王建君　余清平　郭丹　廖君　彭驊

〔摘要〕 目的 觀察大鼠原代神經(jīng)元氧糖剝奪損傷后，腦泰方通過調節(jié)二價金屬離子轉運體1（divalent metal transporter 1，DMT1）、轉鐵蛋白受體（transferrin receptor， TfR）、鐵調素（hepcidin， Hep）及膜鐵轉運蛋白（ferroportin， FPN）表達變化，探討腦泰方對氧糖剝奪損傷神經(jīng)元保護機制。方法 將原代培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元隨機分為對照（CG）組、氧糖剝奪模型（OGD）組、腦泰方干預氧糖剝奪模型（NTF）組。MTT法檢測各組神經(jīng)元細胞存活率;熒光探針檢測各組神經(jīng)元細胞內二價鐵離子（Fe）、活性氧（reactive oxygen species， ROS）濃度;Western blot法檢測各組神經(jīng)元細胞Hep、DMT1、TfR、FPN蛋白表達。結果 與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細胞存活率均明顯降低（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細胞存活率明顯升高（P<0.01）。與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細胞內Fe、ROS濃度均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細胞內Fe、ROS濃度均顯著降低（P<0.01）。與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細胞Hep表達均明顯降低（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細胞Hep表達明顯升高（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達均明顯降低（P<0.01，P<0.05）。結論 腦泰方通過促進神經(jīng)元細胞Hep的表達，抑制神經(jīng)元細胞DMT1、TfR、FPN表達，減少氧糖剝奪損傷后神經(jīng)元細胞內Fe及ROS聚積，起到保護神經(jīng)元，減輕氧糖剝奪損傷的作用。

〔關鍵詞〕 腦泰方;腦缺血;鐵調素;二價金屬離子轉運體1;轉鐵蛋白受體;膜鐵轉運蛋白;氧糖剝奪;神經(jīng)元

〔中圖分類號〕R255.2? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.005

Mechanism of Naotaifang intervention on oxygen-glucose deprivation injury of neurons based on hepcidin regulating iron metabolism related proteins

WANG Jianjun YU Qingping GUO Dan LIAO Jun PENG Hua

（1. Medical School of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Changsha Health Vocational College， Changsha， Hunan 410100， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the protective mechanism of Naotaifang on neurons by observing the expression changes of divalent metal transporter 1 （DMT1）， transferrin receptor （TfR）， hecpidin （Hep） and membrane iron transporter ferroportin （FPN） after oxygen-glucose deprivation injury in primary neuronal. Methods The rat neurons were maturely cultured and then randomly divided into the control （CG） group， the oxygen-glucose deprivation model （OGD） group and Naotaifang interventing the oxygen-glucose deprivation （NTF） group. Cell viability was measured by MTT assay in each group. The intracellular concentration

of ferrous iron （Fe） and reactive oxygen species （ROS） in neurons of each group were detected by fluorescent probe. The expression of Hep， DMT1， TfR， FPN were analyzed by Western blot. Results Compared with the CG group， the survival rate of neurons in OGD group and NTF group was significantly lower （P<0.01）; compared with OGD group， the survival rate of neurons in NTF group was significantly higher （P<0.01）. Compared with CG group， the concentrations of Fe and ROS in neurons of OGD group and NTF group were significantly increased （P<0.01）; compared with OGD group， the concentrations of Feand ROS in neurons of NTF group were significantly decreased （P<0.01）. Compared with CG group， the expression levels of Hep in neurons of OGD group and NTF group were significantly decreased （P<0.01）， while the expression levels of DMT1， TfR and FPN were significantly increased （P<0.01）; compared with OGD group， the expression of Hep in neurons of NTF group was significantly increased （P<0.01）， while the expression levels of DMT1， TfR and FPN were significantly decreased （P<0.01， P<0.05）. Conclusion Naotaifang can protect neurons and reduce damage of oxygen-glucose deprivation injury by increasing the expression of Hep， inhibiting the expression of DMT1，TfR and FPN， reducing the accumulation of Fe and ROS in neurons after oxygen-glucose deprivation injury.

