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，CTRP6能夠通過調(diào)節(jié)Akt/NF-κB信號通路影響高糖誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)細胞炎性反應(yīng)[15]。因此，本研究旨在探究牛蒡子苷元能否通過調(diào)節(jié)CTRP6/Akt/NF-κB信號通路改善七氟烷誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)性炎癥及認知功能障礙，為七氟烷不良反應(yīng)的預(yù)防提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物雄性SPF級6周齡SD大鼠50只，體質(zhì)量200～220 g，購于鄭州大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK(豫)2019-0025。動物飼養(yǎng)在SPF級飼養(yǎng)室內(nèi)，晝夜12 h/12 h交替，室內(nèi)溫度(25±2) ℃，期間自由飲食，飲水。動物實驗經(jīng)過駐馬店中心醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)，倫理批號：202002003。

1.2 藥品與試劑七氟烷(山東魯南貝特制藥有限公司，批號：65170507)；牛蒡子苷元(武漢科斯坦生物科技有限公司，純度≥98%，批號：HB-01110)。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，濟南世紀(jì)通達化工有限公司，批號：CAS67-68-5)；白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國Sigma公司，批號：RAB0311、RAB0277、RAB0479)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒、原位缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidy transferase mediated nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、羊抗兔IgG抗體、羊抗鼠IgG抗體、β-actin抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0105S、C1088、P0009、A0239、A0192、AF5001)；CTRP6抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、NF-κB抗體、p-NF-κB抗體(英國Abcam公司，批號：ab36898、ab8805、ab38449、ab32536、ab76302)；CTRP6免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號：SP-9001)。

1.3 儀器TWK-FST32型組織勻漿儀(武漢泰普拓科技有限公司)；Micro17R型高速冷凍離心機(離心半徑：20 cm)、FC型全自動多功能酶標(biāo)檢測儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；1658033型電泳儀、ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 藥物制備稱取適量牛蒡子苷元，采用 200 μL DMSO進行溶解，使其終濃度分別為1 g·mL-1和0.05 g·mL-1，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 大鼠分組、造模及干預(yù)50只雄性SPF級SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、七氟烷組及牛蒡子苷元低(5 mg·kg-1)、中(10 mg·kg-1)、高(20 mg·kg-1)劑量組，每組10只。除對照組外，其余組大鼠進行6%七氟烷吸入性麻醉，3 h后自然蘇醒，對照組大鼠不做任何處理。牛蒡子苷元低、中、高劑量組大鼠在七氟烷吸入麻醉前腹腔注射 200 μL 牛蒡子苷元溶液，對照組和模型組大鼠給予等體積DMSO。給藥48 h后進行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

2.3 Morris水迷宮實驗定位航行實驗：5組大鼠連續(xù)訓(xùn)練3 d，訓(xùn)練時，將大鼠從面向池壁的4個入水點放入水中，記錄大鼠從入水到明確找到并站立于水下隱蔽平臺的時間，即為逃避潛伏期。每只大鼠從池壁的4個入水點分別訓(xùn)練1次，每次間隔時長30 s。訓(xùn)練結(jié)束后，每組隨機選取6只大鼠進行實驗?？臻g探索行為實驗：在定位航行實驗結(jié)束后，撤去平臺，大鼠從池壁的同一入水點放入水中，記錄大鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)，即為穿臺指數(shù)。

2.4 ELISA法檢測大鼠血清炎癥因子水平大鼠麻醉后，心臟取血，4 ℃，3 000 r·min-1離心 10 min，取其上清，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，檢測大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

2.5 HE染色觀察大鼠海馬組織病理形態(tài)各組大鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，每組隨機取6只大鼠腦組織，摘取視交叉至漏斗柄的腦片，采用4%多聚甲醛固定各組大鼠海馬組織，脫水、透化、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進行海馬組織染色，顯微鏡下觀察各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化。

2.6 TUNEL染色觀察海馬神經(jīng)元凋亡按“2.5項”下操作制備石蠟切片，按照TUNEL法測定大腦海馬神經(jīng)元凋亡。其中，細胞核呈熒光綠色的細胞為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。

