覃祥龍 呂婷婷 韋媛菊 柳華英 龐翠英 江 穎 馮 原

(廣西中醫(yī)藥大學1 瑞康臨床醫(yī)學院，2 研究生學院，3 第一臨床醫(yī)學院，南寧市 530001，電子郵箱:1357957218@qq.com；廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院4 神經(jīng)內(nèi)科，5 呼吸內(nèi)科，南寧市 530001)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是起源于支氣管黏膜、腺體和肺泡上皮的一類惡性腫瘤，分為腺癌、鱗狀細胞癌、腺鱗癌等。目前現(xiàn)代醫(yī)學中用于治療NSCLC的方法比較局限，且伴有較大的副作用，而中醫(yī)藥治療NSCLC具有獨特的優(yōu)勢，副作用較西藥治療小。加減補肺化瘀湯由黨參、黃芪等14味中藥組成，具有補氣活血化瘀的功效，主要用于氣虛血瘀型NSCLC的治療[1]。有研究顯示，補肺化瘀湯輔助吉非替尼治療晚期NSCLC，能改善患者免疫系統(tǒng)的功能，降低血清腫瘤標志物水平，臨床療效滿意，藥物安全性高[2-3]；補肺化瘀湯結合順鉑+吉西他濱化療方案治療NSCLC的療效較好，能有效地改善患者的免疫指標和高凝狀態(tài)，穩(wěn)定目標病灶，并減少化療藥物的毒副作用[4-5]。上述研究結果均提示補肺化瘀湯對NSCLC有一定的治療效果，但是目前尚無加減補肺化瘀湯治療NSCLC的作用機制的相關研究。

本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法，從分子水平上闡述加減補肺化瘀湯成分與靶點之間、靶點與NSCLC之間的潛在聯(lián)系，分析藥物成分、靶點、蛋白質和疾病之間的相互作用關系，從而探討加減補肺化瘀湯治療NSCLC的作用機制，為明確加減補肺化瘀湯治療NSCLC的相關機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 加減補肺化瘀湯有效活性成分及其作用靶點的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://tcmspw.com/)搜索并篩選加減補肺化瘀湯中所含中藥(黨參、黃芪、生地黃、紫菀、川芎、赤芍、丹參、前胡、杏仁、莪術、三棱、半枝蓮、白花蛇舌草、甘草)的活性成分，采用胃腸吸收、分布、代謝和排泄效應模型，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18等為限定條件篩選出符合研究標準的有效活性成分。利用TCMSP篩選出加減補肺化瘀湯有效活性成分的作用靶點，使用自學的編程腳本perl將基因名轉換為uniProt ID。

1.2 NSCLC相關靶點的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)檢索關鍵詞“non-small cell lung cancer”，以“Relevance score>2”為篩選條件篩選數(shù)據(jù)庫中NSCLC的相關靶點。

1.3 加減補肺化瘀湯治療NSCLC相關靶點的選取 通過Venny平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，將加減補肺化瘀湯有效活性成分的作用靶點與NSCLC相關靶點進行合并取交集，所獲得的共同靶點即認為是加減補肺化瘀湯治療NSCLC的相關靶點。

1.4 構建PPI網(wǎng)絡并篩選核心靶點 將共同靶點導入STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)，選擇“Multiple Protein”，限定物種為“Homo sapiens”，設定最低要求互動分數(shù)為中度可信度0.400，導出相關的TSV表格，得到蛋白-蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡相關文件。將導出的PPI網(wǎng)絡相關文件中的 Node1、Node2、Combined score值導入Cytoscape 3.6.0軟件，從而可視化PPI網(wǎng)絡，并利用其自帶工具NetworkAnalyzer計算Degree值，選取“Degree>90”的靶點，即為核心靶點。

1.5 構建“有效活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡圖 將得到的核心靶點及與其對應的有效活性成分導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建“有效活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡圖。

1.6 核心靶點的通路富集分析 將1.4步驟選取出的核心靶點導入STRING網(wǎng)站，按照上述步驟獲得核心靶點的PPI網(wǎng)絡圖。同時，將核心靶點上傳到Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/)，然后進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。設定基本參數(shù)，物種為“Homo sapiens”，采用“ORA”算法，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。進階參數(shù)設定中，設定“Significance Level”為P<0.05，余為默認設置。

2 結 果

2.1 加減補肺化瘀湯的有效活性成分及其作用靶點 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，共收集到加減補肺化瘀湯有效活性成分342個和靶點4 084個，去重后得到234個有效活性成分和254個靶點。