〔Keywords〕 Naotaifang; cerebral ischemia; hepcidin; divalent metal transporter 1; transferrin receptor; ferroportin; oxygen-glucose deprivation; neuron

缺血性腦卒中是人類三大死因之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點，嚴重危害人類健康，加重社會負擔[1]。缺血性腦卒中損傷病理機制主要包括神經(jīng)炎癥、氧化應激、興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載等[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)鐵代謝包括細胞內外二價鐵離子（Fe）攝取、儲存與外排，而鐵代謝紊亂是腦缺血損傷的重要病理機制[3]。鐵是人體必需的微量元素，參與線粒體呼吸鏈的電子傳遞、神經(jīng)纖維髓鞘及神經(jīng)遞質合成，對維持大腦正常生理功能起著至關重要的作用[4-5]。Fe也是一種催化劑，在缺氧狀況下，能顯著增加活性氧（reactive oxygen species， ROS）的濃度，導致脂質過氧化和氧化應激，最終引發(fā)線粒體功能紊亂、神經(jīng)元壞死[6-7]。因此，維持鐵穩(wěn)態(tài)是保證神經(jīng)元正常新陳代謝的重要因素。鐵調素（hepcidin， Hep）是肝細胞分泌產(chǎn)生的肽類物質，由25個氨基酸長鏈組成，是機體內鐵代謝的關鍵調節(jié)分子[8-9]。Hep與膜鐵轉運蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）結合，誘導其內化、降解，抑制細胞內鐵的釋放，通過負反饋調節(jié)，Hep-FPN軸可維持全身鐵穩(wěn)態(tài)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，Hep也可通過抑制神經(jīng)元鐵代謝相關蛋白二價金屬離子轉運體1（divalent metal transporter 1， DMT1）、轉鐵蛋白受體（transferrin receptor， TfR）的表達，減少鐵聚積[11]。探索缺血性腦卒中后鐵代謝失調的病理機制，及通過干預Hep調節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)研究，可提供腦缺血損傷防治的潛在治療靶點。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)學“中風”范疇，中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中多采用“益氣活血，祛瘀通絡”的治則[12-13]。腦泰方是本課題組多年應用于臨床治療缺血性腦卒中的有效方劑，具有益氣活血，祛瘀通絡的功效[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，腦泰方可通過干預脂質代謝抑制鐵死亡，改善腦缺血后神經(jīng)元損傷[15-16]。因此，開展腦缺血后Hep調節(jié)神經(jīng)元鐵代謝機制研究，為腦泰方臨床應用提供重要實驗依據(jù)，為中醫(yī)藥防治缺血性腦卒中機制的研究拓寬新的方向。

1 材料

1.1? 細胞及分組

大鼠原代神經(jīng)元細胞用加B27的Neurobasal基礎培養(yǎng)基，在37 ℃含5% CO的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將神經(jīng)元細胞隨機分為對照（CG）組、氧糖剝奪模型（OGD）組、腦泰方干預氧糖剝奪模型（NTF）組。

1.2? 實驗動物

SPF級SD大鼠3只，體質量250～280 g，8周齡，16～18 d孕鼠1只，1 d新生鼠10只，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SYXK（湘）2019-0009。實驗倫理審批號：LL20207160002，符合SPF級實驗動物標準。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，實驗前適應性飼養(yǎng)1周。

1.3? 藥物、主要試劑和儀器

腦泰方組成：黃芪40 g，地龍15 g，僵蠶15 g，川芎10 g，中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（批號分別為CK21070602、2021031902、HH21051802、TH21063004）。

DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS、青鏈霉素、胰酶、胎牛血清均購自美國Hyclone公司（批號分別為SH30023、SH30070、SV30010、SH30042、SH30070）;PBS（南京生興生物技術有限公司，批號：SN331）;Neurobasal培養(yǎng)基、B27、Glutamine均購自美國Gibco公司（批號分別為21103049、17504044、25030081）;DMSO、Protease inhibitor cocktail均購自美國Sigma公司（批號分別為C6295、P8340）;MTT、HRP抗小鼠抗體、HRP抗兔抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司（批號分別為C0009S、A0216、A0208、P0010）;ROS試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號：E004-1-1）;30%聚丙烯酰胺、Tris-base、過硫酸銨、甘氨酸、SDS、Tween-20、蛋白marker、脫脂奶粉均購自北京Solarbio科技有限公司（批號分別為A1010、T8060、A1030、G8200、S8010、T8220、PR1910、D8340）;PVDF膜（美國Millipore公司，批號：ISEQ00010）;ECL發(fā)光液（上海天能科技有限公司，批號：180-5001）;甲醇、鹽酸均購自南京化學試劑股份有限公司（批號分別為C0690110281、C0680110228）;TEMED（美國Alladin公司，批號：T105496）;DMT1（美國Proteintech公司，批號：20507-1-AP）;TfR、FPN、Hep均購自美國Abcam公司（批號分別為ab269513、ab235166、ab30760）;GAPDH（美國Abbkine公司，批號：A01020）。

