周 義 李 瓚 趙 平 謝吉良 李元明

1 四川省廣元市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 628000； 2 廣元市中醫(yī)醫(yī)院普外科

結(jié)腸腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率均較高。近年有研究表明其發(fā)病率在消化道惡性腫瘤中居世界第三,且逐年上升[1]。目前結(jié)腸腺癌的診斷主要依賴?yán)w維結(jié)腸鏡活檢、穿刺細(xì)胞學(xué)檢查及腹部CT等,但是臨床分期、病理學(xué)分級等常用的指標(biāo)并不能完全反映出其生物學(xué)行為和預(yù)后。既往結(jié)腸腺癌治療方法主要是靠單純手術(shù)治療，目前治療該病主要在手術(shù)的基礎(chǔ)上加術(shù)后放療、化療、分子靶向治療等綜合治療,但患者的生存期并沒有明顯的改善，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致結(jié)腸腺癌患者死亡的主要原因。目前結(jié)腸腺癌臨床尚無明確的腫瘤標(biāo)記物為預(yù)后做出指導(dǎo)，因此為提高患者生存期，改善預(yù)后，尋找新的分子標(biāo)志物迫在眉睫。ERBB3是表皮生長因子受體家族成員之一，與家族其他成員一樣都具有酪氨酸蛋白激酶活性,且酪氨酸激酶活性區(qū)域高度保守[2]。研究發(fā)現(xiàn)，ERBB3可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，延長腫瘤細(xì)胞的存活時間[3]，增加腫瘤細(xì)胞的遷移能力[4]。目前ERBB3在結(jié)腸腺癌中的報道不多,而且與結(jié)腸腺癌生物學(xué)行為的研究更少；因此本研究通過檢索Oncomine、TCGA、String-DB數(shù)據(jù)庫并深度挖掘在結(jié)腸腺癌的基因芯片中與ERBB3表達(dá)有關(guān)的數(shù)據(jù), 探索結(jié)腸腺癌中ERBB3蛋白表達(dá)差異,以期為結(jié)腸腺癌的診斷與預(yù)后提供新的基因靶點。

1 方法

1.1 基于oncomine數(shù)據(jù)庫的ERBB3在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)分析 使用Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html)平臺分析結(jié)腸腺癌樣品中ERBB3的mRNA表達(dá)值，收集可獲得的癌癥微陣列數(shù)據(jù)[5]。在癌癥和正常組織之間進(jìn)行比較，本研究中使用的閾值標(biāo)準(zhǔn)是：P<0.001，fold change>2，gene rank=top 10%。

1.2 cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析 使用ciBoPortal數(shù)據(jù)庫版本2.2.0(MSK，紐約，美國的分子腫瘤學(xué)中心)(http://www.cbioportal.org/)對各種癌癥中的ERBB3進(jìn)行了改變的表達(dá)分析，一種基于網(wǎng)絡(luò)的開放式訪問資源，目前提供來自TCGA管道的225項癌癥研究的數(shù)據(jù)。通過來自TCGA PanCanAtlas數(shù)據(jù)集的每種癌癥的亞型估計mRNA表達(dá)的改變頻率。門戶內(nèi)的體細(xì)胞拷貝數(shù)改變由GISTIC(癌癥中重要靶標(biāo)的基因組鑒定)算法產(chǎn)生。通過每種改變狀態(tài)(深度缺失、淺缺失、二倍體、增殖和擴(kuò)增)檢查C1QBP的表達(dá)并繪圖。使用GraphPad 7軟件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA，USA)通過ANOVA和非配對t-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 生存及復(fù)發(fā)分析 R軟件(www.r-project.org)和JMP 10.0軟件(SAS Institute，Cary，NC，USA)用于一般統(tǒng)計分析。連續(xù)數(shù)據(jù)的組間比較使用配對t檢驗進(jìn)行獨立均值或單因素方差分析與Tukey的多組后事檢驗。使用χ2分析，F(xiàn)isher精確概率法比較分類變量。 Kaplan-Meier分析和Cox比例風(fēng)險模型用于分析OS以及復(fù)發(fā)(Recurrence)。應(yīng)用多變量Cox分析來調(diào)整協(xié)變量效應(yīng)，并使用分層分析來降低計算風(fēng)險比(HRs)的混雜效應(yīng)。缺失數(shù)據(jù)被編碼并從分析中排除。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò) STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫旨在收集、評分和整合所有公開可用的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用信息來源，并通過計算預(yù)測對其進(jìn)行補充[6]，本研究檢索設(shè)定 “ErbB3;Homo sapiens; high confidence (0.400);max number of interactors to show: no more than 10 interactions”。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析ERBB3在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)情況 通過Oncomine數(shù)據(jù)庫設(shè)定條件“(1)Gene:ERBB3;(2)Analysis Type:Colorectal Cancer vs Normal Analysis;(3)Data Type:mRNA；(4)Sample Type:Clinical Specimen”進(jìn)行數(shù)據(jù)庫中的ERBB3表達(dá)情況具體分析,共篩選出1個數(shù)據(jù)庫,樣本量共120個,發(fā)現(xiàn)ERBB3在結(jié)腸腺癌中較正常組織有明顯的差異性表達(dá):TCGA (Colon Adenocarcinoma:n=124,P<0.001, fold change=2.405)，見圖1。從圖中我們可以看出ERBB3基因在結(jié)腸腺癌顯著過表達(dá)。對上述數(shù)據(jù)庫結(jié)果進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn),再次驗證了ERBB3在結(jié)腸腺癌中表達(dá)明顯增高(P<0.001),見圖1。