2.2 NSCLC的相關靶點 共搜索到NSCLC相關靶點4 908個，以“Relevance score>2”為條件進行篩選得到相關靶點4 789個。

2.3 加減補肺化瘀湯治療NSCLC的相關靶點 將加減補肺化瘀湯有效活性成分的作用靶點與NSCLC的相關靶點取交集后獲得191個共同靶點，見圖1。

圖1 韋恩圖

2.4 加減補肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點 共獲得14個加減補肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點，按照對應的“Degree值”由大到小排序，依次為蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)3、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、JUN、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3)、MYC、MAPK1、MAPK8、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、信號傳導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)，見表1。

表1 加減補肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點

2.5 “有效活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡圖 使用Cytoscape 3.6.0繪制中藥“有效活性成分-核心靶點”網(wǎng)絡圖，結果顯示共有198個節(jié)點和475條邊(見圖2)。

圖2 有效活性成分-核心靶點網(wǎng)絡圖

2.6 核心靶點的PPI網(wǎng)絡圖與GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將14個核心靶點導入STRING網(wǎng)站，制作PPI網(wǎng)絡圖(見圖3)。GO功能富集分析結果顯示，核心靶點富集到16個生物學過程、6種分子功能、3種細胞成分。其中生物學過程主要包括細胞對鎘離子的反應、DNA代謝過程的正調控、DNA結合轉錄因子活性的調節(jié)等；分子功能主要包括一氧化氮合酶調節(jié)活性、MAP激酶活性、轉錄因子結合等；細胞成分主要涉及膜筏、囊泡腔、質膜蛋白復合物，見圖4。KEGG通路富集分析共獲得9條相關通路，其中癌癥相關通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、結直腸癌信號通路等與NSCLC關系最為密切(見圖5)，而癌癥相關通路為富集程度較高的信號通路(見圖6)。

圖3 核心靶點的PPI網(wǎng)絡圖

圖4 GO功能富集分析結果柱狀圖

圖5 KEGG通路富集分析結果柱狀圖

圖6 癌癥相關通路

3 討 論

在中醫(yī)中，NSCLC有氣陰兩虛證、陰虛內(nèi)熱證、脾虛痰濕證、氣血瘀滯證等證型。肺癌早期，邪氣盛且正氣尚足，故病機以邪實為主；肺癌中晚期，機體正氣虛弱，外邪易入里化熱，同時，肺病及脾，脾虛失運，痰濕內(nèi)生，阻礙氣機，可致氣滯、痰濕、血瘀相互膠結，瘀而化熱，進而耗傷氣陰[6]。

