秦寧， 李俊茹， 田蕊， 邵振啟， 李喜煥*， 張彩英

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001）

生育酚（維生素E）是可溶于有機(jī)溶劑、粘稠油狀、淡黃色的物質(zhì)，一般在大豆油和谷物種子的胚芽油中含量豐富[1-2]。已有研究證實(shí)，生育酚在植物體內(nèi)可參與多種生理生化代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控和抵御多種逆境脅迫，因而在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要功能[3-4]。同時(shí)，生育酚還具有較強(qiáng)的抗氧化功能，可有效防止或改善人類多種癌癥、心血管疾病、眼部疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，故而在醫(yī)學(xué)、保健等領(lǐng)域具有重要研究?jī)r(jià)值[5-9]。

人體自身并不能合成生育酚，需從植物油中攝取[10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，天然生育酚的年生產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，需求量以10%年增長(zhǎng)量遞增[3]。油料作物種子的生育酚含量較其他農(nóng)作物高，并以油菜和大豆種子的生育酚含量更為豐富[11]。劉煥成等[12]測(cè)定不同大豆品種資源籽粒中的生育酚含量，發(fā)現(xiàn)總生育酚含量在 254 μg·g—1左右，且不同品種間的含量存在較大差異。由此可見，發(fā)掘利用大豆籽粒生育酚對(duì)滿足當(dāng)前國(guó)際市場(chǎng)天然生育酚需求至關(guān)重要[13]。然而，生育酚屬于多基因控制的數(shù)量性狀，目前僅有少數(shù)學(xué)者針對(duì)大豆籽粒生育酚含量開展遺傳位點(diǎn)與候選基因發(fā)掘研究，所獲遺傳位點(diǎn)與基因不能滿足分子遺傳改良和遺傳機(jī)制解析。

梁慧珍等[14]通過(guò)測(cè)定大豆重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體γ-生育酚含量獲得9個(gè)控制其含量QTLs，位于4、5、7、8、9和18號(hào)染色體，表型貢獻(xiàn)率7.29%～29.55%。張紅梅等[3]檢測(cè)大豆重組自交系群體δ-、γ-和α-生育酚含量，獲得8個(gè)關(guān)聯(lián)QTLs，位于1、6、9、10、18和19號(hào)染色體，表型貢獻(xiàn)率為2.40%～6.18%。李海燕等[13]對(duì)大豆RIL群體進(jìn)行生育酚含量QTL分析，結(jié)果在1、2、3、6、7、8、18和19號(hào)染色體檢測(cè)到連鎖QTLs。劉煥成[15]利用大豆RIL群體為材料，獲得66個(gè)生育酚及其組分含量相關(guān)QTLs，表型貢獻(xiàn)率為2.4%～32.6%，其中包括21個(gè)α-生育酚QTLs（10、15、18和19號(hào)染色體）、17個(gè)γ-生育酚QTLs（9、10、12、15、18和19號(hào)染色體）、13個(gè)δ-生育酚QTLs（10、12、15和19號(hào)染色體）和15個(gè)總生育酚QTLs（9、10、12、15、18和19號(hào)染色體）。最近，Zhan等[16]通過(guò)檢測(cè)大豆自然群體生育酚含量，獲得18個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記，位于10條染色體（1、2、6、8、10、12、13、17、18和19號(hào)染色體）。Sui等[17]檢測(cè)大豆自然群體和重組自交系群體生育酚含量，分別獲得19個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記與18個(gè)連鎖QTLs，其中包括1個(gè)位于2號(hào)染色體的關(guān)聯(lián)與連鎖分析共同檢測(cè)到的遺傳位點(diǎn)。

針對(duì)上述大豆生育酚遺傳位點(diǎn)與候選基因嚴(yán)重缺乏的問(wèn)題，本研究利用大豆重組自交系群體，通過(guò)鑒定其籽?？偵印ⅵ?生育酚及其占比、γ-生育酚及其占比以及δ-生育酚及其占比，明確群體生育酚遺傳變異及其相關(guān)性，挖掘其遺傳位點(diǎn)并篩選候選基因，為大豆生育酚含量分子遺傳改良和分子遺傳機(jī)制解析提供選擇標(biāo)記與基因資源。