2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析ERBB3在結(jié)腸腺癌中ERBB3 mRNA的改變情況 為了確定ERBB3 mRNA在結(jié)腸腺癌中的變異情況，我們分析了COAD-TCGA Pancancer atlas數(shù)據(jù)集中mRNA在結(jié)腸癌中的變異情況，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腺癌(COAD)中ERBB3 mRNA上調(diào)較下調(diào)多。

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析ERBB3在結(jié)腸腺癌中DNA拷貝數(shù)與mRNA表達(dá)的關(guān)系 為了確定ERBB3拷貝數(shù)是否與mRNA表達(dá)相關(guān)，我們列出每個結(jié)腸腺癌標(biāo)本中的ERBB3 mRNA表達(dá)和DNA拷貝數(shù)改變，結(jié)果顯示ERBB3 mRNA的表達(dá)與DNA拷貝數(shù)改變狀態(tài)呈顯著正相關(guān)(ANOVA，P<0.000 1)，見圖2。

圖2 ERBB3在結(jié)腸腺癌中DNA拷貝數(shù)狀態(tài)與mRNA表達(dá)的關(guān)系 ERBB3 mRNA的表達(dá)與DNA拷貝數(shù)改變狀態(tài)呈顯著正 相關(guān)，SD：shallow deletion；D：diploid；G：gain；A：amplific- ation (ANOVA,P<0.000 1)(****:P<0.000 1)

2.4 ERBB3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 在String-DB數(shù)據(jù)庫中,按照實驗方法中設(shè)定條件[minimum required interaction score:high confidence(0.7)；max number of interactors to show:no more than 10 interactors],進(jìn)行檢索分析ERBB3蛋白相互網(wǎng)絡(luò),PPI富集P<0.05,節(jié)點數(shù)為11個節(jié)點，其中在PPI網(wǎng)絡(luò)中與ERBB3相互作用的有EGFR、EGF、PIK3R1、GRB2、SHC1、AKT1、PTPN11、NRG1-2、HRAS。其中共表達(dá)分析可見EGFR、EGF蛋白與ERBB3關(guān)系更為密切,提示ERBB3參與腫瘤的轉(zhuǎn)移、增殖等生物學(xué)行為。

2.5 生存分析 在oncomine數(shù)據(jù)庫根據(jù)條件:(1)Gene:ERBB3，(2)Cancer Type:Colon adenocarcinoma,(3)Clinical Outcome:Survival Status，(4)Data Type:mRNA,(5)Dataset Size:151+samples,可篩選出2個數(shù)據(jù)集，分別來自Smith Colorectal[7]以及TCGA數(shù)據(jù)集，導(dǎo)出數(shù)據(jù)并利用R-sdutio分析得到生存期曲線，結(jié)果顯示：ERBB3表達(dá)與結(jié)腸腺癌預(yù)后無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見圖3。

