李鑫潔，陳建新，魯藝

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

鎖陽(yáng)為鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉質(zhì)莖[1]，主要分布于我國(guó)西北部荒漠地域，素有“沙漠人參”之稱[2]。在中醫(yī)臨床中，鎖陽(yáng)常用于治療腎陽(yáng)虛引起的陽(yáng)痿、不孕、腰膝酸軟及腸燥津枯引起的大便干燥等[3]?；谔烊恢胁菟幘哂卸喑煞?、多功效、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，現(xiàn)代研究者對(duì)鎖陽(yáng)進(jìn)行了大量研究，以求在各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮最大的利用價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為，阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)理是腎精不足、腦髓漸空，臨床上常選用補(bǔ)腎益精中藥來(lái)治療與阿爾茨海默病相似的癥狀，如記憶力減退，理解能力降低、情緒低落等。研究表明，中藥鎖陽(yáng)的乙酸乙酯提取物可有效改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶障礙[4]，提高氧化損傷模型SK-N-SH人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存活率[5]，具有體外神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)不僅嚴(yán)重影響病人自主活動(dòng)、自理能力，給身邊親屬帶來(lái)精神和心理壓力[6]。目前，關(guān)于阿爾茨海默病的發(fā)病假說(shuō)有很多，如Aβ蛋白沉積、Tau蛋白異常等，但并沒(méi)有開(kāi)發(fā)出效果甚佳的藥物。隨著腸道微生物組學(xué)研究的迅速發(fā)展，有學(xué)者提出“微生物-腦-腸軸”假說(shuō)，認(rèn)為AD的治療也可以從腸道菌群方向開(kāi)展[7]。研究表明，腸道菌群失調(diào)在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用，調(diào)節(jié)腸道菌群可以減少Aβ蛋白沉積、降低Tau蛋白過(guò)度磷酸化、減輕炎癥反應(yīng)等方式改善AD的癥狀[8-9]。如由于益生菌的不斷減少，機(jī)體抵抗力下降，炎癥反應(yīng)加劇，神經(jīng)細(xì)胞將不能進(jìn)行正常的生理活動(dòng)而凋亡，從而引發(fā)AD[10]。因此，本課題以AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠為研究對(duì)象，基于腸道菌群豐度與多樣性的變化，探討鎖陽(yáng)乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of cynomorium songaricum，ECS)對(duì)AD模型小鼠腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物8周齡雄性SPF級(jí)5xFAD阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠16只，體質(zhì)量20～30 g，購(gòu)買于上海虔碧生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0006。使用PCR及電泳技術(shù)檢測(cè)小鼠的基因組DNA，鑒定小鼠為5xFAD阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠。8周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠8只，體質(zhì)量20～30 g，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0011。所有小鼠單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，并按照動(dòng)物中心飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房(溫度 20～25 ℃，光照和黑暗各12 h)，定期觀察小鼠生長(zhǎng)情況，按時(shí)更換墊料、飼料及飲用水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，倫理批號(hào)：BUCM-4-2019083002-3102。

1.2 藥物與試劑鎖陽(yáng)(北京國(guó)醫(yī)堂，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，貨號(hào)：701002539)。乙醇(純度：≥95%)、乙酸乙酯(純度：≥99%)、石油醚(純度：≥99%)、生理鹽水(北京通廣精細(xì)化工廠，貨號(hào)：101057、101028、105119、111541)；Illumina Nextera 試劑盒、QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒(北京奧維森基因科技有限公司，貨號(hào)：1311001、56104)。

