羅懌，李金強，李文云，王小柯，解璞

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴州 貴陽 550006）

柑橘果實品質(zhì)分為外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)，外觀品質(zhì)包括大小、形狀、色澤等。內(nèi)在品質(zhì)主要指糖酸含量、出汁率、可溶性固形物含量等。類胡蘿卜素的種類與含量不僅決定柑橘果實的外觀品質(zhì)，也影響其營養(yǎng)品質(zhì)和保健功能[1-2]。柑橘果實中含有豐富的類胡蘿卜素，因其在400 nm～500 nm內(nèi)有強光吸收能力，使果實呈紅色、橙色和黃色等色澤[3]。類胡蘿卜素由于含有較多的共軛雙鍵，具有抗氧化、降低癌癥發(fā)病率和抗慢性疾病等功效[4]。

柑橘類果實主要呈色色素為類胡蘿卜素和花青素[5]，其類胡蘿卜素種類約190種[6]，在果實中主要積累葉黃素，包括玉米黃素，β-隱黃質(zhì)等種類[7]。果皮是類胡蘿卜素積累的主要部位，通常果皮比果肉類胡蘿卜素含量高2.5倍～15倍[8]。研究顯示，不同種類柑橘果實成熟時類胡蘿卜素呈現(xiàn)偏好性積累，不論果皮還是果肉中類胡蘿卜素含量均是橘類最高，柑類高于雜柑類，柚類最低的規(guī)律[9-10]。類胡蘿卜素在柚果實成熟時呈現(xiàn)出不同的顏色，果肉顏色從琯溪蜜柚的白色到葡萄柚的紫紅色，顏色的差異除了與類胡蘿卜素含量的不同有關(guān)[11]，還與各種類胡蘿卜素占比不同有關(guān)，已證實番茄紅素是呈紅色的主要色素，β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素是呈黃色的主要色素[12]。在目前已知的柚種質(zhì)資源中，除了紫皮柚的果皮檢測出花青苷，大多數(shù)柚類都是依靠類胡蘿卜素呈色[13]。紅肉“琯溪蜜柚”的外果皮、海綿層及果肉因番茄紅素含量高[14]而顯紅色，“紅綿蜜柚”和“三紅蜜柚”果實中的呈色色素主要為番茄紅素與β-胡蘿卜素[15]，而黃肉“黃金蜜柚”果肉呈色成分主要為β-胡蘿卜素[16]。目前，柑橘主要類胡蘿卜素相關(guān)的研究主要集中于甜橙和寬皮柑橘等品種，對柚類果實中類胡蘿卜素的積累特征和機制還需進一步研究。

貴州地方柚資源豐富，已有研究發(fā)現(xiàn)“紅香柚”、“利王柚”和“印江紅橙”等紅肉品種，均具有果形較小、脆嫩化渣、高抗病性等優(yōu)點[17]，其成熟果肉呈紅色、粉紅色和橙色等顏色，海綿層呈深淺不同粉紅色，但并未明確其中的主要色素。為確定石阡紅橙、德江紅橙、紅香柚、印江紅橙、利王柚以及思南紅橙6個品種的果肉所含類胡蘿卜素主要種類和含量，本研究運用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對果肉中的類胡蘿卜素種類和含量進行定性定量分析，探究其顯色特征，同時對總酚和總類黃酮等活性成分[18]進行測定，結(jié)合鐵離子還原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）抗氧化能力、羥基自由基清除能力3種體外抗氧化能力測定方法，對果肉的活性成分及抗氧化能力進行綜合比較分析，以期為貴州地方柚資源的果實品質(zhì)評價和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

柚果肉樣品：供試柚果肉共6份，分別為石阡紅橙、德江紅橙、紅香柚、印江紅橙、思南紅橙和利王柚。采自貴州省6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，均于成熟期采摘。

甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、甲基叔丁基醚、二丁基羥基甲苯（butylated hydroxy toluene，BHT）抗氧化劑（均為色譜純）：德國Merck公司；標(biāo)準(zhǔn)品α-胡蘿卜素、花藥黃質(zhì)、番茄紅素、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、γ-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素、β-隱黃質(zhì)、蝦青素、β-阿樸胡蘿卜素醛、六氫番茄紅素、辣椒紅素、八氫番茄紅素、ε-胡蘿卜素、橙皮苷（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、二甘醇（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；總抗氧化能力試劑盒：江蘇科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MM 400研磨儀：弗爾德（上海）儀器設(shè)備有限公司；SHIMADZU CBM 30A超高效液相色譜：日本島津公司；6500 Quadrupole Trap質(zhì)譜儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；ML204型萬分之一天平：瑞士梅特勒托利多公司；SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：華威科創(chuàng)（武漢）科技有限公司；DW-HL538超低溫冰箱：中科美菱低溫科技股份有限公司；KQ5200DE超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 果肉樣品處理方法

在柚果實成熟期進行取樣，每個品種選取3棵樹，每棵樹各取3個整果，果肉分離混合后液氮冷凍，保存于-80℃超低溫冰箱。

1.3.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定果肉類胡蘿卜素含量

1.3.2.1 果肉類胡蘿卜素的提取

取出超低溫保存的凍干果肉，研磨至粉末狀。配制正己烷∶丙酮∶乙醇體積比為2∶1∶1的提取液，在提取液中加入體積分?jǐn)?shù)為0.01% BHT。稱取100 mg的果肉粉末，加1 mL的提取液（含體積分?jǐn)?shù)為0.01% BHT）。渦旋30s后，室溫23℃下超聲20min。4℃、12 000 r/min離心5 min，吸取上清液。重復(fù)以上步驟進行兩次提取，合并兩次上清液，液氮吹干。用200 μL（乙腈∶甲醇=3∶1，體積比）混合液 ∶甲基叔丁基醚=85∶15（體積比）復(fù)溶樣品，渦旋30 s，使目標(biāo)物質(zhì)充分溶解，超聲2 min，4℃、12 000 r/min離心2 min。過0.22 μm濾膜，后保存于棕色進樣瓶中，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析。果肉類胡蘿卜素提取試驗全程需避光處理。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取16種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶于10 mL甲醇和甲基叔丁基醚體積比為1∶1的混合溶液中，配制成0.1 mg/mL的初始濃度，分別稀釋為不同的濃度梯度，以色譜的峰面積對進樣濃度做線性回歸分析，分別建立16種類胡蘿卜素單體標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。16種類胡蘿卜素單體標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的線性方程如表1所示。

表1 類胡蘿卜素單體標(biāo)準(zhǔn)品線性方程Table 1 Linear equation of carotenoid pure standards

1.3.2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：YMC C30 柱（2 mm×100 mm，3 μm）；流速：0.8 mL/min；柱溫：28 ℃；進樣量：5 μL。

流動相A：乙腈和甲醇體積比3∶1（含體積分?jǐn)?shù)為0.01%BHT）；流動相B：甲基叔丁基醚（含體積分?jǐn)?shù)為0.01%BHT）；洗針液為甲醇；線性梯度洗脫程序：0 min，A ∶B=85 ∶15（體積比）；2 min，A ∶B=75 ∶25（體積比）；2.5 min，A ∶B=40 ∶60（體積比）；3 min～4 min，A ∶B=5 ∶95（體積比）；4 min，A ∶B=85 ∶15（體積比）；6 min，A∶B=85∶15（體積比）；大氣壓化學(xué)離子源溫度350℃，簾氣172 368.925 Pa；在6500 Quadrupole Trap質(zhì)譜儀中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測。

1.3.3 果肉總多酚提取與測定

1.3.3.1 一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取0.110 0 g一水合沒食子酸，用蒸餾水溶解、定容至100 mL，此溶液質(zhì)量濃度為1 000 mg/L；分別吸取此溶液 0、1、2、3、4、5 mL 于 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，所得一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為 0、10、20、30、40、50 mg/L。測定 765 nm吸光度，以765 nm下的吸光度為縱坐標(biāo)，一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=8.471 4X＋0.036 1，R2=0.994 1。

1.3.3.2 總多酚含量的測定

采用福林酚比色法測定植物樣品中總多酚含量[19]。取出超低溫保存的果肉，研磨至粉末狀，稱取0.300 0 g，用20 mL蒸餾水洗入25 mL容量瓶中，至100℃沸水浴中保溫30 min取出、冷卻、定容、過濾，濾液備用。吸取4 mL～6 mL濾液（加一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL），分別加入福林酚試劑1 mL及3 mL 7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至25mL，混勻，室溫（22℃）下顯色30min～60 min，測定765 nm吸光度，根據(jù)稀釋倍數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算果肉總多酚含量，公式如下。