1 材料與方法

1.1 供試大豆材料

供試RIL群體（ZQ-RIL，F(xiàn)6:7）含283個(gè)家系，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種團(tuán)隊(duì)提供，于2016年6月種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物育種中心，完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，行長(zhǎng)1.5 m，雙行區(qū)，行距0.5 m，3次重復(fù)，田間管理參考一般大豆田管理方法[18]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆籽粒生育酚提取方法 隨機(jī)選取供試RIL群體各家系的健康飽滿、均勻一致、無(wú)損傷籽粒20～30粒，磨樣機(jī)（合肥榮事達(dá)小家電有限公司，GR150A）粉碎過(guò)60目篩；準(zhǔn)確稱取磨粉0.05 g，加入1.5 mL 80%色譜乙醇（天津福晨化學(xué)試劑有限公司），振蕩混勻15 s；超聲波萃取15 min，靜置15 min，振蕩混勻20 s；超聲波再次萃取15 min，13 000 r·min—1離心 15 min；吸取上清用0.22 μm濾膜過(guò)濾[19]。

1.2.2 供試RIL群體籽粒生育酚測(cè)定方法 采用安捷倫1260型高效液相色譜儀[安捷倫科技(中國(guó))有限公司]檢測(cè)提取液的 α-、γ-和 δ-生育酚含量[19]。色譜條件：熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)330 nm，流動(dòng)相為色譜乙腈:色譜甲醇（90:10，天津福晨化學(xué)試劑有限公司），流速1 mL·min—1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)時(shí)間14 min。

獲得的α-、γ-和δ-生育酚含量總和為總生育酚含量，同時(shí)計(jì)算各組分含量占總含量的比值[19]。

1.2.3 生育酚QTL定位與候選基因篩選 利用供試RIL群體籽粒α-、γ-和δ-生育酚、總生育酚含量以及α-、γ-和δ-生育酚占比共7個(gè)性狀，結(jié)合群體SNP遺傳連鎖圖譜，采用IciMapping V4.2軟件進(jìn)行QTL定位[20]。

利用鑒定到的籽粒生育酚QTLs，在其區(qū)間范圍內(nèi)尋找候選基因（參考基因組為Williams82 a2v1），結(jié)合 RIL群體親本（鄭92116、齊黃30）籽粒不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析候選基因表達(dá)量，并依據(jù)基因表達(dá)量及其基因注釋，篩選與大豆生育酚含量相關(guān)基因。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法 利用SPSS V21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)供試RIL群體7個(gè)性狀進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)、方差分析和相關(guān)系數(shù)計(jì)算，利用GraphPad Prism 8軟件繪制7個(gè)性狀次數(shù)分布圖，利用HemI軟件制作候選基因表達(dá)量熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆RIL群體籽粒生育酚遺傳變異分析

通過(guò)分析供試大豆RIL群體各家系籽粒生育酚及其組分（表1）發(fā)現(xiàn)，α-、γ-和δ-生育酚及總生育酚含量在不同家系間的差異極顯著；進(jìn)一步分析各含量遺傳變異（表1）發(fā)現(xiàn)，α-、γ-和δ-生育酚及總生育酚平均含量為7.10、127.86、65.65和200.61 μg·g—1，變異系數(shù)分別為 36.62%、9.53%、14.03%和9.24%，以α-生育酚含量的變異系數(shù)最大，說(shuō)明供試群體生育酚及各組分含量存在豐富的遺傳變異。

同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，α-、γ-和δ-生育酚在總生育酚中的占比分別為3.54%、63.80%和32.66%，變異系數(shù)分別為35.59%、5.05%和8.70%，亦以α-生育酚占比的變異系數(shù)最高。另外，通過(guò)分析供試RIL家系籽粒生育酚及其各組分次數(shù)分布以及偏度系數(shù)和峰度系數(shù)（表1，圖1）發(fā)現(xiàn)，偏度系數(shù)和峰度系數(shù)均接近0，說(shuō)明供試RIL群體籽粒生育酚及各組分符合正態(tài)分布，屬于多基因控制數(shù)量性狀。

圖1 大豆RIL群體籽粒生育酚及其組分次數(shù)分布Fig.1 Distribution of seed tocopherol and its components in RIL population

表1 供試大豆RIL群體籽粒生育酚及其組分遺傳變異Table 1 Genetic variations of seed tocopherol and its components in RIL population

