莫小春, 胡德輝, 張 強(qiáng), 丁世磊, 羅小莉

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪(Astragalus complanatus R.Br. )成熟的種子, 主要分布在我國陜西潼關(guān)、 內(nèi)蒙古、 河北等省份為主的華北、 西北地區(qū)[1]。 沙苑子性溫味甘, 具有的調(diào)血脂,養(yǎng)肝明目, 補(bǔ)腎助陽, 固精縮尿, 降血脂, 提高免疫力的功效[2-3], 它不僅是中藥材市場上的大宗藥材, 現(xiàn)在已成為中老年人青睞的保健品[4], 例如: 將沙苑子作為“茶飲” 品嘗, 制作與沙苑子相關(guān)的沙苑子酒、 沙苑子糖等特色食品。 相關(guān)研究表明, 沙苑子中富含的黃酮成分, 對高脂血癥患者具有很好的調(diào)節(jié)血脂代謝的作用, 抗腫瘤、 抗氧化等顯著的藥理作用[5-7]。因此, 提高沙苑子總黃酮得率是非常必要的。

當(dāng)前, 沙苑子總黃酮的提取工藝主要有溶媒浸提[8-9]、 超聲波[10-12]、 超臨界CO2流體萃取[13]等, 例如: 李君玲[8]報道沙苑子總黃酮的乙醇提法, 得到黃酮含量為13.58 mg/g; 劉銀芳等[9]考察了提取溶媒對沙苑子總黃酮的影響, 提出乙醇為最優(yōu)提取溶媒, 總黃酮量為5.13 mg/g; 李洪娟等[10]介紹了超聲波提取法, 乙醇為提取溶液, 總黃酮含量約為6 ～10 mg/g; 張清安等使用超聲法, 分別選擇了丙酮和甲醇作為提取溶劑, 得到黃酮含量分別為161.98 mg/g、 106.64 mg/g[11-12]; 謝小霞等[13]研究了超臨界CO2流體萃取法, 總黃酮提取率為0.78%。綜上, 微波-超聲波相結(jié)合方法鮮有報道用于沙苑子總黃酮提取工藝中, 但已被應(yīng)用在不同的原料黃酮化合物的提取工藝研究之中, 可有效提高天然產(chǎn)物的得率、 縮短提取時間, 減低成本[14]。

因此, 本研究將結(jié)合微波和超聲波方法, 通過響應(yīng)面Box-Benhnken 設(shè)計優(yōu)選出沙苑子總黃酮的最佳提取工藝, 旨在提高沙苑子總黃酮的得率, 降低成本, 簡化生產(chǎn)操作, 評價該藥材的抗氧化活性, 為沙苑子總黃酮的提取工藝革新及應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

沙苑子, 南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司; 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,中國食品藥物檢定研究院(純度≥99%); 1,2-二苦基-2-三硝基苯亞肼, 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司(純度＞97%); 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚, 天津化學(xué)試劑有限公司; 三氯化鋁、醋酸鈉、 甲醇、 無水乙醇、 石油醚(沸點(diǎn)60 ～90 ℃), 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600 紫外可見分光光度計, 島津儀器有限公司;FW100 高速萬能粉碎機(jī), 天津市泰斯特儀器有限公司; PS-40A 超聲波清洗機(jī), 深圳市科潔超聲有限公司; M3-L235F 微波爐, 廣東美的廚房電器制造有限公司; SQP 電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 樣品的制備