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得多酚含量，μg；N為稀釋倍數(shù)；Vt為提取液總體積，mL；Vs為測定取液量，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 果肉總類黃酮提取與測定

參考NY/T2010—011《柑桔類水果及制品中總黃酮含量的測定》測定[20]。

1.3.5 體外抗氧化能力測定

參照總抗氧化能力試劑盒說明書方法測定FRAP、DPPH抗氧化能力和羥自由基清除能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用軟件SPSS 21.0對所有數(shù)據(jù)進行差異顯著分析及相關(guān)性分析，用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種柚成熟果肉顏色

不同品種柚成熟果肉顏色見圖1。

圖1 不同品種柚成熟果肉顏色Fig.1 Mature fruit flesh color of different pomelo varieties

不同品種柚成熟果實果肉顏色則存在一定差異，參照NY/T2435—2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南（柑橘）》[21]，觀測到思南紅橙為黃色，利王柚為橙紅色，石阡紅橙為淺粉紅色，德江紅橙為粉紅色，紅香柚和印江紅橙為紅色。6個品種果實海綿層均表現(xiàn)淡粉紅色。

2.2 不同品種柚類胡蘿卜素組分與含量差異

6份供試柚果肉類胡蘿卜素組分與含量情況見表2。

表2 不同品種柚果肉類胡蘿卜素含量Table 2 Content of carotenoids in different pomelo fresh mg/kg

由表2可知，檢測到柚成熟果肉中含有花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、γ-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素、β-阿樸胡蘿卜素醛、番茄紅素、辣椒紅素10種類胡蘿卜素。石阡紅橙果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞番茄紅素＞紫黃質(zhì)＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)＞β-胡蘿卜素；德江紅橙果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞番茄紅素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)；紅香柚果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞番茄紅素＞葉黃素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)；印江紅橙果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞番茄紅素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)；思南紅橙果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞β-胡蘿卜素＞番茄紅素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)；利王柚果肉類胡蘿卜素組分含量大小依次為γ-胡蘿卜素＞玉米黃質(zhì)＞葉黃素＞番茄紅素＞β-胡蘿卜素＞β-阿樸胡蘿卜素醛＞紫黃質(zhì)＞花藥黃質(zhì)＞辣椒紅素＞新黃質(zhì)。6個品種中含量最高的組分均是γ-胡蘿卜素，在10種類胡蘿卜素組分含量總和中占比均大于50%，是主要的呈色色素。石阡紅橙含量最少的類胡蘿卜素組分是β-胡蘿卜素，而其他5個品種含量最少的類胡蘿卜素組分是新黃質(zhì)。

2.3 不同品種柚總類胡蘿卜素、總多酚及總類黃酮含量

不同品種柚果肉總類胡蘿卜素、總多酚及總類黃酮含量結(jié)果見表3。

表3 不同品種柚類總胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮含量Table 3 Content of total carotenoids，total polyphenols and total flavonoids in different pomelo varieties

由表3可知，不同品種柚果肉總類胡蘿卜素、總多酚及總類黃酮含量不同。其中印江紅橙的總類黃酮含量最高，為482.22 mg/kg，其次為利王柚、紅香柚、德江紅橙、石阡紅橙和思南紅橙?？傤惡}卜素含量介于150.81 mg/kg～241.29 mg/kg，大小排序為思南紅橙＞印江紅橙＞石阡紅橙＞德江紅橙＞利王柚＞紅香柚?？偠喾雍看笮∨判驗榧t香柚＞德江紅橙＞印江紅橙＞利王柚＞石阡紅橙＞思南紅橙。

2.4 柚果肉抗氧化能力比較

不同品種柚果肉抗氧化能力大小參見表4。

表4 不同品種柚抗氧化能力比較Table 4 Comparison of antioxidant ability in pomelo different varieties

由表4可知，品種不同，果肉中的抗氧化能力有較明顯差異。6個品種柚果肉的FRAP抗氧化能力介于2.65 μmol Trolox/g～4.27 μmol Trolox/g，其中最強的是利王柚，其次分別是德江紅橙、紅香柚、思南紅橙、石阡紅橙、印江紅橙。DPPH抗氧化能力在1.91 μmolTrolox/g～3.25 μmol Trolox/g之間，大小排序為利王柚＞德江紅橙＞石阡紅橙＞紅香柚＞印江紅橙＞思南紅橙。羥基自由基清除率最高為利王柚，其次是紅香柚、德江紅橙、印江紅橙、思南紅橙、石阡紅橙，石阡紅橙自由基清除率最低。3種不同方法測定抗氧化能力結(jié)果較一致。

