徐君， 李婷， 胡敏駿， 蔣玉根， 閆慧莉， 許文秀，虞軼俊， 何振艷*

（1.杭州市富陽區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，杭州 311400；2.中國科學(xué)院植物研究所，北方資源植物重點實驗室，北京 100093；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.浙江省耕地質(zhì)量與肥料管理總站，杭州 310000）

鎘（cadmium，Cd）是一種劇毒的重金屬，半衰期為10～30年，可通過食物鏈在人體中富集，危害人類健康[1]。我國農(nóng)用地鎘污染現(xiàn)狀不容樂觀，2020年《中國生態(tài)環(huán)境狀況公報》提出，影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量的主要污染物是重金屬，其中鎘是首要污染物。水稻（Oryza sativa L.）是我國主要糧食作物之一[2]，在生長過程中易從土壤中吸收鎘，長期食用鎘污染的大米會導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題[3]。

鎘低積累水稻品種的選育可有效降低水稻籽粒鎘污染風(fēng)險，實現(xiàn)鎘污染土地上的水稻安全生產(chǎn)，常用的方法包括常規(guī)選育和分子標(biāo)記輔助選育[4]。常規(guī)選育基于不同品種的籽粒鎘積累表型進行篩選，其過程耗時長，易受到環(huán)境因素影響，表型穩(wěn)定性差。分子標(biāo)記輔助選育利用與鎘積累性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記或功能標(biāo)記，對鎘積累性狀進行間接選擇，再結(jié)合常規(guī)育種手段培育新品種。分子標(biāo)記輔助選育具有高效、準(zhǔn)確、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點，提升了篩選的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，可降低育種成本[5]，是目前鎘低積累水稻品種選育的主要方法之一。

目前報道的籽粒鎘積累相關(guān)分子標(biāo)記包括Tons和OsHMA3[4]。王天抗等[6]基于珞紅4A的7號染色體缺失片段處的插入序列（Tons）開發(fā)了分子標(biāo)記，并利用開發(fā)的Tons分子標(biāo)記檢測體系從珞紅4A與IR28雜交F2群體的后代中篩選到低鎘新材料Tonys。Takahashi等[7]以O(shè)sHMA3為分子標(biāo)記從2個粳稻品種雜交衍生的F5世代篩選到鎘污染修復(fù)水稻材料Akita110。黃湘桂等[8]以O(shè)sHMA3作為分子標(biāo)記，創(chuàng)制了基于創(chuàng)5S（C5S）背景的包含抗稻瘟病雙基因和鎘低積累基因OsHMA3的3基因聚合系。水稻籽粒鎘積累性狀是多基因控制的數(shù)量性狀，現(xiàn)有的水稻籽粒鎘積累相關(guān)分子標(biāo)記遠不能滿足鎘低積累水稻品種選育的實際需求。隨著全基因組測序和全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）的發(fā)展，在水稻中挖掘到大量籽粒鎘積累相關(guān)QTL（quantitative trait locus）[9-11]，為水稻籽粒鎘積累相關(guān)基因的篩選與分子標(biāo)記的開發(fā)提供了重要參考。

分子標(biāo)記的開發(fā)主要基于Southern雜交、PCR技術(shù)和測序技術(shù)等。限制性片斷長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）標(biāo)記是以DNA/DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代分子標(biāo)記，由于檢測技術(shù)繁雜，難以應(yīng)用到大規(guī)模育種實踐[12]。基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記包括隨機擴增多態(tài) 性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）標(biāo)記[13]、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記[14]和序列標(biāo)簽位點（sequencetagged site，STS）標(biāo)記[15]等二代分子標(biāo)記，由于穩(wěn)定性差、開發(fā)費用高，發(fā)展也受到了限制。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記是基于測序技術(shù)的分子標(biāo)記[16-17]，與前兩代分子標(biāo)記相比，具有密度高、結(jié)果穩(wěn)定且可自動化分析的優(yōu)點，已成為重要的、有前景的分子標(biāo)記[18]。目前競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術(shù)在水稻分子標(biāo)記輔助育種中廣泛應(yīng)用[19-24]。KASP技術(shù)是基于已知SNP的高通量基因分型技術(shù)，可在廣泛的基因組DNA樣品中，對SNPs和特定位點上的InDels進行精準(zhǔn)的雙等位基因判斷[25-26]，在大批量樣本基因型鑒定時具有顯著優(yōu)勢[26]。