將250 g 沙苑子粉碎過篩, 石油醚加熱回流4 h, 趁熱過濾, 脫脂藥粉自然揮干, 真空干燥4 h, 收集備用。

1.3.2 最大吸收波長的確定

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.20 mg, 用65%乙醇定容至100 mL得0.2020 mg/mL 的蘆丁母液, 精密移取2.00 mL 于25 mL 的棕色容量瓶中, 采用三氯化鋁-醋酸鈉顯色法, 依次加入4.00 mL 65%乙醇, 2.00 mL 0.1 mol/L 三氯化鋁水溶液, 3.00 mL 1.0 mol/L 醋酸鈉水溶液, 最后65% 乙醇定容, 搖勻, 靜置15 min, 進(jìn)行紫外吸收光譜測定, 確定410 nm 波長為吸收峰。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別精密移取1.3.2 準(zhǔn)備的蘆丁母液1.00 mL、 2.00 mL、3.00 mL、 4.00 mL、 5.00 mL、 6.00 mL 于25 mL 的棕色容量瓶中, 采用三氯化鋁-醋酸鈉顯色法, 依次加入4.00 mL 65%乙醇, 2.00 mL 0.1 mol/L 三氯化鋁水溶液, 3.00 mL 1.0 mol/L醋酸鈉水溶液, 最后65%乙醇定容, 搖勻, 靜置15 min, 在410 nm 波長處測吸光值, 繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 沙苑子總黃酮的提取

按1.3.2 顯色法測定沙苑子樣品提取液的吸光度, 將所得的吸光值代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計算得到提取物中總黃酮含量,并按下面的公式計算總黃酮的得率。

式中: Y 為樣品中總黃酮得率,%; C 為由所測吸光度值代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線后得出的黃酮的質(zhì)量濃度, mg/mL; V1為稀釋體積, mL; V2為樣品溶液的體積, mL; m 為樣品質(zhì)量, mg;V3為取樣體積, mL。

1.3.5 沙苑子總黃酮提取單因素的探索

稱取沙苑子粉末0.5 g, 加入乙醇浸泡, 分別考察乙醇濃度(45%、 55%、 65%、 75%、 85%), 微波時間(30 s、 60 s、120 s、 150 s、 180 s), 微 波 功 率(90 W、 270 W、 450 W、720 W、 900 W)和超聲時間(10 min、 20 min、 30 min、 40 min、50 min、 60 min)對黃酮得率的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果的水平范圍, 選擇影響效果顯著的乙醇濃度(%)、 微波時間(s)、 超聲時間(min)為優(yōu)化因素,沙苑子總黃酮得率(Y)為評價值, 利用Design-Expert 10.0 進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計, 并進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.5 抗氧化試驗(yàn)

將最優(yōu)條件下得到的沙苑子總黃酮提取液, 參照趙二勞文獻(xiàn)的方法[15], 各取0.50, 1.00, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00,3.50, 4.00, 4.50, 5.00 mL 于10.00 mL 的容量瓶中, 配制成不同濃度的樣品溶液, 再取樣品溶液與0.13 mg/mL DPPH 溶液等體積混合, 在室溫避光處靜置30 min; 用無水乙醇作為參比溶液, 在517 nm 處測定吸光度A; 不同濃度的樣品溶液與無水乙醇等體積混合避光處放置30 min, 在517 nm 處測定吸光度A空白; DPPH 溶液與無水乙醇等體積混合避光處放置30 min,在517 nm 處測定吸光度ADPPH; 平行測定3 次, 計算提取液對于DPPH 的清除率, 以BHT 為對照。

DPPH 自由基清除率=(1-(A-A空白))/ADPPH×100%

式中:A表示樣品溶液的吸光度值;A空白表示空白組溶液吸光度值;ADPPH是DPPH 的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取410 nm 為蘆丁最大吸收波長, 然后以標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、 吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到線性回歸方程為A= 29.6093C-0.0037(C代表濃度,A代表吸光度), 相關(guān)系數(shù)R2= 0.9999, 表明在0 ～0.04848 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖2)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對沙苑子總黃酮得率的影響