2.6 復(fù)發(fā)分析 在oncomine數(shù)據(jù)庫根據(jù)條件:(1)Gene:ERBB3;(2)Cancer Type:leukemia；(3)Clinical Outcome:Recurrence Status；(4)Data Type:mRNA,可篩選出1個數(shù)據(jù)集，來自Jorissen Colorectal[8]數(shù)據(jù)集，導(dǎo)出數(shù)據(jù)并利用R-sdutio分析并得到復(fù)發(fā)曲線，結(jié)果顯示：ERBB3高表達(dá)的結(jié)腸腺癌容易復(fù)發(fā)(P<0.05),見圖4。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中ERBB3表達(dá)與結(jié)腸腺癌預(yù)后之間的生存曲線 a.TCGA數(shù)據(jù)庫 b.Smith Colorectal數(shù)據(jù)庫

圖4 Jorissen Colorectal數(shù)據(jù)庫中ERBB3表達(dá)與結(jié)腸腺癌預(yù)后之間的復(fù)發(fā)曲線

3 討論

結(jié)腸腺癌是來源于結(jié)腸黏膜上皮的惡性腫瘤，與腺上皮惡變、遺傳、環(huán)境、個體特質(zhì)及內(nèi)分泌等多種因素密切相關(guān)。研究表明它是與多種分子機(jī)制調(diào)控相關(guān)的惡性腫瘤，如MMP-19、miR-134-5p、GNG4、TIMP1等[9-11]。雖然目前結(jié)腸腺癌的治療方式已由最初的單純手術(shù)治療，發(fā)展到術(shù)后結(jié)合放療、放療、分子靶向治療等綜合治療，但在過去的幾十年中，患者的總體存活率并沒有得到顯著改善[12]。從分子學(xué)角度來看，結(jié)腸癌是由于異常物質(zhì)的積累，從而驅(qū)動正常結(jié)腸細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。因此，通過分子生物信息學(xué)挖掘新的基因靶點對結(jié)腸腺癌患者的診斷及復(fù)查具有重要意義。

HER3/ERBB3是人表皮生長因子受體(HER)家族的四種跨膜蛋白之一，該家族成員還包括EGRFR/HER1/ERBB1、HER2/ERBB2和HER4/ERBB4，能夠進(jìn)行同二聚和異二聚并驅(qū)動多種細(xì)胞活動，包括遷移、分化、增殖和細(xì)胞存活[13]。既往研究表明ERBB3可以促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲,增加癌細(xì)胞對靶向治療的抵抗力[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，ERBB3在結(jié)腸腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，這與Jardé等[15]報道一致。在結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)ERBB3的遺傳抑制導(dǎo)致具有組成型活性KRAS和PIK3CA突變的HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的抗腫瘤發(fā)生，ERBB3敲低導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯并激活Bak和Bax依賴性細(xì)胞凋亡[16]。與正常組織相比，結(jié)腸腺癌腫瘤組織細(xì)胞中的ERBB3和腸干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)顯著升高。ERBB3與腸干細(xì)胞標(biāo)志物之間存在正相關(guān)。在體外，研究者發(fā)現(xiàn)ERBB3敲低可降低細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并阻斷結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移[17]，在體內(nèi)觀察到類似的機(jī)制，敲低ERBB3可延遲腫瘤的生長[18]。本研究發(fā)現(xiàn)ERBB3mRNA表達(dá)與DNA拷貝數(shù)改變狀態(tài)呈顯著正相關(guān)，與Saha等[19]在C1QBP基因中的發(fā)現(xiàn)一致。延長腫瘤患者的生存時間、增加患者的生存率是臨床腫瘤治療的最終目的，因此腫瘤患者達(dá)到臨床治愈以后預(yù)防復(fù)發(fā)也是腫瘤治療的另一重點和難點。我們研究還發(fā)現(xiàn)，ERBB3高表達(dá)的結(jié)腸腺癌患者復(fù)發(fā)率高, 因此ERBB3的差異表達(dá)可能與患者腫瘤是否復(fù)發(fā)密切相關(guān)，這可能成為以后研究的熱點，也需要更多學(xué)者的研究來闡明這一分子機(jī)制。

綜上所述，ERBB3在結(jié)腸腺癌中高表達(dá),且其mRNA表達(dá)與DNA拷貝數(shù)改變狀態(tài)呈顯著正相關(guān)，這一生物學(xué)行為參與了細(xì)胞的增殖與凋亡。同時，ERBB3高表達(dá)結(jié)腸腺癌患者復(fù)發(fā)率高。因此ERBB3可能成為結(jié)腸腺癌診斷及減少復(fù)發(fā)的新靶點，對其分子機(jī)制的研究具有重要意義。