1.3 儀器BSA223S-CW型分析天平(德國(guó)賽多利斯股份有限公司)；101FAB-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；R-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海增森儀器科技有限公司)；Sigma1-15PK型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；KW-MWM 型Morris 水迷宮系統(tǒng)(南京卡爾文生物科技有限公司)；BW-YLS-3TB型小鼠跳臺(tái)記錄系統(tǒng)(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)；Dura Pro型組合式超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；Illumina Miseq高通量測(cè)序儀(北京德利卡生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)，將鎖陽(yáng)飲片用10倍量的70 %乙醇浸泡過(guò)夜，超聲提取3次，每次1 h，收集提取液，抽濾，加熱回流，濃縮直至無(wú)醇味。加少量水溶解，石油醚萃取4～5次，收集下層水層。乙酸乙酯萃取收集的水層4～5次，萃取至無(wú)色，收集上層有機(jī)層，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，干燥，得黃棕色粉末，稱重，測(cè)得ECS提取率為2.36%。經(jīng)鑒別，該粉末中雜質(zhì)<2%，總灰分<12%，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 分組與給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，8周齡5xFAD小鼠隨機(jī)分為模型組和ECS組，以野生型C57BL/6小鼠為對(duì)照組，每組8只。ECS組小鼠以20 mL·kg-1的劑量灌胃給予47 mg·kg-1ECS，對(duì)照組和模型組分別灌胃等量去離子水，每天1次，連續(xù)84 d。

2.3 Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)實(shí)驗(yàn)直徑1.2 m的黑色圓柱形水池注水，使水平面高于站立平臺(tái)1～2 cm，水溫保持在25 ℃左右，加適量牛奶變?yōu)槿榘咨?，并將圓柱形水池分為西北(northwest，NW)、東北(northeast，NE)、東南(southeast，SE)、西南(southwest，SW)四個(gè)象限，用數(shù)字?jǐn)z像機(jī)實(shí)時(shí)記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡和時(shí)間，并用軟件分析。前4天為隱匿平臺(tái)學(xué)習(xí)訓(xùn)練，每天4次，隨機(jī)從不同的象限面朝池壁放入，若小鼠在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，允許其在平臺(tái)上休息30 s，記錄搜索到平臺(tái)的時(shí)間(即為逃避潛伏期)；小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引向平臺(tái)且同樣休息30 s。第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，將小鼠從西北象限放入，記錄60 s內(nèi)小鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)。

2.4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)跳臺(tái)箱為黑色長(zhǎng)方形，被黑色隔板劃分為5個(gè)“小房間”，每個(gè)“小房間”中心均為大小統(tǒng)一的白色絕緣體高站臺(tái)，跳臺(tái)箱底部為通電流的銅柵。設(shè)置電流大小為30 mA，通電時(shí)間為300 s，將腳底沾濕的小鼠置于高站臺(tái)，正常情況下，當(dāng)小鼠接觸到底部銅柵后，會(huì)被電擊而跳回高站臺(tái)。小鼠有一定的電擊記憶儲(chǔ)存時(shí)間，所以短期內(nèi)不會(huì)繼續(xù)下跳。此實(shí)驗(yàn)為期2天，第1天為學(xué)習(xí)階段，讓小鼠具有一定的電擊記憶，學(xué)習(xí)階段若小鼠未跳下站臺(tái)則棄去；第2天為測(cè)試階段，記錄小鼠第一次跳下絕緣站臺(tái)的時(shí)間(即為跳臺(tái)潛伏期)及300 s內(nèi)受到電擊的次數(shù)(即為錯(cuò)誤次數(shù))，以此反映小鼠的記憶功能。

2.5 微生物多樣性測(cè)序及分析

2.5.1 糞便樣品的收集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完成所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，禁食不禁水12 h。按4 mL·kg-1的劑量腹腔注射1 %戊巴比妥麻醉小鼠，迅速解剖取出小鼠腸組織，用無(wú)菌鑷子取出2粒糞便(約200 mg左右)，迅速轉(zhuǎn)移至滅菌的凍存管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。獲得糞便樣本共24個(gè)，每組8個(gè)。

