陳東杰，于懷智，鄧秀麗，張長(zhǎng)峰，孫崇德,3

（1.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250103；2.山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250103；3.浙江大學(xué)，浙江杭州 310027）

番茄生命周期相對(duì)較短，品種類(lèi)型豐富，口感酸甜，遺傳體系較為完善，是分析果實(shí)發(fā)育、成熟、貨架保鮮、品質(zhì)保持以及遺傳基因等機(jī)制的優(yōu)良材料[1]。但番茄屬于呼吸躍變型果實(shí)[2]，生長(zhǎng)和采收期正值夏季高溫高濕季節(jié)，采后果實(shí)極易軟化腐爛，且易受多種病害侵染，不耐貯藏，從而失去商品價(jià)值和研究?jī)r(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)采摘和采后貯藏過(guò)程中的不當(dāng)操作，即使造成的損失非常微小或肉眼不可見(jiàn)，也會(huì)加速果實(shí)的軟化[3-4]。控制好采后番茄的貯藏條件對(duì)提高番茄貯藏品質(zhì)至關(guān)重要。

目前國(guó)內(nèi)外已研究涂膜保鮮技術(shù)、1-MCP 處理、低溫處理、添加抗氧化劑等[5-8]對(duì)番茄貯藏的影響，但關(guān)于濕度對(duì)番茄貯藏品質(zhì)影響的研究較少，而保持適宜的相對(duì)濕度也是控制和保持果實(shí)貯藏品質(zhì)的有效方法之一。如黃振喜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，90%～100%相對(duì)濕度貯藏環(huán)境下的棗果，個(gè)頭更加飽滿(mǎn)，脆性更高。蓋曉陽(yáng)等[10]研究得出，高濕度的貯藏環(huán)境可以減輕西葫蘆的氧化損傷，提高貯藏品質(zhì)。Mari 等[11]研究表明，85%～90%的相對(duì)濕度可以顯著降低臍橙果皮的褐變率，增加臍橙的貯藏期。

同時(shí)，為了提高應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化的能力，減少植物體內(nèi)水分的流失，大多數(shù)高等植物器官的表面都被角質(zhì)層所覆蓋[12]。角質(zhì)層作為植物的一級(jí)保護(hù)屏障，主要是由多酶復(fù)合物參與一系列酶促反應(yīng)合成的，其調(diào)控機(jī)制受基因序列SlSHINE3因子含量的影響[13-14]。Ladaniya[15]研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)能影響柑橘的保存期。郜海燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，損傷外表皮角質(zhì)層的藍(lán)莓更易發(fā)生軟化衰老。相關(guān)研究者對(duì)果實(shí)角質(zhì)層的研究表明，相對(duì)濕度的變化會(huì)影響果實(shí)表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成的變化，從而影響果實(shí)的品質(zhì)。江英等[14]研究發(fā)現(xiàn)，高貯藏濕度對(duì)于保持香梨表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分、延長(zhǎng)果實(shí)采后貯藏品質(zhì)具有正向作用。Jana 等[17]研究表明，番茄果實(shí)不同發(fā)育階段蠟質(zhì)組分的變化與角質(zhì)層蒸騰有著直接的關(guān)系。但目前在番茄貯藏方法研究中，涉及不同濕度對(duì)番茄貯藏品質(zhì)影響的文獻(xiàn)甚少。本文研究了不同貯藏濕度對(duì)番茄品質(zhì)、番茄表皮及角質(zhì)層結(jié)構(gòu)、SlSHINE3轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的影響，從基因水平探討了不同濕度對(duì)番茄貯藏品質(zhì)的影響，為番茄采后貯藏保鮮提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的‘漢蒙7 號(hào)’番茄購(gòu)買(mǎi)于濟(jì)南市七里堡蔬菜批發(fā)市場(chǎng)。番茄采摘后4 ℃冷藏車(chē)運(yùn)送至國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心。挑選成熟度一致、形狀均勻、無(wú)病蟲(chóng)、無(wú)機(jī)械損傷的番茄。