2.2 大豆RIL群體生育酚及各組分相關(guān)性分析

通過(guò)分析供試大豆RIL群體籽粒生育酚及其組分間的相關(guān)系數(shù)（表2）發(fā)現(xiàn)，總生育酚與3種組分含量間的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水平，并以總含量和γ-生育酚的相關(guān)系數(shù)最高（r=0.859），其次為總含量和δ-生育酚相關(guān)系數(shù)（r=0.803）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)（表2），δ-生育酚與α-生育酚及γ-生育酚含量間的相關(guān)性也極顯著（r=0.256，r=0.410），而α-生育酚與γ-生育酚間的相關(guān)系數(shù)未達(dá)顯著水平（P＞0.05）。

另外還發(fā)現(xiàn)（表2），δ-生育酚占比與γ-生育酚占比、γ-生育酚占比與α-生育酚占比呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.921，r=-0.479）。同時(shí)，總生育酚與δ-生育酚占比、γ-生育酚占比的相關(guān)性也極顯著。上述各組分及總量間的相關(guān)性暗示供試大豆群體可能存在控制籽粒生育酚及其組分含量一因多效遺傳位點(diǎn)，為今后實(shí)現(xiàn)生育酚及其組分含量同步遺傳改良提供一定參考。

表2 供試大豆RIL群體籽粒生育酚及各組分相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients of tocopherol and its components in RIL population

2.3 大豆籽粒生育酚及其組分遺傳位點(diǎn)分析

2.3.1 大豆籽粒生育酚及其組分QTLs發(fā)掘 通過(guò)分析供試大豆RIL群體籽粒生育酚及其組分含量QTLs（表3）發(fā)現(xiàn)，共檢測(cè)到7個(gè)一因多效QTLs，分別位于5、7、8、12、13、18和19號(hào)染色體，表型貢獻(xiàn)率分布在3.08%～21.92%之間。進(jìn)一步分析（表3，圖2）發(fā)現(xiàn)，位于8號(hào)染色體的qTOC-A2（ss715602131～ss715602331）可同時(shí)控制 α-生育酚、δ-生育酚、總生育酚含量、α-生育酚占比和γ-生育酚占比共5個(gè)相關(guān)性狀，表型貢獻(xiàn)率范圍3.85%～6.77%。位于5號(hào)染色體的QTL qTOC-A1可同時(shí)控制α-生育酚含量及其占比、γ-生育酚含量及其占比以及總生育酚含量共5個(gè)性狀，表型貢獻(xiàn)率范圍6.34%～21.92%，其中控制γ-生育酚、總生育酚和α-生育酚占比的貢獻(xiàn)率在10%以上（12.32%～21.92%）。并且還發(fā)現(xiàn)，12和13號(hào)染色體分別存在1個(gè)控制生育酚及其組分一因多效QTL，其中12號(hào)染色體qTOC-H（ss715611499～ss7 15613700）可同時(shí)控制α-生育酚及其占比以及γ-生育酚占比，13號(hào)染色體qTOC-F可同時(shí)控制γ-生育酚與總生育酚含量。18號(hào)染色體QTL可同時(shí)控制δ-生育酚及其占比以及總生育酚含量，19號(hào)染色體QTL可同時(shí)控制α-生育酚及其占比，而7號(hào)染色體QTL可同時(shí)控制γ-生育酚與總生育酚含量。

圖2 大豆8號(hào)染色體籽粒生育酚一因多效QTL及其候選基因Fig.2 Pleiotropic QTL and candidate gene for soybean seed tocopherol and its components on chromosome 8

圖3 大豆5號(hào)染色體籽粒生育酚一因多效QTL及其候選基因Fig.3 Pleiotropic QTL and candidate gene for soybean seed tocopherol and its components on chromosome 5

2.3.2 大豆籽粒生育酚含量及其占比QTLs的比較 通過(guò)比較α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚含量及其相應(yīng)占比檢測(cè)到的QTLs（表3）發(fā)現(xiàn)，各成分含量與相應(yīng)占比間的定位結(jié)果并不完全一致，如5號(hào)染色體qTOC-A1、18號(hào)染色體qTOC-G和19號(hào)染色體qTOC-L生育酚組分及其占比定位結(jié)果一致，而7號(hào)染色體qTOC-M控制γ-生育酚與總生育酚，13號(hào)染色體qTOC-F控制γ-生育酚與總生育酚，但并未控制γ-生育酚占比，暗示控制大豆籽粒生育酚組分含量與組分占比的分子遺傳機(jī)制并不完全一致。