細胞凋亡率(%)=TUNEL陽性細胞數(shù)目/細胞總數(shù)目×100%

2.7 免疫組化檢測大鼠海馬組織CTRP6的表達每組取6只大鼠，采用4%多聚甲醛固定大鼠海馬組織，脫水、透化、包埋、石蠟切片，組織切片厚度為3～5 μm，采用3%H2O2溶液孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，85 ℃抗原修復(fù)，加入10%BSA溶液封閉20 min。加入CTRP6抗體(1:200)，4 ℃條件下孵育過夜。加入對應(yīng)羊抗兔IgG抗體(1:2 000)，室溫條件下孵育30 min。滴加DAB顯色液，利用Image Pro Plus軟件進行圖像分析，評估CTRP6蛋白的表達水平。

2.8 Western Blot檢測海馬組織CTRP6、Akt、p-Akt、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達水平取大鼠海馬組織進行研磨，裂解。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加Akt抗體(1:1 000)、p-Akt抗體(1:1 000)、NF-κB抗體(1:1 000)、p-NF-κB(1:1 000)抗體、CTRP6抗體(1:500)及β-actin抗體(1:2 000)，4 ℃孵育過夜。加對應(yīng)的羊抗兔IgG抗體(1:5 000)或羊抗鼠IgG抗體(1:5 000)，孵育1～2 h。加含吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，每次5 min，加入顯影液，顯影并拍照。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值的比值反映目的蛋白的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 牛蒡子苷元對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠逃避潛伏期時間顯著延長(P<0.05)，穿臺指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元低、中、高劑量組大鼠逃避潛伏期時間顯著縮短(P<0.05)，穿臺指數(shù)顯著增加(P<0.05)。見圖1。

注：A：逃避潛伏期；B：穿臺指數(shù)；與對照組比較，#P<0.05；與七氟烷組比較，*P<0.05

3.2 牛蒡子苷元對大鼠血清炎癥因子含量的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元低、中、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 牛蒡子苷元對大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

3.3 牛蒡子苷元對大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)的影響對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、清晰，細胞呈極性排列；七氟烷組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，細胞排列紊亂，細胞大部分皺縮，部分神經(jīng)元細胞核固縮、染色質(zhì)出現(xiàn)明顯聚集；牛蒡子苷元各劑量組大鼠海馬CA1區(qū)病理性損傷明顯減輕。見圖2。

圖2 牛蒡子苷元對大鼠海馬組織病理變化的影響(HE，×200)

3.4 牛蒡子苷元對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元各劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 牛蒡子苷元對大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響(TUNEL染色)

注：與對照組比較，#P<0.05；與七氟烷組比較，*P<0.05

3.5 牛蒡子苷元對大鼠海馬組織CTRP6表達的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬組織CTRP6表達顯著降低(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元各劑量組大鼠海馬組織CTRP6表達均顯著增加(P<0.05)。見圖5。

注：A：免疫組化染色結(jié)果；B：Western Blot檢測結(jié)果；與對照組比較，#P<0.05；與七氟烷組比較，*P<0.05

3.6 牛蒡子苷元對Akt/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬組織p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平顯著增加(P<0.05)；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元組大鼠海馬組織p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平顯著降低(P<0.05)。見圖6。