由于測定方法原理不同導(dǎo)致抗氧化能力結(jié)果有差異，為綜合評價各品種柚果肉的抗氧化能力，采用綜合抗氧化能力評價指數(shù)（antioxidant potency composite，APC）[22]來進行評定。

不同品種果肉的APC指數(shù)參見表5，6個品種果肉的APC指數(shù)介于74.91%～100.00%，利王柚最高，其次是德江紅橙、紅香柚、石阡紅橙、印江紅橙和思南紅橙。

表5 綜合抗氧化能力指數(shù)評價Table 5 Evaluation of antioxidant potency composite

2.5 抗氧化能力與總類胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮的相關(guān)性

抗氧化能力與總類胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮的相關(guān)性分析結(jié)果見表6。

表6 柚果肉抗氧化能力與總類胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮的相關(guān)性分析Table 6 Corrrelation analysis between the total antioxidant capacity and the contents of total carotenoids，total phenolic and flavonoid in pomelo

FRAP、DPPH和羥基自由基清除能力3種方法之間呈正相關(guān)，F(xiàn)RAP和DPPH在p<0.01極顯著水平正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r達0.853，F(xiàn)RAP和羥基自由基清除率在p<0.05顯著水平正相關(guān)，表明這3種抗氧化活性能力評價方法比較可靠?？傤惡}卜素含量和總多酚含量（r=0.882，p<0.01）具有極顯著正相關(guān)性，總類黃酮含量（r=0.447，p<0.05）具有顯著正相關(guān)性?？偠喾雍俊⒖傤慄S酮含量分別和FRAP值，DPPH值和羥自由基清除率為正相關(guān)，而總類胡蘿卜素與PRAP值為負(fù)相關(guān)，這可能與果肉中所含花青素有關(guān)。

3 結(jié)論

對6個品種柚果肉中的類胡蘿卜素種類進行定性定量分析，檢測到果肉中含有花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、γ-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素、β-阿樸胡蘿卜素醛、番茄紅素、辣椒紅素10種類胡蘿卜素。6個品種中含量最高的組分均是γ-胡蘿卜素，在10種類胡蘿卜素組分含量總和中占比均大于50%，是主要的呈色色素。石阡紅橙含量最少的類胡蘿卜素組分是β-胡蘿卜素，而其他5個品種含量最少的類胡蘿卜素組分是新黃質(zhì)。不同品種果肉中類胡蘿卜素含量和組分占比不同，導(dǎo)致其果肉顏色不同。檢測結(jié)果顯示，γ-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和葉黃素含量較高的思南紅橙，其果肉呈現(xiàn)黃色；紅香柚和印江紅橙番茄紅素較高，果肉呈現(xiàn)紅色。果肉抗氧化活性成分中，總類黃酮含量在55.54 mg/kg～482.22 mg/kg之間；總類胡蘿卜素含量在150.81 mg/kg～241.29 mg/kg之間；總多酚含量在0.41 mg/g～0.77 mg/g之間。FRAP、DPPH和羥基自由基清除能力等3種體外抗氧化方法對果肉的活性成分及抗氧化能力進行綜合比較分析，綜合抗氧化能力大小排序為利王柚＞德江紅橙＞紅香柚＞石阡紅橙＞印江紅橙＞思南紅橙。FRAP和DPPH抗氧化方法作用機制相同，因而兩者之間在p＜0.01水平相關(guān)性表現(xiàn)極顯著。除FRAP和總類胡蘿卜素呈負(fù)相關(guān)外，F(xiàn)RAP與總多酚和總類黃酮含量呈正相關(guān)性，DPPH和羥基自由基清除能力與總類胡蘿卜素、總多酚和總類黃酮含量呈正相關(guān)性。本研究明確了6種貴州地方紅肉柚果實的類胡蘿卜素的組分，也為其果實品質(zhì)的評價提供了科學(xué)依據(jù)，有助于地方優(yōu)良品種的開發(fā)利用。