表3 供試大豆RIL群體籽粒生育酚及其各組分一因多效QTLsTable 3 Pleiotropic QTLs of seed tocopherol and its components in soybean RIL population

2.4 大豆籽粒生育酚及其組分候選基因篩選

為進(jìn)一步篩選與大豆籽粒生育酚及其組分相關(guān)基因，本研究利用前期已有供試RIL群體親本“鄭92116”與“齊黃30”籽粒不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析上述QTLs區(qū)間候選基因，結(jié)果（圖2～4）表明，在上述QTLs區(qū)間存在多個(gè)差異表達(dá)基因，這一方面驗(yàn)證了上述連鎖QTLs可靠性，另一方面為發(fā)掘控制大豆籽粒生育酚功能基因奠定了基礎(chǔ)。

在差異表達(dá)基因中（圖4），12號(hào)染色體候選基因Glyma.12G014200與Glyma.12G014300分別編碼生育酚o-甲基轉(zhuǎn)移酶與γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶，這2種酶均是大豆生育酚合成過(guò)程關(guān)鍵酶，且2個(gè)基因在“鄭92116”與“齊黃30”籽粒不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量存在差異；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Glyma.12G014200在“鄭92116”籽粒 T2～T4發(fā)育時(shí)期表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，而在“齊黃30”籽粒發(fā)育不同時(shí)期沒(méi)有明顯變化，Glyma.12G014300則在“鄭92116”籽粒T5發(fā)育時(shí)期表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上升，而在“齊黃30”籽粒發(fā)育不同時(shí)期無(wú)明顯變化。可見，Glyma.12G014200與Glyma.12G014300可能在大豆生育酚合成代謝過(guò)程中具有重要作用。

18號(hào)染色體候選基因Glyma.18G141100編碼尿黑酸茄尼酯轉(zhuǎn)移酶（homogentisate solanesyltransferase，HST），該酶是一種尿黑酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（homogentisic aicd phytyl transferase，HPT），亦是大豆生育酚合成過(guò)程關(guān)鍵酶，分析該基因在不同大豆品種中差異表達(dá)，其在鄭92116的T3發(fā)育時(shí)期存在上升表達(dá)，而在齊黃30中沒(méi)有明顯變化（圖4），可見，該基因?qū)τ诖蠖股雍铣梢嗑哂兄匾饔谩?/p>

圖4 大豆12號(hào)、18號(hào)和19號(hào)染色體生育酚候選基因Fig.4 Candidate gene for soybean tocopherol on chromosomes 12，18 and 19

除上述候選基因外，本研究還發(fā)現(xiàn)（圖2、3），在大豆5、8號(hào)等染色體存在多個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因中有的參與大豆籽粒脂肪合成或分解代謝過(guò)程，有的屬于轉(zhuǎn)錄因子。由于大豆生育酚屬于脂溶性維生素，因而其含量與籽粒脂肪含量密切相關(guān)，又因轉(zhuǎn)錄因子類基因具有調(diào)控下游一系列相關(guān)基因的強(qiáng)大功能，故本研究認(rèn)為，這些候選基因?qū)τ谔岣叽蠖棺蚜Ｉ雍恳簿哂兄匾饬x。

3 討論

已有報(bào)道證實(shí)，大豆籽粒生育酚含量屬多基因控制數(shù)量性狀，發(fā)掘控制其遺傳位點(diǎn)及相關(guān)基因是實(shí)現(xiàn)其遺傳改良的重要途徑[13，15]。然而，到目前為止，關(guān)于大豆籽粒生育酚含量遺傳位點(diǎn)與候選基因發(fā)掘研究較少[16-17，21-25]，挖掘的相關(guān)遺傳位點(diǎn)及候選基因遠(yuǎn)不能滿足分子遺傳改良需求。鑒于此，本研究利用大豆重組自交系群體，通過(guò)鑒定其籽粒生育酚含量，結(jié)合群體SNP遺傳圖譜，開展生育酚組分及其總量遺傳位點(diǎn)發(fā)掘研究，同時(shí)結(jié)合團(tuán)隊(duì)已有的RIL群體親本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選相關(guān)基因，共檢測(cè)到7個(gè)QTLs可同時(shí)控制多個(gè)生育酚組分及其總量，并篩選到多個(gè)可參與大豆生育酚合成代謝途徑相關(guān)基因，為實(shí)現(xiàn)大豆籽粒生育酚含量分子遺傳改良提供了選擇標(biāo)記及基因資源。