2.5.2 基因提取及PCR擴(kuò)增和純化根據(jù)QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取糞便樣本中的總DNA，使用1 %瓊脂糖凝膠電泳對(duì)得到的DNA進(jìn)行檢測(cè)并定量。使用通用引物(F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，R：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 的V3～V4區(qū)。所有樣品上樣量為10 ng，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。反應(yīng)體系：1 μL正向引物，1 μL反向引物，10 μg DNA模板，10 μL HiFi buffer，加超純水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)3 min，95 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)30 s，60 ℃反應(yīng)30 s，循環(huán)20次，再72 ℃反應(yīng)3 min，4 ℃存放24 h后，室溫下加入 16 μL 磁珠，5 min后置于磁架上進(jìn)行分層，棄去上清液。加入200 μL乙醇，室溫放置揮發(fā)乙醇。加入40 μL水后吹打，靜置5 min，置于磁架上分層，取上清液移至離心管中。配制25 μL反應(yīng)物(1 μL正向引物+1 μL反向引物+2 μg DNA模板+12.5 μL HiFi buffer+超純水)，按上述條件進(jìn)行再次擴(kuò)增，4 ℃ 存放24 h后，重復(fù)上述PCR純化步驟，最終將擴(kuò)增純化好的PCR存于新的離心管中。

2.5.3 Miseq文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序連接“Y”字形(外懸)接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段后，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行Miseq文庫(kù)模板的富集，使用氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。DNA片段與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上，另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋”(Bridge)，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生DNA簇，DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈后，加入改造過(guò)的DNA聚合酶及帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類，將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端黏性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果。

2.5.4 多變量統(tǒng)計(jì)分析將相似度大于97 %的有效序列聚合成為一個(gè)操作分類單元(operational taxonomic units，OUT)，進(jìn)行物種分類。基于OUT進(jìn)行Alpha多樣性分析(包括稀釋曲線、chao1指數(shù)、observed species指數(shù)、PD whole tree指數(shù)及shannon指數(shù)分析)及物種分析(包括物種組成分析、屬水平進(jìn)化發(fā)生樹(shù)、物種聚類柱狀圖及熱圖分析)；基于unifrac進(jìn)行Beta多樣性分析[包括主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCOA分析)、偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA分析)]等。采用LEfSe分析，找出不同組間在豐度上存在顯著性差異的物種。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果均采用SPSS 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，多組間比較采用單因素方差分析，繼以進(jìn)行LSD多重比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MWM實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，ECS組小鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05)。提示，ECS可顯著改善AD模型小鼠的空間記憶與學(xué)習(xí)能力。見(jiàn)圖1。

注：A：不同時(shí)間各組小鼠逃避潛伏期結(jié)果比較；B：各組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)結(jié)果比較；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組小鼠跳臺(tái)潛伏期明顯縮短(P<0.05)，且錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，ECS組小鼠跳臺(tái)潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，且錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)；提示，5xFAD小鼠有記憶下降的特征，且ECS可顯著改善AD模型小鼠的記憶能力。見(jiàn)圖2。

注：A：各組小鼠跳臺(tái)潛伏期結(jié)果比較；B：各組小鼠跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)結(jié)果比較；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控及OTU分析糞便樣本共24個(gè)，總共獲得有效序列2511096條，所測(cè)樣本中最高序列條數(shù)為276135，最低序列條數(shù)為130384。使用 UPARSE聚類法共生成975個(gè)OTU，按樣本最低序列條數(shù)進(jìn)行抽平處理，得到924個(gè)OTU。在OTU水平上對(duì)不同樣本間的異同進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并通過(guò)Venn圖展現(xiàn)不同樣本之間共有或特有的OTUs。結(jié)果顯示，對(duì)照組OTU 757個(gè)，模型組OTU 651個(gè)，ECS 組OTU 730個(gè)，提示，AD小鼠的菌群多樣性降低，給予ECS干預(yù)后，小鼠的菌群多樣性明顯升高；對(duì)照組與模型組非共有的OTU 330個(gè)，表明，AD小鼠糞便菌群組成發(fā)生顯著變化；ECS 組與模型組非共有OTU 215個(gè)，對(duì)照組與ECS組非共有OTU 295個(gè)，表明 ECS 可改善5xFAD小鼠糞便菌群多樣性。見(jiàn)圖3。