加減補肺化瘀湯由黨參、黃芪、生地黃、紫菀、川芎、赤芍、丹參、前胡、杏仁、莪術、三棱、半枝蓮、白花蛇舌草、甘草14味中藥組成，方中黨參補脾益肺，黃芪益氣健脾，生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津、活血化瘀之功效[7]，紫菀具有潤肺下氣、化痰止咳之功效[8]。現(xiàn)代藥理學研究表明，黨參和黃芪均有清除氧自由基、抗氧化、保肝、調節(jié)機體免疫功能等功效[9-10]。有研究顯示，采用加減補肺化瘀湯治療NSCLC的效果確切，可有效地改善患者機體的凝血功能和免疫功能[11-12]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法，探討加減補肺化瘀湯治療NSCLC的機制，共獲得加減補肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點14個，包括AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、EGFR、JUN、CASP3、MYC、MAPK1、MAPK8、EGF、STAT3、PTGS2、ESR1。大部分靶點與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展具有一定的關系。(1)AKT1作為蛋白激酶，與細胞的增殖、生長、凋亡密切相關[13-14]，同時還可促進受體細胞的自噬激活[15]；研究表明，AKT1直接參與微小RNA-99a介導的腫瘤抑制過程[16]，參與微小RNA-5481誘導的NSCLC細胞遷移和侵襲的抑制過程[17]。(2)IL-6是經(jīng)典的炎癥指標，可用于預測NSCLC患者的療效[18]。(3)MAPK3/1信號通路在調控NSCLC細胞間充質特性方面起著關鍵作用，阻斷該信號通路可以提高EGFR抑制劑對NSCLC細胞的干預效果[19]；此外，抑制MAPK1的表達可降低NSCLC細胞對吉非替尼的耐藥性，并阻止細胞的增殖、遷移和侵襲[20-21]。(4)有學者指出，肺腺癌中VEGFA與程序性細胞死亡蛋白1的蛋白和mRNA表達密切相關[22]，且與腫瘤細胞的侵襲和潛在轉移有一定的關聯(lián)[23-24]。(5)攜帶常見的EGFR基因突變可能與NSCLC患者預后不良相關[25]，而抑制EGFR可以顯著降低凋亡前細胞表面CD47的表達，有利于樹突狀細胞有效地吞噬癌細胞[26]，因此EGFR的酪氨酸激酶抑制劑在NSCLC的治療中發(fā)揮著重要的作用[27]。(6)MAPK通路組分當中的c-Jun N端激酶與促進NSCLC細胞增殖和NSCLC進展有關[28]，而生物活性成分重樓皂苷Ⅰ通過調控c-Jun的表達可以抑制NSCLC細胞的生長[29]。(7)上調CASP3的表達可以抑制NSCLC細胞株A549的活力，并誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖[1,30-33]。(8)研究表明，蛋白激酶C-iota 可通過上調c-MYC/葡萄糖轉運蛋白1信號通路而參與NSCLC細胞中糖代謝的葡萄糖積累和糖酵解過程[34]，并阻斷c-MYC介導的自噬功能及BIN1與c-MYC之間的相互作用，從而促進NSCLC的發(fā)展[35-36]；此外，直接下調c-MYC的表達，會使NSCLC細胞增殖[37]。(9)EGF激活的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和缺氧誘導的毛細血管擴張性共濟失調突變可抑制毛細血管擴張性共濟失調癥突變蛋白的表達，促進轉錄因子E2F1的表達，進而上調肺腺癌細胞中核轉運蛋白α2的表達，具有潛在的抑癌作用[38]；此外，降低EGF誘導的AKT信號轉導可抑制肺鱗腺癌細胞的增殖和遷移[39]。(10)STAT3信號通路也與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關，泛素特異性肽酶28可通過誘導STAT3信號通路促進NSCLC細胞的生長[40]，而下調STAT3可增加癌細胞對吉非替尼的敏感性[41-43]。(11)研究表明，抑制PTGS2可顯著地逆轉耐藥NSCLC體外和體內(nèi)的化療耐藥，故PTGS2可作為一種輔助治療靶點，提高NSCLC患者對治療藥物的應答率[44]。由此推測，補肺化瘀湯的有效活性成分通過作用于上述多個靶點，從而發(fā)揮治療NSCLC的作用。已有研究表明，補肺化瘀湯聯(lián)合化療治療NSCLC可以有效地降低患者的VEGF水平,改善免疫功能,減輕毒副作用[45]；補肺化瘀湯聯(lián)合吉非替尼治療晚期EGFR突變型NSCLC可提高療效,降低患者的轉移率和復發(fā)率[46]。

GO功能富集分析結果顯示，加減補肺化瘀湯治療NSCLC的過程與細胞對鎘離子的反應、DNA代謝過程的正調控、DNA結合轉錄因子活性的調節(jié)等生物學過程相關。KEGG信號通路富集分析結果提示，加減補肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點主要涉及癌基因相關信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、結直腸癌信號通路、癌癥中的蛋白多糖信號通路等。其中癌癥相關通路為富集程度較高的信號通路，其包含了MAPK、磷酸酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)等信號通路。Chen等[47]的動物實驗表明，通過靶向神經(jīng)纖維蛋白1以激活ERK信號傳導，可顯著地增強NSCLC細胞對埃羅替尼的耐藥性；Hou等[48]的體內(nèi)外細胞實驗顯示，下調PI3K信號通路可抑制肺腺癌干細胞樣細胞的生長；Lu等[49]的動物實驗表明，阻斷MAPK/C-Jun N末端激酶通路可以抑制NSCLC細胞的增殖并誘導其凋亡，從而抑制腫瘤的生長,起到抑癌作用。結合所獲得的核心靶點和KEGG信號通路，我們推測加減補肺化瘀湯中的多個活性成分可能通過AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA等靶點調控PI3K/ERK、MAPK等多種信號通路達到治療NSCLC的作用。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡藥理學的方法研究加減補肺化瘀湯治療NSCLC的作用機制，發(fā)現(xiàn)加減補肺化瘀湯治療NSCLC的作用機制可能與AKT1、CASP3、VEGF、ERK等靶點有關。加減補肺化瘀湯中的多個活性成分可能通過以下途徑發(fā)揮治療NSCLC的作用：調節(jié)AKT1以調控肺癌細胞的增殖、轉移，降低VEGF水平以減少癌細胞的侵襲和潛在轉移，調節(jié)ERK以提高EGFR抑制劑的治療反應等過程，促進樹突狀細胞有效地吞噬癌細胞，降低EGF誘導的AKT信號轉導、增加CASP3、c-MYC基因的表達以誘導細胞凋亡，抑制癌細胞的增殖轉移，下調STAT3以增加癌細胞對治療藥物的敏感性等。