CO培養(yǎng)箱、酶標儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司（型號分別為3131、Multiskan 51119000）、MetalloFluor FeRhonox-1 Fe（Ⅱ）活細胞成像探針（日本Goryo Chemical公司，型號：GC901）;熒光顯微鏡（日本Nikon儀器有限公司，型號：Ts2R）;離心機（常州金壇區(qū)西城新瑞儀器廠，型號：80-2）。

2 方法

2.1? 原代神經(jīng)元培養(yǎng)[17]

打開水浴，預熱培養(yǎng)液，消毒操作區(qū)，滅菌解剖器械。在每個60 mm的培養(yǎng)基中加入4 mL DMEM/F12培養(yǎng)基，1個100 mm的培養(yǎng)皿中加入15 mL DMEM/F12培養(yǎng)基，一個15 mL離心管中加入13 mL DMEM/F12培養(yǎng)基（均放置在冰上）。處死16～18 d孕鼠，然后取出胎鼠腦，并將取出來的腦放到1個裝有培養(yǎng)基的60 mm皿中，在解剖鏡下去除腦膜，把干凈的大腦皮質放在1個60 mm皿中，使用滅菌的眼科剪將組織剪15 min。加入5 mL 0.125%胰酶，震蕩混勻，放入37 ℃水浴中15 min（每3～4 min輕輕上下顛倒離心管，使消化均勻）。加入DMEM/F12培養(yǎng)基中和胰酶作用，過細胞篩，1000 r/min，離心半徑33.6 cm，離心5 min。移除上清液，加入5 mL

DMEM/F12培養(yǎng)基，清洗兩次。吹打10～15次，靜置片刻收集上清液，小心取出細胞懸液，移至15 mL離心管中，收集細胞懸液到15 mL離心管，1000 r/min，離心半徑33.6 cm，離心5 min。細胞計數(shù)之后，種植到6孔板和24孔板中。4 h后去除培養(yǎng)基加入維持培養(yǎng)基（含Neurobasal培養(yǎng)基、B27、Glutamine及PBS），每隔3 d半量換液。大鼠原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)光學顯微鏡結果顯示：可見高度分化的神經(jīng)元細胞，細胞核大而圓，細胞質內含尼氏小體，細胞突起豐富。見圖1。

2.2? 含藥血清的制備

將中藥放入水中浸泡2 h，煮沸后微火煎煮30 min，過濾留湯汁，藥渣加3倍量的水再煎煮20 min，將湯汁混合后在水浴鍋中濃縮至生藥量5 g/mL，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^HPLC和HRMS分別對腦泰方含藥血清中的3個代表性化合物和4個有效成分進行了驗證，主要化合物為鹽酸川芎嗪2.07 μg/mL、阿魏酸286.96 μg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷176.23 μg/mL[18]。取3只成年雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后制備腦泰方含藥血清，按體表面積換算，2倍劑量灌胃給予大鼠（生藥量28.8 g/kg）[19]，每天1次，連續(xù)7 d，于末次給藥后1 h無菌條件下行頸總動脈取血，分離血清，0.22 μm過濾滅菌后置于-80 ℃冰箱留存?zhèn)溆谩?/p>

2.3? 氧糖剝奪模型造模方法[20]

原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)成熟后，一部分接種在96孔板中，每孔3×10個，另一部分接種在3.5 cm玻璃底培養(yǎng)皿中，每孔1×10個。根據(jù)分組將培養(yǎng)基去除，加入opti-MEM培養(yǎng)基，放入含1% O的培養(yǎng)箱中4 h后，除去opti-MEM培養(yǎng)基，更換為基礎培養(yǎng)基，NTF組在缺氧后加入10%的含藥血清，共同放入常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.4? MTT法檢測神經(jīng)元細胞存活率