注：顏色代表分組；數(shù)字表示各組間特有或共有的OTU數(shù)目

3.4 Alpha多樣性分析

3.4.1 稀釋性曲線分析隨機(jī)抽取樣本，計(jì)算并作圖，其中X軸代表每個(gè)樣本隨機(jī)抽取的序列條數(shù)，Y軸代表隨機(jī)抽取序列的OTU數(shù)量，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。結(jié)果表明，每個(gè)樣本隨機(jī)抽取的序列條數(shù)與OTU數(shù)量曲線均趨向于平坦?fàn)顟B(tài)，表明各組小鼠糞便樣本取樣數(shù)量合理。見(jiàn)圖4。

注：C：對(duì)照組；M：模型組；E：ECS

3.4.2 Alpha多樣性指數(shù)分析Alpha多樣性指數(shù)分析可以反映一個(gè)特定區(qū)域環(huán)境內(nèi)的微生物群落豐富度和多樣性，observed_species指數(shù)反映實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目，chao1和PD whole tree 指數(shù)用于估算樣本OTU總數(shù)，這三種指數(shù)都反應(yīng)樣本群落真實(shí)的物種數(shù)量，即群落豐富度；而shannon指數(shù)用于估算樣品中群落多樣性，值越大，則群落多樣性越高。chao1與observed species指數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組群落豐富度顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，ECS組群落豐富度顯著上升(P<0.05)。PD whole tree指數(shù)和Shannon指數(shù)結(jié)果顯示：各組間微生物的豐富度和多樣性均無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 Alpha多樣性指數(shù)分析

3.5 Beta多樣性分析

3.5.1 PCoA與PLS-DA分析對(duì)各組樣本進(jìn)行多元化統(tǒng)計(jì)分析，研究樣本組內(nèi)或組間群落整體組成的差異性或相似性。結(jié)果顯示：模型組與對(duì)照組明顯聚為兩類，表明模型組與對(duì)照組的微生物物種存在顯著差異；ECS組與模型組明顯聚為兩類，且向正常組靠近，表明給予ECS后，AD小鼠的腸道微生物組成得到明顯的改善，趨于恢復(fù)正常。見(jiàn)圖6。

注：A：PCoA分析圖；B：PLS-DA分析圖

3.5.2 Hcluster分析聚類分析(hierarchical cluatering，Hcluster)是一種樹(shù)枝結(jié)構(gòu)，用于闡述和比較樣本間微生物進(jìn)化的相似性和差異性，基于群落組成關(guān)系的距離矩陣，運(yùn)用非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)進(jìn)行聚類。結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組和ECS組各組組內(nèi)樣本的微生物進(jìn)化相似；與對(duì)照組比較，5xFAD小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，而ECS可以顯著改善5xFAD小鼠糞便菌群的整體結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖7。

注：C：對(duì)照組；M：模型組；E：ECS組

3.6 物種分析

3.6.1 物種組成分析

3.6.1.1 門(mén)水平(Phylum)結(jié)果顯示，OTU主要?dú)w至細(xì)菌界的7個(gè)門(mén)，分別是擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、Saccharibacteria(TM7)、軟壁菌門(mén)(Tenericutes)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)，其中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)所占豐度最高。與對(duì)照組比較，模型組擬桿菌門(mén)豐度下降，厚壁菌門(mén)豐度上升；與模型組比較，ECS組擬桿菌門(mén)豐度上升，而厚壁菌門(mén)豐度下降；ECS組與對(duì)照組細(xì)菌門(mén)的所占比例相似。見(jiàn)圖8-A，圖8-B。