注：與對照組比較，#P<0.05；與七氟烷組比較，*P<0.05

4 討論

七氟烷吸入性麻醉與大腦記憶功能損傷密切相關(guān)，會誘發(fā)患者短暫性學(xué)習(xí)和記憶下降，其機制與抑制海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元電壓門控通道相關(guān)[16-17]。另外，七氟烷還可誘發(fā)海馬組織氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，從而促進神經(jīng)元凋亡[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)過度炎癥性反應(yīng)及細胞凋亡是誘導(dǎo)認知功能障礙的重要機制。中醫(yī)藥治療在改善海馬神經(jīng)損傷及認知功能障礙中發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，具有和表解里、疏肝升陽功效的蘇郁膠囊能夠抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡[20]；具有健脾益智作用的定志小丸能夠通過促進海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細胞增殖，保護海馬結(jié)構(gòu)，從而改善慢性應(yīng)激大鼠行為[21]。藥食同源的牛蒡子始載于《名醫(yī)別錄》，味辛、苦，性寒，主要用于疏散風(fēng)熱、利咽消腫、疹出不暢、解毒透疹等癥。牛蒡子含有多種成分，具有廣泛的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，牛蒡子主要活性成分之一牛蒡子苷元廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的治療，能夠改善精神性疾病小鼠海馬神經(jīng)炎性反應(yīng)及認知功能障礙[12]。本研究結(jié)果顯示，七氟烷吸入性麻醉大鼠CA1區(qū)海馬神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，細胞排列紊亂，細胞大部分皺縮，部分神經(jīng)元細胞核固縮、染色質(zhì)明顯聚集，學(xué)習(xí)功能減退、記憶能力下降，并伴有血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平的增加，海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)增加，進一步證實海馬神經(jīng)炎性反應(yīng)及細胞凋亡與大鼠認知功能障礙密切相關(guān)。牛蒡子苷元干預(yù)后大鼠海馬CA1區(qū)病理性損傷減輕，學(xué)習(xí)記憶功能明顯好轉(zhuǎn)，血清促炎因子 IL-6、IL-1β、TNF-α含量以及海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)降低，表明牛蒡子苷元能夠通過抑制海馬神經(jīng)炎性和細胞凋亡改善七氟烷誘發(fā)的大鼠認知功能障礙。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在細胞增殖、存活、葡萄糖代謝、凋亡以及血管生成等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[22-23]。研究表明，Akt廣泛表達于機體各種組織，p-Akt是其活化形式[24-25]，能激活NF-κB，促進IκB與NF-κB解離，形成具有活性的p-NF-κB亞甲基，使其順利進入細胞核，進而促進相關(guān)炎性細胞因子表達，最終導(dǎo)致炎性反應(yīng)發(fā)生[26-27]。既往研究證實，七氟烷吸入性麻醉大鼠海馬組織Akt磷酸化水平增加[28]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬組織p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平顯著升高；與七氟烷組比較，牛蒡子苷元組大鼠海馬組織p-Akt/Akt和p-NF-κB/NF-κB的水平均顯著降低，表明牛蒡子苷元可通過調(diào)控Akt/NF-κB信號通路抑制海馬神經(jīng)炎性反應(yīng)和細胞凋亡，從而改善大鼠認知功能障礙。

CTRP6是脂肪因子蛋白超家族成員之一，廣泛參與組織炎癥及纖維化過程。既往研究表明，CTRP1、CTRP3及CTRP9與缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能損傷密切相關(guān)[29-31]。在腦出血小鼠腦神經(jīng)損傷模型中，鼻腔內(nèi)注射重組CTRP6能夠通過脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)/AMPK/NF-κB 通路抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而減輕腦水腫和神經(jīng)功能[32]。本研究通過免疫組織化學(xué)和Western Blot檢測顯示，與對照組比較，七氟烷組大鼠海馬組織CTRP6表達顯著降低，提示CTRP6可能與海馬神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)；牛蒡子苷元干預(yù)后，大鼠海馬組織CTRP6表達顯著升高，提示牛蒡子苷元可通過上調(diào)CTRP6的表達改善七氟烷誘發(fā)的大鼠神經(jīng)功能損傷，進而改善七氟烷誘發(fā)的大鼠認知功能障礙。既往研究證實，敲低CTRP6能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)細胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及細胞外基質(zhì)沉積，其機制與調(diào)控Akt/NF-κB信號通路相關(guān)[15]。

綜上所述，牛蒡子苷元能夠明顯改善七氟烷麻醉誘發(fā)的大鼠神經(jīng)性炎癥反應(yīng)和認知功能障礙，其作用可能與調(diào)控CTRP6/Akt/NF-κB信號通路有關(guān)。