吳凱　陳立浩　時健　劉倩宏　姚小磊

〔摘要〕 目的 研究青光安顆粒劑（以下簡稱為青光安）對自發(fā)性青光眼模型DBA/2J小鼠視神經(jīng)中自噬途徑相關(guān)蛋白表達的影響。方法 將10只C57BL/6J小鼠作為空白組;采用隨機數(shù)字法將30只DBA/2J小鼠分為模型組、低劑量組、高劑量組，每組10只。喂養(yǎng)小鼠至38周齡，期間觀測小鼠眼壓，待DBA/2J小鼠自動成模后開始灌胃。模型組每日以生理鹽水灌胃;低劑量組、高劑量組分別灌胃青光安20.75、103.75 g/kg，每日1次。各組小鼠均以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。灌胃15 d后取右眼視神經(jīng)。各組采用 Western blot法檢測微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3， LC3）、溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1， LAMP1）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase， Caspase-3）、細胞色素C（cytochrome C， CytC）蛋白表達，采用RT-PCR法檢測E3泛素連接酶（Parkin）、LAMP1、Caspase-3 mRNA的表達。結(jié)果 小鼠喂養(yǎng)至38周齡后，DBA/2J小鼠眼壓上升，造模成功。與空白組相比，模型組LAMP1、Caspase-3、CytC、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達升高，Parkin、LAMP1、Caspase-3 mRNA表達升高（P<0.05）。與模型組相比，低劑量組LAMP1、CytC、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達降低（P<0.05），LAMP1、Caspase-3 mRNA表達降低（P<0.05）;高劑量組LAMP1、Caspase-3、CytC、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達降低，Parkin、LAMP1、Caspase-3 mRNA表達降低（P<0.05）。與低劑量組相比，高劑量組Parkin、Caspase-3、LAMP1 mRNA表達水平降低（P<0.05）。結(jié)論 青光安可通過調(diào)控青光眼小鼠視神經(jīng)中Parkin、LAMP1、LC3、Caspase-3、CytC的表達，使得線粒體自噬過程完整進行，對視神經(jīng)具有保護作用。

〔關(guān)鍵詞〕 青光安顆粒劑;青光眼;線粒體自噬;視神經(jīng);DBA/2J小鼠

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.004

Effect of Qingguang'an Granule on the expression of mitophagy pathway

related proteins in optic nerve of DBA/2J mice

WU Kai CHEN Lihao SHI Jian LIU Qianhong YAO Xiaolei

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of

TCM Prevention and Treatment of Eye， Ear， Nose and Throat Diseases， Changsha， Hunan 410208， China; 4 Hebei Eye

Hospital， Xingtai， Hebei 054000， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Qingguang'an Granule on the expression of mitophagy pathway related proteins in the optic nerve of DBA/2J mice with spontaneous glaucoma. Methods Ten C57BL/6J mice were used as blank group. Thirty DBA/2J mice were randomly divided into model group， low-dose group and high-dose group， with 10 mice in each group by random number method. Mice were fed to 38 weeks of age， and intraocular pressure was observed during this period. After automatic modeling of DBA/2J mice， the mice were given intragastric administration. The model group was given normal saline intragastric administration every day. Qingguang'an Granule were gavaged at 20.75 g/kg and 103.75 g/kg in the low-dose group and high-dose group， once a day， respectively. Mice in each group were fed with conventional diet. The optic nerve of the right eye was removed 15 days after gavage. The protein expression levels of microtubuleassociated protein light chain 3 （LC3）， lysosome-associated membrane protein 1 （LAMP1）， cysteinyl aspartate specific proteinase （Caspase-3） and cytochrome C （CytC） in each group were detected by Western blot， and the expression levels of E3 ubiquitin ligase （Parkin）， LAMP1 and Caspase-3 mRNA were detected by RT-PCR. Results After the mice were fed to 38 weeks of age， the intraocular pressure of DBA/2J mice increased， and the modeling was successful. Compared with blank group， protein expression levels of LAMP1， Caspase-3， CytC， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and expression levels of Parkin， LAMP1 and Caspase-3 mRNA were increased in model group （P<0.05）. Compared with model group， the protein expression levels of LAMP1， CytC and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ were decreased in low-dose group （P<0.05）， and the expression levels of LAMP1 and Caspase-3 mRNA were decreased in low-dose group （P<0.05）. The protein expression levels of LAMP1， Caspase-3， CytC， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Parkin， LAMP1 and Caspase-3 mRNA were decreased in the high-dose group （P<0.05）. Compared with the low-dose group， the expression levels of Parkin， Caspase-3 and LAMP1 mRNA in the high-dose group were decreased （P<0.05）. Conclusion By regulating the expression of Parkin， LAMP1， LC3， Caspase-3 and CytC in the optic nerve of glaucoma mice， Qingguang'an Granule can make the mitochondrial autophagy process complete and has protective effect on the optic nerve.