3.6.1.2 目水平(Order)結(jié)果顯示，OTU主要?dú)w至10個(gè)目，分別是擬桿菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridiales)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、乳酸菌目(Lactobacillaceae)、彎曲桿菌目(Campylobacterales)、Coriobacteriales目、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)、Gastranaerophilales目、厭氧原體目(Anaeroplasmatales)、雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)，其中豐度排名前四的為擬桿菌目、梭菌目、乳酸菌目及丹毒絲菌目。與對(duì)照組比較，模型組小鼠糞便中擬桿菌目、丹毒絲菌目菌群豐度降低，梭菌目菌群豐度升高；給予ECS組后，小鼠糞便中擬桿菌目、丹毒絲菌目菌群豐度升高，梭菌目菌群豐度降低。見(jiàn)圖8-C，圖8-D。

3.6.1.3 屬水平(Genus)結(jié)果顯示，樣本中菌群落組成中豐度前20的菌屬分別是：擬桿菌目 S24-7(Bacteroidales_S24-7_group)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、毛螺菌科NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、Odoribacter、理研菌屬(Rikenellaceae)、unclassified_Lachnospiraceae、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)、Lachnoclostridium、Alloprevotella、螺桿菌屬(Helicobacter)、羅斯氏菌(Roseburia)、Rikenella、毛螺菌屬UCG-001(Lachnospiraceae_UCG-001)、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、Allobaculum、Candidatus_Saccharimona、糞球菌屬(Coprococcus)和梭菌屬(Anaerotruncus)。與對(duì)照組比較，模型組擬桿菌目S24-7及普雷沃氏菌科UCG-001豐度顯著下降(P<0.05)，而乳桿菌屬、毛螺菌科NK4A136豐度顯著上升(P<0.05)，Odoribacter有上升趨勢(shì)(P>0.05)，瘤胃菌科UCG-014及Alloprevotella豐度有下降趨勢(shì)(P>0.05)；與模型組比較，ECS組瘤胃菌科UCG-014及Alloprevotella豐度有上升趨勢(shì)(P>0.05)，并顯著增加桿菌目S24-7及普雷沃氏菌科UCG-001豐度(P<0.05)，而對(duì)Odoribacter無(wú)顯著影響。見(jiàn)圖8-E，圖8-F。

圖8 糞便菌群不同分類水平的相對(duì)豐度柱狀圖

3.6.2 Heatmap分析通過(guò)聚類分析可將高豐富和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色相似程度或顏色變化反映樣本在不同分類水平上群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異性。結(jié)果顯示：對(duì)照組與模型組菌群結(jié)構(gòu)明顯不同，給予ECS干預(yù)后，ECS組菌群結(jié)構(gòu)明顯改善，趨于恢復(fù)正常。見(jiàn)圖9。

注：C：對(duì)照組；M：模型組；E：ECS組

3.7 Anosim分析Anosim相似性分析用來(lái)判別分組是否有意義，R值為Anosim的統(tǒng)計(jì)量，數(shù)值介于-1和1之間，表明組間樣品差異與組內(nèi)樣品差異的差值大小。R值越接近1，表明組間樣品差異越大，同時(shí)組內(nèi)樣品差異越小，分組效果越好；R=0，表明分組之間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；R值越接近-1，表明組內(nèi)樣品差異超過(guò)組間樣品差異，樣品分組效果較差。結(jié)果表明，三個(gè)組R值均在(0，1)間，分組有意義。P值反映了Anosim分析結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P<0.05，表明各樣品分組之間有顯著性差異。與對(duì)照組比較，模型組有顯著性差異(P=0.001)，ECS組無(wú)顯著性差異(P=0.10)；與模型組，ECS組有顯著性差異(P=0.011)。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明對(duì)照組與模型組小鼠菌群存在顯著差異，而給予ESC后，小鼠菌群逐漸恢復(fù)正常。見(jiàn)表1。