檸檬酸、檸檬酸鈉、硼酸、硼砂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸，分析純，均購(gòu)買(mǎi)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；果膠酶（酶活1 000 U/mg）、纖維素酶（酶活25 U/mg），上海金穗生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，大連TaKaRa 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RX-2 智能型人工氣候培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠(chǎng)；T9S 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用有限公司；CR-400 色彩色差計(jì)，日本柯尼卡美能達(dá)控股公司；質(zhì)構(gòu)儀，TMS-TOUCH 型，美國(guó)FTC 公司；高速冷凍離心機(jī)，D-78532 型，德國(guó)Hettich 科技有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱，HZL-280 型，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共分為2 組處理，在溫度15±0.5 ℃下，將番茄在相對(duì)濕度分別為50%±5%、100%±5%的條件下貯藏18 d。每隔3 d 觀(guān)測(cè)一次番茄失水率、可溶性固形物含量、色差、質(zhì)構(gòu)、多酚氧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性、丙二醛含量以及角質(zhì)層的形態(tài)結(jié)構(gòu)、SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 失重率

隨機(jī)挑選10 個(gè)番茄，每隔3 d 測(cè)定一次總質(zhì)量并記錄，按照公式（1）計(jì)算失重率。

式中，m1為前一次稱(chēng)量的番茄總質(zhì)量，g；m2為后一次稱(chēng)量的番茄總質(zhì)量，g。

1.4.2 可溶性固形物（SSC）含量

隨機(jī)挑選6 個(gè)完好的番茄，每個(gè)番茄均勻的選取3個(gè)點(diǎn)，用藥匙取適量番茄汁滴于手持糖度計(jì)的檢測(cè)鏡上，記錄數(shù)據(jù)。按同樣的方法平行操作6 次，取平均值，單位以%計(jì)。

1.4.3 多酚氧化酶（PPO）活性

按照范三紅等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.4 過(guò)氧化物酶（POD）活性

按照王麗等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 丙二醛（MDA）含量

按照彭鷗等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.6 角質(zhì)層的提取及形態(tài)學(xué)觀(guān)察

取直徑2.5cm的圓形番茄果皮于燒杯中，加入10mL含1.5%纖維素酶、1.5%果膠酶的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH 4.0，含0.01%NAN3）。將燒杯放置在35 ℃恒溫緩慢旋轉(zhuǎn)的振蕩器中（100 r/min），酶解24 h 后取出，角質(zhì)層用蒸餾水沖洗掉表面黏附的表皮細(xì)胞及果肉，改用硼酸緩沖液（pH 9.0）清洗，以除去黏附在角質(zhì)層的酸性物質(zhì)如酚類(lèi)、脂肪酸等，直到硼酸液保持澄清。最后，分離的角質(zhì)層用蒸餾水洗滌，自然晾干，貯存于1～4 ℃冰箱中備用，在電子顯微鏡下觀(guān)察其形態(tài)變化并拍照。

1.4.7 電鏡掃描角質(zhì)層成分分析

取10 mL 的2.5%戊二醛固定液，加入采樣瓶中，用鑷子撕下一塊番茄表皮，用手術(shù)刀輕柔地將番茄表皮切成3 mm×5 mm 的長(zhǎng)方形，迅速放入采樣瓶中，蓋緊橡膠瓶蓋，置于4 ℃冰箱中，24 h 后取出。將處理后的番茄果皮分別用不同濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇清洗20 min，再用100%的乙醇清洗5 次，每次20 min，以保證完全脫水。之后樣品干燥1.5 h 后，在解剖鏡下將樣品用黑色導(dǎo)電膠帶固定至電鏡掃描臺(tái)上，噴金，上機(jī)觀(guān)察角質(zhì)層。