在96孔板內加入MTT，再培養(yǎng)3 h，去除孔內液體，每孔加入150 μL DMSO，搖晃均勻，用酶標儀在570 nm波長測定光密度（optical density， OD）值，計算公式為：神經(jīng)元細胞存活率=（OGD或NTF組OD值-空白孔平均OD值）/（CG組OD值-空白孔平均OD值）×100%，實驗中空白孔OD值分別為0.045、0.046、0.046、0.051、0.049、0.047，求出平均值后分析結果。

2.5? 各組神經(jīng)元細胞內Fe濃度測定

使用FeRhoNoxTM-1評估神經(jīng)元細胞內Fe濃度。FeRhoNoxTM-1是一種可激活的熒光探針，通過橙色（紅色）熒光特異性檢測不穩(wěn)定的Fe2+離子在神經(jīng)元細胞內的濃度。將3.5 cm玻璃底培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基去除，加入預冷的PBS輕輕洗滌2次，隨后加入5 μmol/L Fe檢測試劑混勻后，放入37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。去除培養(yǎng)基，加入預冷的PBS洗3次，在熒光顯微鏡下拍照，使用Image J軟件進行掃描，計算公式為：平均熒光OD值=該區(qū)域熒光OD值總和/該區(qū)域面積，得出數(shù)據(jù)后分析結果。

2.6? 各組神經(jīng)元細胞內ROS濃度測定

用DCFH-DA探針測定細胞濃度。將3.5 cm玻璃底培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基去除，加入預冷的PBS輕輕洗滌2次，加入基礎培養(yǎng)基1 mL，再加入1 μL ROS試劑，放入37 ℃含5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。去除培養(yǎng)基，加入預冷的PBS洗3次，在熒光顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析檢測熒光OD值，計算公式為：平均熒光OD值=該區(qū)域熒光OD值總和/該區(qū)域面積，得出數(shù)據(jù)后分析結論。

2.7? Western blot測定神經(jīng)元細胞鐵代謝相關蛋白的表達

提取30 mg細胞組織，提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白量，確定最終上樣量為30 μg，取出上樣樣品至0.5 mL離心管中，加入5倍濃度的SDS并稀釋至1倍濃度，于沸水中煮5 min使蛋白變性。電泳，轉膜，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉，將一抗用含1% BSA的TBST溶液稀釋（稀釋比例為TfR 1∶1000、DMT1 1∶1000、FPN 1∶2000、Hep 1∶1000、GAPDH 1∶5000），于4 ℃孵育過夜，將二抗用TBST按照1∶5000稀釋，室溫下孵育2 h后，TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min，用Tanon

5200化學發(fā)光成像儀下拍照，得出數(shù)據(jù)，進行數(shù)據(jù)分析。

2.8? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以“x±s”表示，均服從正態(tài)分布且各組間方差齊，采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 各組神經(jīng)元細胞存活率比較

與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細胞存活率均明顯降低（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細胞存活率明顯升高（P<0.01）。見圖2。

3.2? 各組神經(jīng)元細胞內Fe濃度比較

與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細胞內Fe2+濃度均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組神經(jīng)元細胞內Fe濃度明顯降低（P<0.01）。見圖3。

3.3? 各組神經(jīng)元細胞內ROS濃度比較

與CG組比較，OGD組、NTF組神經(jīng)元細胞內ROS濃度均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組細胞內ROS濃度明顯降低（P<0.01）。見圖4。

3.4? 各組神經(jīng)元細胞鐵代謝相關蛋白比較

與CG組比較，OGD組神經(jīng)元細胞Hep表達明顯降低（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達均明顯升高（P<0.01）;與OGD組比較，NTF組Hep表達明顯升高（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見圖5。

4 討論

Fe2+是人體內不可或缺的微量元素之一，參與呼吸鏈電子傳遞、神經(jīng)纖維髓鞘及神經(jīng)遞質的合成[21]。在細胞質和溶酶體、線粒體等細胞器中存在不穩(wěn)定鐵池，過量游離鐵通過芬頓反應生成大量ROS，造成細胞壞死、凋亡[22-23]。近年來研究表明，鐵超載及氧化應激誘導線粒體損傷也是腦缺血損傷的病理機制之一[24-25]。觀察大腦中動脈閉塞大鼠模型術后及腦梗死患者，發(fā)現(xiàn)Fe攝入增多，加重缺血區(qū)氧化應激、興奮性毒性及炎癥反應，腦梗死體積明顯增加[26-27]。高鐵飲食小鼠在腦原位血栓栓塞后，缺血再灌注損傷較假手術組嚴重[28-29]。而減少鐵聚集，維持神經(jīng)元Fe穩(wěn)態(tài)可減少ROS產(chǎn)生，緩解腦缺血及繼發(fā)性損傷[3]。因此，抑制腦缺血后神經(jīng)元內鐵聚集，減少ROS的生成，對腦缺血損傷的治療及預后具有重要意義。