表1 Anosim分析結(jié)果

3.8 LEfSe分析LEfSe(LDA Effect Size)分析方法可用于多組(或內(nèi)部亞組)比較，設(shè)定LDA得分值>3找到組間豐富度存在顯著差異的物種。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組的差異性物種主要集中在屬水平，分別為羅斯氏菌(Roseburia)、糞球菌-1(Coprococcus_1)、產(chǎn)醋菌屬(Acetatifactor)；ECS組差異性物種涉及綱、目、科、屬四個(gè)水平，其中起重要作用的前四個(gè)微生物類群分別是：擬桿菌目S24-7(Bacteroidales_S24-7_group)、普雷沃菌屬(Prevotella)、Odoribacter屬、放線菌門(mén)(Actinobacteria)；與模型組相比，ECS組差異性物種涉及門(mén)、綱、目、科、屬五個(gè)水平，其中起重要作用的前四個(gè)微生物類群分別是：擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、擬桿菌目(Bacteroidales)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceac)、普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)。見(jiàn)圖10。

圖10 LEfSe分析

4 討論

研究表明，腸道微生物的多樣性和豐富性與“腸-腦軸”引發(fā)的退行性疾病密切相關(guān)[11-13]。從AD患者體內(nèi)獲得的糞便菌群移植到嚙齒類動(dòng)物身上，會(huì)引起AD相關(guān)癥狀，并伴有海馬杏仁核和齒狀顆粒層的神經(jīng)化學(xué)變化[14-16]。使用恩諾沙星對(duì)正常小鼠治療7天后，小鼠表現(xiàn)出空間記憶缺失等AD相關(guān)癥狀，可能與恩諾沙星誘導(dǎo)微生物組成的改變有關(guān)[17]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AD疾病與大鼠腸道微生物多樣性和豐富度的變化以及促炎性細(xì)胞因子的增加有關(guān)[18-20]。上述研究表明，腸道菌群的異常可能是AD發(fā)病的重要因素之一，從調(diào)節(jié)腸道菌群的角度治療AD或改善其癥狀將成為一種新的策略。中醫(yī)認(rèn)為，“腎精不足，腦髓漸空”正是 AD 的發(fā)病機(jī)理，因此常選用補(bǔ)腎益精之藥來(lái)治療與 AD 相似的癥狀，如記憶力減退，理解能力降低、情緒低落等[21-22]。本研究選用的補(bǔ)腎益精中藥鎖陽(yáng)，其主要成分為黃酮類化合物，已被證明具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[23-24]。

目前針對(duì)AD并沒(méi)有較好的造模方法[25-26]，本研究選取帶有5個(gè)家族性突變基因的5xFAD小鼠，從根本上解決其他AD模型小鼠可能會(huì)出現(xiàn)的個(gè)體差異現(xiàn)象或模型不成功的問(wèn)題。本研究采用水迷宮檢測(cè)小鼠的空間定位能力，結(jié)果易受視覺(jué)、運(yùn)動(dòng)能力及光線的影響[27]，測(cè)試需要在嚴(yán)苛特定的條件下進(jìn)行。小鼠行為學(xué)結(jié)果顯示，ECS可顯著增加5xFAD小鼠的學(xué)習(xí)能力、空間記憶能力與記憶存留時(shí)間。腸道菌群結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，5xFAD小鼠糞便菌群群落豐富度顯著下降，門(mén)水平上，擬桿菌門(mén)豐度下降，厚壁菌門(mén)豐度上升；目水平上，擬桿菌目的豐度顯著降低，而梭菌目的豐度顯著升高；屬水平上，擬桿菌目S24-7及普雷沃氏菌科UCG-001豐度顯著下降，毛螺菌科NK4A136豐度顯著上升，而有益菌瘤胃菌科UCG-014及Alloprevotella豐度有下降趨勢(shì)。給藥ECS后，模型組菌群群落豐富度明顯改善，其中Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、物種注釋分析等結(jié)果均保持一致。臨床研究結(jié)果表明，AD患者的微生物物種豐度呈現(xiàn)擬桿菌門(mén)減少，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)富集的現(xiàn)象，這與本研究結(jié)果一致[28-30]。

綜上所述，ECS可顯著改善AD模型小鼠的空間記憶與學(xué)習(xí)能力，調(diào)節(jié)糞便菌群紊亂。