〔Keywords〕 Qingguang'an Granule; glaucoma; mitophagy; optic nerve; DBA/2J mice

青光眼是一種以眼壓增高、典型的視野改變?yōu)榕R床表現(xiàn)，以視神經(jīng)不可逆損害、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells， RGCs）丟失為主要病理改變的一類遺傳異質(zhì)性眼病，致盲率位居不可逆致盲性眼病之首[1]，是一直以來眼科研究的重點疾病。RGCs的凋亡是青光眼致盲的主要原因[2]，視神經(jīng)與RGCs的保護是青光眼的最終治療目標(biāo)。由于RGCs是高度分化完全的細胞，再生十分困難，目前主要有神經(jīng)生長因子注射和干細胞移植兩種方法。然而神經(jīng)生長因子注射費用高且療效有限，干細胞移植還處于初級探索階段，所以視神經(jīng)與RGCs的保護方法十分局限。中醫(yī)學(xué)有巨大的藥物資源，尋找能夠保護視神經(jīng)與RGCs的中藥是當(dāng)下亟待解決的問題。青光眼的主要病機為血瘀水停[3]，治以益氣活血利水，據(jù)此，青光安顆粒劑（以下簡稱青光安）應(yīng)運而生，由黃芪、茯苓、白術(shù)、赤芍、生地黃、地龍、紅花、車前子組成，黃芪、白術(shù)益氣利水，生地黃養(yǎng)血滋陰，地龍、紅花、赤芍活血化瘀，茯苓、車前子利水明目，全方補瀉兼施，共奏益氣補血、活血利水之功。前期研究發(fā)現(xiàn)，青光安能夠保護青光眼模型RGCs的形態(tài)，減少RGCs的凋亡[4]，其療效在臨床上也得到有效驗證[5]。RGCs的凋亡與線粒體自噬異常的關(guān)系十分密切，當(dāng)線粒體自噬過程不能完整執(zhí)行，造成自噬小體的堆積時，可導(dǎo)致線粒體中的細胞色素C（cytochrome C， CytC）釋放，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase， Caspase-3），誘導(dǎo)RGCs的凋亡[6]，因此，線粒體自噬有利也有弊[7]，線粒體自噬保護RGCs的關(guān)鍵在于是否形成完整的線粒體自噬。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，很少見中藥復(fù)方通過調(diào)控線粒體自噬治療青光眼的相關(guān)報道，應(yīng)大量展開關(guān)于藥物成分、單味中藥、中藥復(fù)方調(diào)節(jié)線粒體自噬治療青光眼的研究，為中醫(yī)藥治療青光眼提供依據(jù)。本實驗通過檢測E3泛素連接酶（Parkin）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3， LC3）、溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1， LAMP1）、Caspase-3、CytC的表達，研究青光安保護視神經(jīng)是否通過調(diào)控線粒體自噬途徑而介導(dǎo)，闡明青光安治療青光眼的機制，為中醫(yī)藥治療青光眼提供理論依據(jù)及技術(shù)借鑒。

1 材料

1.1? 動物

C57BL/6J小鼠10只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，2月齡，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號：1107271911002463;DBA/2J小鼠30只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，56～76日齡，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號：1100111911055898。動物實驗倫理合格證號：LL2019100802，實驗地：中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室。

1.2? 藥物

青光安組成（均為顆粒）：黃芪30 g、茯苓20 g、白術(shù)10 g、赤芍10 g、生地黃10 g、地龍10 g、紅花5 g、車前子20 g（均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院），根據(jù)小鼠每天的用藥劑量分袋密封包裝，室溫條件下儲存在陰涼干燥處，灌胃前加入適量水溶解并加熱。