通過(guò)比較本研究結(jié)果與前人報(bào)道遺傳位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，18號(hào)染色體QTL qTOC-G的連鎖標(biāo)記ss715629930（物理位置 21 908 634）與 Sui等[17]發(fā)現(xiàn)的δ-生育酚連鎖標(biāo)記 Satt303（物理位置21 906 039）僅相距2 595 bp，并且Sui等[17]還發(fā)現(xiàn)，Satt303標(biāo)記與大豆生育酚環(huán)化酶（tocopherol cyclize，TC）連鎖，而該酶是在大豆生育酚合成過(guò)程中，將中間前體物質(zhì) MPBQ（2-甲基-6-植基-1，4-苯醌）和DMPBQ（2，3-二甲基-5-植基-1，4-苯醌）經(jīng)環(huán)化反應(yīng)，催化形成δ-生育酚或γ-生育酚的關(guān)鍵酶。由此可見，18號(hào)染色體qTOC-G對(duì)于提高大豆籽粒δ-生育酚及其占比以及總生育酚含量有重要意義。同時(shí)，13號(hào)染色體qTOC-F與Sui等[17]報(bào)道的大豆總生育酚QTL部分重疊，其中連鎖標(biāo)記Satt657（物理位置39 735 278）恰好位于本研究定位的qTOC-F區(qū)間內(nèi)，與qTOC-F兩端標(biāo)記物理位置分別相距約145和176 kb。另外，本研究5號(hào)染色體QTL qTOC-A1與Shaw等[24]報(bào)道的δ-生育酚和總生育酚QTL標(biāo)記Satt174物理位置相距約947 kb。

除上述與前人研究物理位置相近QTLs外，本研究還定位到4個(gè)新QTLs，分別位于7、8、12和19號(hào)染色體。其中，8號(hào)染色體qTOC-A2物理位置在43.89～45.92 Mb，而前人報(bào)道的8號(hào)染色體控制大豆生育酚QTLs物理位置分別在0.18[22]、5.18[24]和36.36 Mb[16]，與本研究qTOC-A2物理距離較遠(yuǎn)。并且，本研究12號(hào)染色體qTOC-H物理位置在0.98～1.38 Mb，而前人報(bào)道的12號(hào)染色體QTLs物理 位 置 分 別 在 13.42～15.14[23]、17.12[16]、32.04～33.41[23]、36.57 Mb等[24]，距本研究qTOC-H較遠(yuǎn)；而且，本研究還在qTOC-H區(qū)間篩選到編碼大豆生育酚o-甲基轉(zhuǎn)移酶與γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶的候選基因Glyma.12G014200與Glyma.12G014300，這 2個(gè)基因在供試RIL親本間存在表達(dá)差異（圖4）。由此可見，12號(hào)染色體qTOC-H及其2個(gè)候選基因在大豆生育酚合成過(guò)程中發(fā)揮著重要功能。

另外，通過(guò)分析前人已獲得的19號(hào)染色體大豆生育酚QTLs發(fā)現(xiàn)，其物理位置分別在2.27～5.41[23]、8.75 ～20.71[23]、34.35 ～34.76[3]、37.04[16]、45.12 ～47.07 Mb[23]，連鎖性狀包括α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及總生育酚，而本研究在19號(hào)染色體0.51～0.81 Mb區(qū)間定位到1個(gè)新的可控制α-生育酚及其占比QTL（qTOC-L），并且在該QTL區(qū)間篩選到多個(gè)在RIL群體親本間存在表達(dá)量差異的候選基因。綜上，本研究獲得的大豆籽粒生育酚遺傳位點(diǎn)及其候選基因，豐富了現(xiàn)有大豆生育酚控制位點(diǎn)與基因，為進(jìn)一步開展生育酚遺傳改良與機(jī)制解析奠定了重要基礎(chǔ)。