根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618—2018）[27]，農(nóng)田土壤分為優(yōu)先保護類、安全利用類與嚴(yán)格管控類，其中，優(yōu)先保護類土壤污染風(fēng)險低，對食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全一般不構(gòu)成威脅；嚴(yán)格管控類土壤污染風(fēng)險高，原則上禁止種植食用農(nóng)產(chǎn)品；安全利用類土壤可能存在不符合食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)的風(fēng)險，采取安全利用措施（如種植低積累品種）等可降低該風(fēng)險。

本實驗室前期根據(jù)水稻微核心種質(zhì)材料的籽粒鎘含量全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果鑒定到鎘轉(zhuǎn)運基因OsCd38[9]，該基因參與籽粒鎘積累過程。本研究基于OsCd38基因上的籽粒鎘積累顯著相關(guān)功能性SNP位點TagSNP-20089955開發(fā)了KASP分子標(biāo)記LCd-38，該標(biāo)記可準(zhǔn)確將不同品種分為高鎘基因型（CC）和低鎘基因型（TT）。利用LCd-38標(biāo)記篩選適合安全利用類土壤種植的低鎘水稻品種，該標(biāo)記對試驗地區(qū)不同主栽品種籽粒鎘積累特性的預(yù)測準(zhǔn)確率為100%。因此，LCd-38分子標(biāo)記可用于水稻籽粒鎘積累特性的早期預(yù)測，對鎘低積累水稻分子標(biāo)記輔助育種具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與鎘處理

供試水稻材料共85份，來源于水稻微核心種質(zhì)（mini-core collection，MCC）材料（由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供）[9]，包括38個粳稻品種、47個秈稻品種，可以較少的種質(zhì)數(shù)量代表較大的遺傳變異[28]，其中，65個水稻品種（26個粳稻品種、39個秈稻品種）用于標(biāo)記開發(fā)，剩余20個水稻品種（12個粳稻品種、8個秈稻品種）用于標(biāo)記驗證。水稻材料播種在大田，待幼苗株高15 cm時移栽至10 L塑料桶（土壤同大田）中，用硫酸鎘（3CdSO4·8H2O）處理，處理水平為0.18 mg·kg-1。

1.2 水稻籽粒樣品采集與鎘含量測定

待水稻完全成熟后，收集水稻籽粒。收集的籽粒于40℃烘干3 d，脫殼后使用冷凍混合型研磨儀MM400（德國Retsch公司）粉碎；稱取0.2 g（精確到0.000 1 g）樣品放入消煮管中，加入1 mL HNO3冷消化過夜；用遠紅外控溫式消煮爐（LWY84B型，江蘇盛藍儀器制造有限公司）200℃消解8 h，定容至15 mL，過濾至10 mL離心管中待測；以大米粉成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBWE100349，鋼研納克檢測技術(shù)公司）為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。采用電感耦合等離子質(zhì)譜儀（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）測定籽粒鎘含量，每個樣品測量3次，取3次測定的平均值作為該樣品鎘含量的最終結(jié)果。

1.3 功能性SNP位點的篩選

基于前期鑒定的鎘轉(zhuǎn)運相關(guān)基因OsCd38，利用HaploView軟件對基因序列上的35個籽粒鎘積累相關(guān)SNP位點進行連鎖不平衡分析（linkage disequilibrium，LD），以r2＞0.8為緊密連鎖指標(biāo)，篩選水稻籽粒鎘含量顯著相關(guān)的標(biāo)簽SNP位點。通過t檢驗分析各標(biāo)簽SNP位點不同基因型對應(yīng)的籽粒鎘含量之間是否存在顯著性差異，選取差異顯著的SNP位點作為功能性SNP位點。