1.3? 主要試劑與儀器

RIPA細胞裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：C1053）;二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（批號：CW0014S）、超純RNA提取試劑盒（批號：CW0581M）均購自康為世紀生物科技股份有限公司;牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）（北京索萊寶科技有限公司，批號：A8020）;兔抗LC3B抗體[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號：ab51520];兔抗CytC抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10993-1-ap）;兔抗Caspase-3抗體（美國Immunoway公司，批號：YT0656）;兔抗LAMP1抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：df7033）;二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZB-2301）。

低溫高速離心機（德國Eppendorf公司，型號：5424R）;全自動酶標(biāo)儀（型號：WD-2102B）、蛋白垂直電泳儀（型號：DYY-6C）均購自北京市六一儀器廠;恒溫搖床（上海領(lǐng)成生物科技有限公司，型號：TC-100B）;熒光PCR儀（型號：CFX ConnectTM）、超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：ChemiDocTM XRS+）均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司;全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：Tiss-12）;筆式眼壓計（美國Reichert公司，型號：Tono-pen AVIA）。

2 方法

2.1? 動物模型的建立

本實驗青光眼動物模型的建立采用轉(zhuǎn)基因小鼠[8]，DBA/2J小鼠8～9月齡出現(xiàn)RGCs凋亡和視神經(jīng)變性，18月齡出現(xiàn)90%以上視神經(jīng)變性，視功能幾乎全部喪失，為近年來基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的年齡相關(guān)性、進展性自發(fā)性高眼壓實驗動物模型。本實驗喂養(yǎng)DBA/2J小鼠至38周齡自動成模。在此期間動態(tài)觀察小鼠眼壓變化，將小鼠眼球表面麻醉后，使用Tono-pen筆式眼壓計輕觸小鼠眼球，連續(xù)輕觸10次讀取眼壓值，從第10周開始，每4周測1次，待DBA/2J小鼠眼壓升高以及趨于穩(wěn)定后停測。

2.2? 分組

將10只C57BL/6J小鼠作為空白組。采用隨機數(shù)字法將30只DBA/2J小鼠分為3組，其中一組為模型組，另外兩組根據(jù)“人-動物體表面積等效劑量比值表”計算灌胃劑量，分為低劑量組、高劑量組，每組10只。

2.3? 給藥方法

模型組每日以生理鹽水 0.9 mL灌胃，每日1次;低劑量組將115 g青光安溶于250 mL生理鹽水中灌胃，每日1次，每次0.9 mL;高劑量組將115 g青光安溶于50 mL生理鹽水中灌胃，每日1次，每次0.9 mL，計算出低劑量組、高劑量組的灌胃劑量分別為20.75、103.75 g/kg，各組小鼠均以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，共15 d。

2.4? 取材

灌胃15 d后，將各組小鼠行頸椎脫臼處死，處死后迅速取出右眼球至于干冰上，自視乳頭后1 mm向后取3 mm視神經(jīng)，保存并標(biāo)記組別。

2.5? Western blot法檢測Caspase-3、CytC、LAMP1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平

首先提取視神經(jīng)組織蛋白。用液氮對研磨器具降溫后用鑷子將組織樣品取出，剪取50 mg樣品置于離心管內(nèi)，加入1 mL的裂解液，采用研磨儀充分研磨。隨后用12 000 r/min高速離心機離心10 min，離心半徑20 cm，離心后取上清液，移至新的EP管，棄沉淀，加入緩沖液，沸水煮5 min后置于-20 ℃保存。稀釋BSA標(biāo)準品，配置BCA工作液，取稀釋好的A-G BSA標(biāo)準品和待測蛋白樣品各5 μL分別加到做好標(biāo)記的試管中，用全自動酶標(biāo)儀測定BSA標(biāo)準品及每個樣品的吸光值，蛋白電泳至曝光，顯影，測定各目標(biāo)蛋白灰度值。