探索乙醇濃度對沙苑子總黃酮得率的影響, 由圖2 可知:當(dāng)乙醇濃度在45% ～65%范圍內(nèi), 總黃酮得率隨著乙醇濃度的增大而增加, 當(dāng)乙醇濃度為65%時, 總黃酮得率達(dá)到最大值;隨著乙醇濃度繼續(xù)增大, 黃酮得率出現(xiàn)下降趨勢, 可能是此濃度下的有機(jī)溶劑極性與沙苑子中黃酮的極性相近, 使沙苑子細(xì)胞溶脹, 促進(jìn)總黃酮成分的滲出[16], 乙醇濃度偏離65%越多,則沙苑子總黃酮的溶出量越少。 所以, 最終選擇乙醇的濃度為65%。

圖2 乙醇濃度對沙苑子總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.2.2 微波時間對沙苑子總黃酮得率的影響

微波時間對沙苑子總黃酮得率的影響見圖3, 沙苑子總黃酮得率隨著微波時間的增加呈現(xiàn)增加的趨勢, 微波時間在120 s黃酮得率最大; 在120 s 之后得率逐漸下降。 推測是由于微波輻射可使細(xì)胞破碎, 從而增加黃酮的溶出量, 但是如果微波時間過久, 則會增加熱量聚集, 破壞黃酮的結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致黃酮的得率降低[17]。 所以選擇微波的時間120 s。

圖3 微波時間對沙苑子總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of microwave time on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.2.3 微波功率對沙苑子總黃酮得率的影響

微波功率對沙苑子總黃酮得率的影響, 如圖4 所示, 微波功率在90 ～900 W 之間, 沙苑子總黃酮的得率顯示先遞增后降低的趨勢, 270 W 時達(dá)到最大值。 原因是隨著微波功率遞增,分子運(yùn)動逐漸加劇, 黃酮析出逐漸增多; 而當(dāng)繼續(xù)增大微波的功率, 它產(chǎn)生的強(qiáng)烈作用使黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞, 導(dǎo)致黃酮得率出現(xiàn)下降的趨勢[18]。 故選擇270 W 為較合適的微波功率。

圖4 微波功率對沙苑子總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of microwave power on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.2.4 超聲時間對沙苑子總黃酮得率的影響

超聲時間對沙苑子總黃酮得率的影響見圖5, 在10 ～50 min 之間得率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢, 在50 min 之后得率開始降低, 原因可能是超聲波產(chǎn)生的能量與作用的時間有關(guān), 超聲時間越久, 其產(chǎn)生的能量就越大, 從而得率越高。 但是, 伴隨著超聲時間不斷增加, 總黃酮的得率卻出現(xiàn)下降的趨勢, 最終使得總黃酮的得率減少。 所以選擇超聲的時間在50 min 時為最適合。

圖5 超聲時間對沙苑子總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of ultrasonic time on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 沙苑子總黃酮得率的響應(yīng)面試驗(yàn)工藝設(shè)計表與結(jié)果

選擇單因素為乙醇濃度(%)、 微波時間(s)和超聲時間(min),確定各因素最佳水平值范圍, 進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計, 試驗(yàn)因素與水平見表1; 采用Design-Expert 10.0 軟件設(shè)計的Box-Behnken 試驗(yàn), 分析方案與結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計因素水平表Table 1 Design factor level table of Box-Behnken experiment

表2 Box-Behnken 設(shè)計方案和試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design scheme and test results of Box-Behnken

2.3.2 方差分析

利用Design-Expert 10.0 軟件對表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到沙苑子總黃酮得率對自變量乙醇濃度(A), 微波時間(B)和超聲時間(C)二次多項式方程: Y=1.82-0.38A+0.015B+2.437×10-3C-0.025AB+0.047AC-0.037BC-0.29A2-0.073B2-0.13C2。