1.4.8SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平的測(cè)定

番茄SlSHINE3基因提取采用高志民等[21]的方法。提取的番茄果實(shí)RNA，在檢測(cè)合格后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其余送至青島深泉檢測(cè)公司進(jìn)行二代測(cè)序分析。qRT-PCR 反應(yīng)采 用CFX96 Real-time PCR detection Systems，按 照SYBRPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。引物信息：SlASR1 RT-F CCTGTTCCACCACAAG GACAA、SlASR1RT-RGTGCCAAGTTTACCGATTTG、SlSH INE3RT-FATGCAAAGCTGAGGAAATGTTG、SlSHINE3RT-R GATGTTTTTTGCCACACTCCAA。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用Origin 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行做圖，采用SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濕度對(duì)番茄貯藏期內(nèi)失重率的影響

番茄失水對(duì)果蔬的外觀(guān)形態(tài)與內(nèi)在組織影響較大，不利于果蔬的貯藏[22]。圖1 顯示了不同濕度對(duì)番茄貯藏期內(nèi)失重率的影響。由圖可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，貯藏在50%±5%及100%±5%貯藏濕度下的番茄的失重率都呈上升趨勢(shì)，且100%±5%貯藏濕度下的番茄失重率小于50%±5%，100%±5%貯藏濕度對(duì)番茄的保水效果較好，這可能是由于高貯藏濕度抑制了番茄表面的水分散失，從而延緩了番茄內(nèi)部水分的流失。這表明，100%±5%貯藏濕度可以減少番茄失重率，更有利于番茄的貯藏保鮮。

圖1 不同貯藏濕度對(duì)番茄失重率的影響Fig.1 Effect of different storage humidity on weight loss rate of tomato

2.2 不同濕度對(duì)番茄貯藏期內(nèi)SSC 含量的影響

由圖2 可知，在貯藏期內(nèi)，50%±5%和100%±5%貯藏濕度條件下的番茄SSC 含量均呈下降趨勢(shì)，且50%±5%貯藏濕度下番茄SSC 含量下降趨勢(shì)比100%±5%的更明顯。這表明，100%±5%貯藏濕度能夠減緩番茄SSC含量的降低。

圖2 不同貯藏濕度對(duì)番茄SSC 含量的影響Fig.2 Effect of different storage humidity on soluble solid content of tomato

2.3 不同濕度對(duì)番茄貯藏期內(nèi)PPO 活性的影響

由圖3 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，50%±5%貯藏濕度下番茄PPO 活性明顯上升，100%±5%貯藏濕度下番茄PPO 活性保持在較穩(wěn)定的水平，變動(dòng)幅度較50%±5%的??；100%±5%濕度處理下番茄中PPO 活性低于50%±5%貯藏濕度下的，可見(jiàn)100%±5%的濕度處理更能有效抑制番茄中PPO 活性，延緩番茄氧化衰老，抑制其氧化褐變。

圖3 不同貯藏濕度對(duì)番茄PPO 活性的影響Fig.3 Effect of different storage humidity on PPO activity of tomato

2.4 不同濕度對(duì)番茄貯藏期內(nèi)POD 活性的影響

由圖4 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同貯藏濕度對(duì)番茄POD 活性產(chǎn)生不同影響，貯藏到18 d，50%±5%和100%±5%貯藏濕度下番茄POD 活性差異明顯（P＜0.05），說(shuō)明不同貯藏濕度對(duì)番茄POD 產(chǎn)生影響。而在貯藏到16 d 時(shí)，不同貯藏濕度下，兩組POD 數(shù)據(jù)差異不顯著（P＞0.05）。不同濕度對(duì)番茄POD 影響需要后續(xù)深入研究。

圖4 不同貯藏濕度對(duì)番茄POD 活性的影響Fig.4 Effect of different storage humidity on POD activity of tomato