1.4 KASP標(biāo)記開發(fā)與引物設(shè)計

根據(jù)功能性SNP位點的等位變異設(shè)計KASP標(biāo)記，根據(jù)SNP位點的側(cè)翼序列設(shè)計PCR擴增引物，包括特異性正向引物F1和F2，以及通用反向引物R（表1）。等位基因特異性引物各自具有對應(yīng)于通用熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒的獨特尾部序列，F(xiàn)1尾部用6-羧基熒光素（FAM）染料標(biāo)記，F(xiàn)2尾部用六氯-6-甲基熒光素（HEX）染料標(biāo)記。引物F1與通用引物的單鏈DNA分子用于擴增SNP位點為T的片段，用酶標(biāo)儀或熒光定量PCR儀可讀取到模板中與FAM序列結(jié)合的熒光基團的熒光信號；引物F2與通用引物的單鏈DNA分子擴增SNP位點為C的片段，用酶標(biāo)儀或熒光定量PCR儀可讀取到模板中與HEX序列結(jié)合的熒光基團的熒光信號。引物序列由中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司合成。

表1 LCd-38分子標(biāo)記引物序列Table 1 LCd-38 molecular marker primer sequence

1.5 分子標(biāo)記的驗證

將浙江省杭州市富陽區(qū)的主栽水稻品種種植于安全利用類鎘污染土壤，插秧后分別采集19個水稻品種的葉片，由中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司提取基因組DNA，用引物組進行PCR擴增并檢測，確定各水稻品種分子標(biāo)記位點的基因型。待成熟后按照1.2中所述方法檢測其籽粒鎘含量，評估分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻籽粒鎘積累關(guān)聯(lián)SNP位點的鑒定

實驗室前期對水稻微核心種質(zhì)材料的籽粒鎘含量進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，從中定位到12個QTL并鑒定到1個籽粒鎘轉(zhuǎn)運相關(guān)基因OsCd38[9]。OsCd38基因序列上共有35個SNP位點，對這些SNP位點進行連鎖不平衡分析（圖1），共篩選出6個標(biāo)簽SNP位點。對6個SNP位點的不同等位基因型對應(yīng)的籽粒鎘含量進行顯著性差異分析，結(jié)果（圖1）顯示，SNP6位點不同等位基因型對應(yīng)的籽粒鎘含量之間存在顯著性差異。SNP6位于日本晴10號染色體上第20 089 955位，其核苷酸為C或T。65個水稻品種中，18個水稻品種的TagSNP-20089955位點基因型為TT，籽粒鎘含量平均值為0.143 mg·kg-1；47個水稻品種的TagSNP-20089955位點基因型為CC，籽粒鎘含量平均值為0.423 mg·kg-1（表2）。結(jié)果表明，TagSNP-20089955位點核苷酸種類為T的品種水稻籽粒鎘含量均值顯著低于該位點為C的水稻品種均值，該位點的等位變異可有效鑒別不同基因型水稻品種的籽粒鎘積累特性，可作為功能性SNP位點。

圖1 TagSNP-20089955的篩選與基因分型Fig.1 Screening and genotyping of TagSNP-20089955

表2 不同基因型水稻種質(zhì)材料的籽粒鎘含量Table 2 Grain Cd content and genotypes of different genotype rice

2.2 LCd-38分子標(biāo)記的開發(fā)與基因分型

根據(jù)設(shè)計的KASP引物，從65份水稻微核心種質(zhì)資源材料中選取10個水稻品種，其中5個品種為TT基因型，5個品種為CC基因型，利用LCd-38進行鑒定。結(jié)果（圖2）顯示，5個品種的信號點為藍色，5’末端連接FAM熒光標(biāo)簽序列的引物競爭性擴增，表明其基因型為TT；5個品種的信號點為紅色，5’末端連接HEX熒光標(biāo)簽序列的引物競爭性擴增，表明其基因型為CC；陰性對照NTC（no template control）不產(chǎn)生熒光信號。LCd-38對10個微核心水稻品種基因型鑒定結(jié)果與實驗室前期測序結(jié)果一致，表明LCd-38標(biāo)記開發(fā)成功。

圖2 LCd-38分子標(biāo)記對不同基因型水稻種質(zhì)材料的KASP分型Fig.2 KASP genotyping of different genotypes by LCd-38