模型的顯著性可根據(jù)失擬項F 值判斷, F 值越大, 模型顯著性檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)P 越小, 表明相應(yīng)的變量越顯著。 由表3 可知, 該模型的極顯著性(P ＜0.0001), 失擬項不顯著(P ＞0.0807), 說明該回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合程度較高, 實(shí)驗(yàn)誤差小, 模型有意義; 模型的一次項A, 二次項A2都具有極顯著性, 表明乙醇濃度對沙苑子總黃酮的得率影響非常顯著; 二次項C2具有顯著性, 表明超聲時間對沙苑子總黃酮得得率影響顯著。 相關(guān)系數(shù)R2=0.9825、 校正決定系數(shù)RAdj=0.9601,說明該模型擬合狀況良好, 建立的回歸模型可信度高。 由響應(yīng)面結(jié)果分析可得各因素對沙苑子總黃酮得率的影響大小依次為: 乙醇濃度＞超聲時間＞微波時間。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface regression model

2.3.3 交互作用結(jié)果分析

由圖6(a)分析可得: 乙醇濃度的坡面比微波時間的坡面陡峭, 說明乙醇濃度的二次項對總黃酮得率影響較大; 從圖6(b)得到乙醇濃度和超聲時間的二次項都對總黃酮得率有顯著性, 但乙醇濃度影響較大; 同理, 圖6(c)顯示, 超聲時間的二次項都對總黃酮得率有顯著性, 微波時間影響顯著性較弱。 其等高線的性狀呈現(xiàn)出橢圓形, 橢圓形的等高線表明其相互效應(yīng)較強(qiáng),從而體現(xiàn)了乙醇濃度對于沙苑子總黃酮的得率的影響最為顯著[19]。

圖6 各變量交互作用對沙苑子總黃酮得率的影響Fig.6 Effects of the interaction of variables on the yield of total flavonoids in Astragalus complanatus

2.4 抗氧化結(jié)果

沙苑子總黃酮成分對DPPH 的清除率效果如圖8 所示。 在6.00 ～42.00 μg/mL 的范圍內(nèi), 沙苑子總黃酮的提取液與BHT的無水乙醇溶液對DPPH 的清除率都會隨著其濃度的增大而增大, 達(dá)到42.00 μg/mL 的濃度時, 沙苑子總黃酮的清除率達(dá)到89%, BHT 的清除率達(dá)到78%, 說明沙苑子總黃酮的DPPH 自由基清楚效果較好。 分別對沙苑子總黃酮與BHT 的清除率進(jìn)行線性回歸, 沙苑子總黃酮與BHT 對于DPPH 的IC50分別為14.68、 18.37 μg/mL, 由此可見沙苑子總黃酮對DPPH 的清除能力強(qiáng)于抗氧化劑BHT, 說明沙苑子總黃酮具有較強(qiáng)抗氧化活性。

圖7 沙苑子總黃酮和BHT 對DPPH 的清除作用結(jié)果Fig.7 Results of DPPH clearance by total flavonoids and BHT in Astragalus complanatus

3 結(jié) 論

本文使用微波-超聲波相結(jié)合的提取方法, 乙醇為提取溶液, 有效地提高了沙苑子總黃酮的提得量(與已報到的文獻(xiàn)對比[8-10])。 通過Design-Expert 10.0 軟件進(jìn)行二次回歸模型設(shè)計分析, 得到沙苑子總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度50.87%, 微波時間129.24 s, 超聲時間47.01 min, 得率預(yù)測值為1.9456%; 根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)操作, 提取工藝參數(shù)微調(diào)為乙醇濃度50%, 微波時間130 s, 超聲時間47 min, 進(jìn)行3 組平行試驗(yàn), 得到沙苑子的總黃酮得率1.8138%(RSD=0.39%), 即總黃酮提得量為17.78 mg/g, 與模型預(yù)測值相近, 證明該模型可靠有效。 并進(jìn)行了抗氧化活性研究, 試驗(yàn)結(jié)果顯示: DPPH 自由基的清除率達(dá)到89%, IC50為14.68 μg/mL, 沙苑子總黃酮的抗氧化活性較好。 為進(jìn)一步研究沙苑子總黃酮的提取工藝、天然藥物的抗氧化能力提供可行性的技術(shù)參考。