2.5 不同濕度對(duì)番茄貯藏期內(nèi)MDA 的影響

MDA 是植物組織膜過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，其含量的多少反映膜損傷的程度[20]。由圖5 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，番茄MDA 含量明顯增加，在貯藏期內(nèi)，50%±5%貯藏濕度下番茄MDA 含量高于100%±5%貯藏濕度下的。這表明，100%±5%的貯藏濕度處理可以抑制其在貯藏期間MDA 的積累，從而抑制番茄組織過(guò)氧化反應(yīng)，延長(zhǎng)番茄的貯藏期。

圖5 不同貯藏濕度對(duì)番茄MDA 的影響Fig.5 Effect of different storage humidity on MDA of tomato

2.6 不同濕度對(duì)番茄貯藏期間角質(zhì)層形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

角質(zhì)層在保持番茄果實(shí)的完整性及防止果實(shí)破裂變形等方面具有重要作用[23]。由圖6 可知，在貯藏第0 天時(shí)，番茄表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞成熟清晰且排列整齊緊湊；但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，50%±5%貯藏濕度下的番茄角質(zhì)層結(jié)構(gòu)之間的間隙逐漸增大，個(gè)別細(xì)胞破裂，細(xì)胞形態(tài)不再完整；100%±5%貯藏濕度下的番茄角質(zhì)層結(jié)構(gòu)之間的間隙略有增加，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)依舊完整，無(wú)破損現(xiàn)象。這表明，100%±5%貯藏濕度下的番茄表皮形態(tài)更加完整，防御外界環(huán)境侵害的能力更強(qiáng)，更有利于番茄的貯藏保鮮。

圖6 不同濕度下番茄角質(zhì)層形態(tài)學(xué)觀(guān)察Fig.6 Morphological observation of tomato cuticle under different humidity

2.7 不同濕度對(duì)番茄貯藏期內(nèi)番茄表皮結(jié)構(gòu)的影響

如圖7 所示，貯藏第6 天，掃描電鏡下，貯藏在100%±5%濕度下和50%±5%濕度下的番茄外表皮外觀(guān)無(wú)明顯差別。但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，貯藏到第18 天時(shí)，在100%±5%和50%±5%濕度下的番茄表皮趨于粗糙；而50%±5%濕度下的外表皮則更為粗糙。

圖7 不同濕度下番茄角質(zhì)層形態(tài)學(xué)觀(guān)察Fig.7 Morphological observation of tomato cuticle under different humidity

2.8 不同濕度對(duì)番茄貯藏期內(nèi)SlSHINE3 調(diào)控因子表達(dá)水平的影響

如圖8 所示，SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈下降趨勢(shì)，貯藏第3 天時(shí)，在100%±5%和50%±5%濕度下番茄的SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)量較低，且貯藏在50%±5%濕度表達(dá)下降更明顯，貯藏到第18 天時(shí)，貯藏在濕度100%±5%的SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平明顯高于貯藏50%的濕度,說(shuō)明不同濕度對(duì)SlSHINE3因子表達(dá)產(chǎn)生影響，因SlSHINE3因子控制果實(shí)角質(zhì)層的合成，高濕度環(huán)境下，可更有利于穩(wěn)定保持果實(shí)表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，從而延長(zhǎng)番茄貯藏周期。

圖8 不同貯藏濕度下番茄SlSHINE3 調(diào)控因子表達(dá)水平Fig.8 Expression level of SlSHINE3 regulatory factors in tomato under different storage humidity

3 結(jié)論

50%±5%貯藏濕度下番茄的可溶性固形物含量可以得到明顯的提升，但不適宜長(zhǎng)期貯藏。而100%±5%貯藏濕度條件下的番茄可溶性固形物含量更加穩(wěn)定，失重率較小，延緩了SlSHINE3調(diào)控因子表達(dá)水平的下降，同時(shí)能夠更好地保持番茄的外觀(guān)和結(jié)構(gòu)形態(tài)，降低貯藏過(guò)程中MDA 含量及PPO 活性，延緩果實(shí)的軟化衰老?？傊?，該條件濕度不論是短期貯藏還是長(zhǎng)期貯藏，都更有利于番茄果實(shí)貯藏品質(zhì)的保持。