關于細胞內外Fe轉運，本課題組提出了如下工作模式，即“兩個中心，3個體系，網(wǎng)絡調控”：以Hep及胞漿鐵調節(jié)蛋白的調節(jié)為中心，細胞內鐵的攝取、儲存與外排是通過鐵轉運輸入蛋白、胞內鐵儲存蛋白、鐵轉運輸出蛋白3個體系完成;3個體系通過復雜的信號途徑對鐵進出細胞進行網(wǎng)絡調控[30]。

Hep是調節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的關鍵蛋白，調控鐵的吸收、儲存和釋放，由肝細胞分泌產(chǎn)生，其生物活性主要由25個氨基酸多肽決定[31]。Hep與FPN結合，內化、降解FPN，Hep-FPN軸通過負反饋調節(jié)維持鐵穩(wěn)態(tài)[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Hep可通過蛋白酶內化、降解細胞膜的DMT1，從而抑制鐵吸收，減少細胞鐵聚積[32]。Hep作用機制與細胞類型有關，巨噬細胞中的Hep結合和降解FPN，而腸上皮細胞中的Hecpidin通過抑制DMT1調節(jié)鐵代謝[33]。Hep及鐵相關轉運蛋白（DMT1、TfR、FPN）均廣泛分布于大腦各區(qū)域[34]。阿爾茨海默病中Hep通過負反饋調節(jié)FPN導致鐵聚集神經(jīng)元損傷[35]。研究發(fā)現(xiàn)Hep能顯著抑制神經(jīng)元及星形膠質細胞中DMT1、TfR、FPN的表達[36];鐵調節(jié)“旁路模式”中，Hep抑制DMT1、TfR表達，游離Fe通過血腦屏障表達的FPN輸出，從而緩解鐵沉積[37]。因此，腦缺血后Hep調節(jié)神經(jīng)元鐵相關轉運蛋白DMT1、TfR、FPN作用機制值得探討。

中醫(yī)學認為，中風的病理性質多屬“本虛標實”，氣血虛衰為本，風、火、痰、氣、瘀為標，故中醫(yī)藥治療多遵循“活血祛瘀、祛風通絡”的治則，標本兼治[13]。腦泰方由中藥黃芪、川芎、地龍、僵蠶4味藥組成，黃芪為君藥，其力專，周行全身，大補脾胃元氣，氣旺則血活，血活則瘀除，以治其本;地龍性寒、味咸，具有息風通絡之功效;僵蠶味辛、咸，性平，兩者合用共奏通經(jīng)活絡、祛風化痰之功效，均為臣藥;川芎活血行氣，氣行則血行，為“血中之氣藥”，具有引藥上行之功效，是為佐藥，4味藥配合共奏益氣活血、祛瘀通絡、標本兼治之效[38]。前期研究發(fā)現(xiàn)，腦泰方通過調節(jié)大鼠神經(jīng)元鐵相關轉運蛋白（TfR、FPN等）的表達，抑制鐵的細胞內轉運，促進鐵外排，起到保護神經(jīng)元的作用[39-40]。本實驗通過原代培養(yǎng)神經(jīng)元，氧糖剝奪損傷后Fe2+聚集、ROS生成明顯增多（P<0.01），神經(jīng)元細胞存活率明顯降低（P<0.01）;腦泰方干預可明顯減少Fe聚集、減少ROS生成（P<0.01），明顯升高神經(jīng)元細胞存活率（P<0.01）。氧糖剝奪后Hep表達明顯降低（P<0.01），同時DMT1、TfR、FPN表達均明顯升高（P<0.01）;腦泰方干預后Hep表達明顯升高（P<0.01），DMT1、TfR、FPN表達均明顯減少（P<0.01，P<0.05）。由此，推測神經(jīng)元缺氧缺糖培養(yǎng)后，腦泰方通過促進Hep生成，降解鐵相關輸入蛋白DMT1、TfR，從而抑制鐵聚集，減少ROS生成，起到保護神經(jīng)元的作用。

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