2.6? RT-PCR法檢測Parkin、Caspase-3、LAMP1mRNA表達水平

將組織樣品取出，剪取50 mg樣品置于離心管內(nèi)，加入1 mL的TRlzon試劑。采用研磨儀研磨充分后保存于-20 ℃冰箱，防止被降解。向以上溶液中加入氯仿震蕩，冰盒上放置5 min后離心，離心后樣品分成3層：紅色有機相層、中間層、無色水相層，把水相層轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷1.5 mL RNase-Free離心管中。隨后在得到的水相溶液中加入等體積預(yù)冷的70%乙醇，顛倒混勻。將上述溶液加入到已裝入收集管的吸附柱RM中，離心、棄流出液。然后在冰盒上晾干5 min。將吸附柱裝入到一個新的預(yù)冷1.5 mL RNase-Free離心管中，加入35 μL無RNase的水，充分溶解RNA，靜置3 min后離心。把流出液再加入到吸附柱里面，靜置3 min后再離心。得到的RNA保存在-80 ℃，防止降解，利用紫外分光光度儀計算RNA濃度、純度。然后配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后進行RT-PCR反應(yīng)，檢測過程中用到的引物見表1。

2.7? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布且方差齊者用one-way ANOVA分析，否則采用秩和檢驗，多重比較采用LSD法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 眼壓檢測結(jié)果

10只C57BL/6J小鼠（20眼）在第10周至第38周眼壓波動于10～16 mmHg之間。30只DBA/2J小鼠（60眼）眼壓在第10周到第38周之間逐漸上升。

C57BL/6J小鼠在第10周至第38周眼壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;DBA/2J小鼠在第10周至第38周眼壓上升。相同時間兩種小鼠眼壓比較，從第10周到第38周，DBA/2J小鼠眼壓均高于C57BL/6J小鼠眼壓（P<0.05）。見表2。

3.2 各組Caspase-3、CytC、LAMP1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平比較與空白組相比，模型組Caspase-3、CytC、LAMP1、

LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平均升高（P<0.05）。與模型組相比，低劑量組LAMP1、CytC、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平降低（P<0.05），高劑量組LAMP1、Caspase-3、CytC、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平均降低（P<0.05）。與低劑量組相比，高劑量組Caspase-3、CytC、LAMP1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

3.3? 各組Parkin、Caspase-3、LAMP1 mRNA表達水平比較與空白組相比，模型組Parkin、Caspase-3、LAMP1

mRNA表達水平均升高（P<0.05）。與模型組相比，低劑量組LAMP1、Caspase-3 mRNA表達水平降低（P<0.05），高劑量組Parkin、Caspase-3、LAMP1 mRNA表達水平均降低（P<0.05）。與低劑量組相比，高劑量組Parkin、Caspase-3、LAMP1 mRNA表達水平降低（P<0.05）。見圖2。

4 討論

青光眼屬于中醫(yī)學(xué)“五風(fēng)內(nèi)障”范疇，病因虛、實皆有。脾氣陽虛，不能運化水谷精微，聚而生濕生痰，痰濕流竄于目中脈絡(luò)，阻滯目中玄府，神水運行不暢而滯留于目;肝腎虧虛，目竅失養(yǎng)，神水阻滯[9]。血阻脈絡(luò)，不能上榮于目，目不能視，或阻滯氣機，氣機不能推動神水運行，終發(fā)為本病?！锻馀_秘要·眼疾品類不同候》認為“內(nèi)肝管缺，眼孔不通”可致本病。《證治準繩·雜病·七竅門》認為本病乃“痰濕所致，火郁、憂思、忿怒之過”。故青光眼病機可歸納為“血瘀水停”，治宜益氣活血利水。自噬是細胞在不利環(huán)境下的自我調(diào)控行為，通過自噬，細胞可對廢棄的細胞器或蛋白質(zhì)進行清理，以維持細胞穩(wěn)態(tài)平衡，類似于中醫(yī)理論中“精化氣”和“去瘀生新”的過程。臟腑功能失調(diào)、氣化失司可使痰濁瘀血內(nèi)生，“痰濁”“瘀血”是異常積累的蛋白，這與自噬水平的下降導(dǎo)致蛋白無法降解有關(guān)，印證了自噬的不足與“血瘀水停”密切相關(guān)[10]。

PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬與RGCs的凋亡密切相關(guān)，完整的線粒體自噬途徑能夠及時清理受損的線粒體，維持RGCs穩(wěn)態(tài)。LC3-Ⅰ是自噬體的標(biāo)志分子，隨著自噬體膜的增加而增加，自噬形成時，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)形式的LC3-Ⅱ，可協(xié)助自噬體的形成，自噬體與溶酶體融合后的降解為線粒體自噬必不可少的過程，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可反映線粒體自噬過程是否完整[11-12]。Parkin是線粒體自噬過程中的重要蛋白，平時在細胞溶質(zhì)中保持非活化狀態(tài)。當(dāng)線粒體自噬發(fā)生時，PINK1將募集胞質(zhì)中的Parkin至線粒體外膜以擴大線粒體自噬的信號[13]，因此，Parkin的表達可反映線粒體自噬的數(shù)量。LAMP1主要分布在溶酶體膜及內(nèi)吞體膜，是溶酶體的標(biāo)志物，常用于檢測自噬溶酶體的形成[14]。Caspase-3是線粒體介導(dǎo)的凋亡信號通路的特異標(biāo)記物，可反映細胞凋亡程度[15]。當(dāng)線粒體功能障礙時，PINK1磷酸化并附著在線粒體外膜蛋白質(zhì)上的泛素Ser65位點，向細胞傳遞線粒體功能障礙的信息，靶向募集Parkin至線粒體外膜使線粒體外膜蛋白泛素化[13]。泛素化蛋白被受體蛋白optineurin識別[16]，同時LC3與受體蛋白optineurin結(jié)合，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，

LC3-Ⅱ與自噬體外膜內(nèi)膜相關(guān)聯(lián)[17]，使線粒體被自噬小泡包裹成自噬體，自噬體與溶酶體結(jié)合并在溶酶體中降解，完成完整的PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬過程。當(dāng)自噬體降解受阻而累積時，將對細胞產(chǎn)生毒性作用[18]。除此之外，線粒體自噬本身會使累積的自噬體去極化，膜通透性增加，致使線粒體中CytC釋放[6]，進而激活Caspase-3，導(dǎo)致RGCs凋亡[19]。

在本實驗中，與空白組相比，模型組LAMP1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Caspase-3、CytC的蛋白表達水平均升高，Parkin、LAMP1、Caspase-3的mRNA表達水平均升高，表明青光眼能誘導(dǎo)線粒體自噬增加[20]，導(dǎo)致自噬體隨著線粒體自噬的增加而增加，與此同時，溶酶體也呈上升趨勢，但增加的溶酶體降解能力并不能代償自噬體的堆積速度，過剩的自噬體沒有得到有效的清除而積累在視神經(jīng)，線粒體自噬不能完成全部過程，使得大量CytC從線粒體中釋放，激活Caspase-3，導(dǎo)致視神經(jīng)不可逆損害。與模型組相比，低劑量組、高劑量組LAMP1、CytC、Caspase-3、LC3-Ⅱ/

LC3-Ⅰ蛋白表達水平均降低，提示青光安能降低青光眼小鼠視神經(jīng)中過剩的線粒體自噬，從而減少自噬體的堆積，減少RGCs的凋亡。與低劑量組相比，高劑量組Parkin、LAMP1、Caspase-3 mRNA表達水平均降低，Caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LAMP1、CytC蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示高劑量組線粒體自噬完整程度與低劑量組相似。雖然以上指標(biāo)mRNA表達和蛋白表達結(jié)果并不完全一致，但是整體并未出現(xiàn)相反的趨勢，可能是由于檢測時的誤差引起或者部分小鼠在檢測之前本身就有多余的蛋白儲備，但未行使功能。有研究表明過表達的Parkin蛋白可促進LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ、LAMP1上調(diào)，促進完整的PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬泛素化途徑，有利于抑制RGCs凋亡，對RGCs具有顯著的保護作用[21-22]，在本研究中，雖然低劑量組Parkin mRNA表達多于高劑量組，但Parkin蛋白未能過表達，所以其保護效益不夠顯著。高劑量組細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達與低劑量組也幾乎無差異，因此，低劑量和高劑量青光安對細胞的保護作用近似。

綜上所述，青光安可通過調(diào)控青光眼小鼠視神經(jīng)中Parkin、LAMP1、LC3、Caspase-3、CytC的表達，減少自噬體的堆積，使得線粒體自噬過程完整進行，對視神經(jīng)具有保護作用。

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