2.3 LCd-38分子標(biāo)記的驗證

根據(jù)開發(fā)設(shè)計的KASP引物，選取另外20份微核心種質(zhì)庫水稻材料進行基因型分型，以20份微核心水稻品種的籽粒鎘含量平均值0.322 mg·kg-1為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果（圖3）顯示，LCd-38標(biāo)記位點可以準(zhǔn)確地聚類相同基因型的種質(zhì)材料，各信號點的熒光信號值較高。陰性對照NTC單獨聚集在一起，不產(chǎn)生熒光信號。利用基因型對材料進行分類，與籽粒鎘含量測定結(jié)果進行比對，其中7個水稻材料為低鎘基因型TT（藍色點），籽粒鎘含量平均值為0.134 mg·kg-1，所有水稻品種籽粒鎘含量均低于0.322 mg·kg-1；2個水稻材料為雜合基因型（綠色點），籽粒鎘含量平均值為0.436 mg·kg-1；11個水稻材料為高鎘基因型CC（紅色點），籽粒鎘含量平均值為0.421 mg·kg-1，所有水稻品種籽粒鎘含量均高于0.322 mg·kg-1（表3）。結(jié)果表明，該標(biāo)記能夠有效區(qū)分2種純合基因型，且能夠鑒別出雜合基因型，具有共顯性特點。此外，KASP基因型讀取時按照樣品顏色來鑒定基因型，更為方便高效[29]。

圖3 LCd-38分子標(biāo)記對水稻種質(zhì)材料籽粒鎘含量預(yù)測結(jié)果Fig.3 Results of LCd-38 markers on the grain Cd concentration of rice germplasm

2.4 利用LCd-38標(biāo)記篩選鎘低積累水稻品種

2.4.1 試驗地區(qū)主栽品種基因型與籽粒鎘含量分析 為了篩選適合試驗地區(qū)種植的鎘低積累水稻品種，利用LCd-38對當(dāng)?shù)刂髟云贩N進行基因分型。結(jié)果（圖4）顯示，5個水稻品種的LCd-38分子標(biāo)記位點為低鎘積累基因型TT，分別為嘉67、秀水121、紹糯9714、秀水14和嘉58；9個水稻品種的分子標(biāo)記位點為雜合基因型CT；5個水稻品種的分子標(biāo)記位點為高鎘積累基因型CC，分別為嘉5-258、甬優(yōu)17、甬優(yōu)217、泰兩優(yōu)217和嘉禾218。

以全部待篩選水稻品種的籽粒鎘含量平均值0.312 mg·kg-1為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合水稻品種的籽粒鎘含量與基因分型結(jié)果（表4）進行分析。結(jié)果表明，9個基因型為CT的水稻品種籽粒鎘含量范圍為0.021～0.786 mg·kg-1，變異系數(shù)達 98.66%，其中 7個水稻品種籽粒鎘含量低于0.312 mg·kg-1，2個品種籽粒鎘含量高于0.312 mg·kg-1；5個基因型為TT的水稻品種籽粒鎘含量均值為0.048 mg·kg-1，均穩(wěn)定低于0.312 mg·kg-1；5個基因型為CC的水稻品種籽粒鎘含量均值為0.672 mg·kg-1，均穩(wěn)定高于0.312 mg·kg-1。

表4 試驗區(qū)不同基因型水稻品種籽粒鎘含量Table 4 Grain Cd content and genotypes of different genotype rice in experimental area

2.4.2 試驗地區(qū)適種的鎘低積累水稻品種篩選以《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》（GB 2762—2017）[30]中規(guī)定的水稻籽粒鎘限量值0.200 mg·kg-1為標(biāo)準(zhǔn)，5個基因型為TT的水稻品種籽粒鎘含量最小值為0.017 mg·kg-1，最大值為0.066 mg·kg-1，均低于0.200 mg·kg-1；9個基因型為CT的水稻品種呈現(xiàn)出超標(biāo)與不超標(biāo)兩種情況；5個基因型為CC的水稻品種籽粒鎘含量范圍為0.265～1.059 mg·kg-1，均高于 0.200 mg·kg-1。

試驗區(qū)19個水稻品種中，SNP分子標(biāo)記位點核苷酸種類為TT的品種水稻籽粒鎘含量均值顯著低于該位點為CC水稻品種籽粒鎘含量均值（圖4）。100%的基因型為TT的水稻品種中籽粒鎘含量未超過0.312 mg·kg-1，也未超過國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)限量值0.200 mg·kg-1，100%的基因型CC的水稻品種籽粒鎘含量均高于標(biāo)準(zhǔn)0.312 mg·kg-1，也高于國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)限量值0.200 mg·kg-1。因此，嘉67、秀水121、紹糯9714、秀水14和嘉58適合在富陽區(qū)安全利用類土壤種植；嘉5-258、甬優(yōu)217、甬優(yōu)17、泰兩優(yōu)217和嘉禾218為鎘高積累水稻品種，需謹(jǐn)慎種植；雜合基因型的水稻品種的籽粒鎘積累特性介于高低積累特性之間，該標(biāo)記不適合位點為雜合基因型的水稻品種籽粒鎘積累特性鑒定。

圖4 試驗地主栽水稻品種的KASP基因分型和籽粒鎘含量Fig.4 KASP genotyping and grain Cd content of 19 rice varieties in experimental area

3 討論

水稻是我國三大主糧作物之一，稻米鎘超標(biāo)問題威脅居民食品安全。選育鎘低積累水稻品種可有效降低稻米鎘污染風(fēng)險。在常規(guī)篩選中，水稻籽粒鎘積累表型易受稻田土壤環(huán)境、水肥管理措施、氣候變化等外界環(huán)境因素的影響而不穩(wěn)定，且由小范圍試驗到大田推廣所需的時間長，因此不能滿足穩(wěn)定高效的篩選需求。分子標(biāo)記輔助選育是利用與籽粒鎘積累性狀緊密連鎖的基因設(shè)計分子標(biāo)記來進行基因型篩選，再結(jié)合常規(guī)育種方法培育新品種的技術(shù)，具有高效準(zhǔn)確且不受環(huán)境干擾的優(yōu)點。

本研究基于籽粒鎘積累轉(zhuǎn)運基因鑒定到功能性SNP位點TagSNP-20089955，該位點核苷酸種類為T的水稻品種籽粒鎘含量均值顯著低于該位點為C的水稻品種籽粒鎘含量均值。根據(jù)其基因分型設(shè)計了KASP分子標(biāo)記LCd-38用于鎘低積累水稻品種的選育。與前代分子標(biāo)記相比，KASP技術(shù)具有操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、成本較低的優(yōu)點，只需以葉片基因組DNA為模板進行PCR擴增即可，在SNP位點基因型的鑒定上已得到廣泛應(yīng)用。驗證結(jié)果顯示，KASP分子標(biāo)記LCd-38可以準(zhǔn)確地聚類相同基因型的材料。

浙江省杭州市富陽區(qū)稻田土壤鎘含量平均值高于浙江省與中國土壤鎘含量背景值，高風(fēng)險區(qū)域主要集中在城鎮(zhèn)和工礦企業(yè)周邊農(nóng)田[31-33]；部分水稻籽粒鎘含量超過了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中規(guī)定的0.200 mg·kg-1[33-34]。本研究選取富陽區(qū)安全利用類稻田為試驗地，篩選適合當(dāng)?shù)胤N植的鎘低積累水稻品種以降低籽粒鎘污染風(fēng)險。利用分子標(biāo)記LCd-38對當(dāng)?shù)刂髟云贩N進行基因分型的結(jié)果表明，該標(biāo)記可精確地將不同水稻品種分為高鎘基因型（CC）和低鎘基因型（TT）。篩選到的5個低鎘基因型水稻品種籽粒鎘含量均未超過0.200 mg·kg-1，符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)限量值，在試驗區(qū)土壤鎘污染條件下，可被列為鎘低積累水稻品種，該示例對于鎘低積累水稻材料的創(chuàng)制也具有參考價值。

水稻籽粒鎘積累性狀是多基因控制的數(shù)量性狀，其中有主效基因，也有微效基因，單一考慮某個基因的SNP位點無法實現(xiàn)對所有水稻品種籽粒鎘積累特性的準(zhǔn)確預(yù)測。基因型位點為雜合型的水稻品種籽粒鎘含量變異系數(shù)大，目前開發(fā)的分子標(biāo)記只能針對純合基因型水稻品種進行預(yù)測，無法準(zhǔn)確鑒定雜合基因型水稻品種的籽粒鎘積累特性，未來仍有待于開發(fā)更多的分子標(biāo)記，通過多標(biāo)記聯(lián)合檢測體系以實現(xiàn)不同基因型水稻品種鎘積累特性的精準(zhǔn)鑒定。