李慧萍， 甘雅楠， 韓慶慶， 姚 丹， 陳 佳， 張明旭， 何傲蕾， 張金林， 趙 祺

(蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室， 蘭州大學(xué)草地微生物研究中心， 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院， 甘肅 蘭州 730020)

磷元素是所有生命體必需的元素之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中必不可缺。全球土壤平均磷含量約為0.04%。其中，80%～90%與土壤中的Ca2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+和Al3+結(jié)合，形成了無效態(tài)的難溶性磷酸鹽復(fù)合物，剩余的10%～20%以緩效磷形式存在，很難被植物直接吸收利用[1-2]。此外，由于磷酸鹽礦石的不可再生特性和土壤缺磷的廣泛現(xiàn)象，導(dǎo)致磷素營養(yǎng)源已成為限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[3-4]。因此，為了解決磷素對可持續(xù)農(nóng)業(yè)的限制問題，高效利用土壤中難溶性磷是解決上述問題的重要出路。

土壤微生物不僅是土壤無機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化的媒介，還是植物營養(yǎng)元素的貯藏庫，更是土壤磷循環(huán)的中心[5-6]。植物根際蘊藏豐富的微生物資源，其中具有溶磷能力的細(xì)菌群體在生態(tài)系統(tǒng)的功能調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，這類細(xì)菌被統(tǒng)稱為溶磷細(xì)菌(Phosphate solubilizing bacteria，PSB)。PSB能夠通過酸化作用、螯合作用、交換反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖酸等物質(zhì)，將土壤中不可溶的磷轉(zhuǎn)化為植物根系可吸收利用的磷，來滿足植物生長對磷的需求[7-8]。此外，研究表明PSB還能通過提高生物固氮效率，增強其他微量元素(如鐵，鋅)的有效性以及產(chǎn)生植物激素來促進(jìn)植物生長[8-9]，或產(chǎn)生鐵載體、抗生素和氰化物等物質(zhì)來減緩或抑制病原微生物的活動，保護(hù)植物免受土傳病原體的侵害[8]。因此，PSB與植物的相互作用對于提高作物產(chǎn)量和維持土壤肥力具有很大的實用價值。假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和根瘤菌屬(Rhizobium)的菌株通常是具有強溶磷能力的主要PSB[8,10-11]；還有研究表明，PSB菌株在沙雷氏菌(Serratia)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、黃桿菌(Flavobacterium)、葉桿菌(Phyllobacterium)、紅球菌(Rhodococcus)、固氮菌(Azotobacter)、黃單胞菌(Xanthomonas)、腸桿菌(Enterobacter)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、歐文氏菌(Erwinia)、大腸埃希菌(Escherichia)和微球菌(Micrococcus)等屬少量分布[8,10,12]。

祁連山位于青藏、黃土和蒙新三大高原交匯地帶，是我國西部生態(tài)安全屏障的重要組成部分[13]。該地區(qū)氣候類型多變、輻射強、高寒、缺氧、植被類型豐富多樣且空間分布差異明顯[13]。青海云杉(Piceacrassifolia)是祁連山典型森林生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢喬木建群種之一[14]。近年來，有關(guān)祁連山地區(qū)土壤養(yǎng)分特征、群落結(jié)構(gòu)和微生物多樣性已有較多研究[15-17]。草地生態(tài)系統(tǒng)和森林生態(tài)系統(tǒng)作為祁連山主要的生態(tài)系統(tǒng)，自然條件下,其草地牧草和森林植被的磷素營養(yǎng)很大程度上依賴于土壤微生物對磷的周轉(zhuǎn)[18]。PSB所具備的生理生化特性能使土壤中可利用態(tài)磷素更豐富，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)容易被宿主植物吸收，從而促進(jìn)植物的生長。近年來，已有學(xué)者使用微生物分離培養(yǎng)的方法,對祁連山生境中PSB菌株的溶磷能力進(jìn)行了研究[18]，但關(guān)于該生境中的PSB菌株與植物互作方面的相關(guān)報道較少。白三葉(TrifoliumrepensL.)作為我國西北地區(qū)的優(yōu)質(zhì)牧草資源，營養(yǎng)價值豐富、產(chǎn)量高、品質(zhì)好。同時，其地上部莖葉繁茂，匍匐莖節(jié)較多，可扎根固定在土壤表面，能夠有效防止水土流失，并對鹽堿脅迫也有一定的耐受性，有利于其生態(tài)建設(shè)?？梢?，白三葉的培育和生產(chǎn)對于我國西北地區(qū)草牧業(yè)發(fā)展尤為重要[19]。因此，本研究使用選擇性培養(yǎng)基，對祁連山云杉林土壤中的PSB菌株進(jìn)行分離，分析評價從上述土壤所分離菌株的分類地位和溶磷性能。進(jìn)一步采用盆栽試驗研究其中四株P(guān)SB菌株對白三葉生長的影響，以期為研發(fā)應(yīng)用于牧草栽培的微生物菌肥提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

供試土樣收集自甘肅境內(nèi)河西走廊南側(cè)的祁連山(38°15′47″ N，99°32′32″ E，海拔2 750 m)林下，采樣地優(yōu)勢植被類型為青海云杉林。隨機(jī)選取5個采樣地，去除地表苔蘚層、枯落物和有機(jī)質(zhì)層，用五點取樣法對每個樣地進(jìn)行取樣，采集土層深度為10 cm的土樣。將采集的土樣放置于無菌離心管中，并于4℃便攜式小冰箱中保存，帶回實驗室立即進(jìn)行溶磷細(xì)菌的分離。

1.2 PSB菌株的分離

稱取10 g土樣于100 mL 0.9% 氯化鈉溶液的錐形瓶中，放置25℃、150 r·min-1搖床中振蕩30 min，然后靜置1 h，將土懸液上清緩慢倒入無菌離心管中，5 000 r·min-1離心8 min。離心完成后棄除大部分上清液，重懸剩余部分，吸取10 mL重懸液至滅菌離心管，由此得到10-1的土懸液。取10-1的土懸液1 mL至9 mL 0.9%的無菌氯化鈉溶液得到10-2的土懸液，依此逐級稀釋至10-6。然后，分別取100 μL稀釋后的溶液涂布于難溶性無機(jī)磷固體培養(yǎng)基(National botanical research institute phosphorus，NBRIP)：[葡萄糖 10 g·L-1，磷酸鈣5 g·L-1，氯化鎂5 g·L-1，七水硫酸鎂 0.25 g·L-1，氯化鉀 0.2 g·L-1，硫酸銨0.1 g·L-1，瓊脂 15 g·L-1，pH值(7.0±0.2)]。置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。待培養(yǎng)基上菌落形態(tài)清楚可見，挑取在培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯透明圈的單菌落于NBRIP液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，并收集菌液，再次劃線純化。最后將純化后的菌株，加入甘油保存于-80℃超低溫冰箱。

1.3 PSB菌株的分子生物學(xué)鑒定

PSB菌株基因組DNA的提取方法參照趙祺[20]及李惠茹[21]。使用細(xì)菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 擴(kuò)增菌株16S rRNA基因序列。PCR擴(kuò)增體系：Taq預(yù)混酶(5 U·μL-1)10 μL，正向引物 27F(10 pmol·μL-1)0.5 μL，反向引物 1 492R(10 pmol·μL-1)0.5 μL，模板(細(xì)菌基因組DNA)0.5 μL，去離子水8.5 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物送北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司測序。通過EzTaxon(https://www.ezbiocloud.net/apps)和Genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)在線數(shù)據(jù)庫比對分析上述測序得到的16S rRNA基因序列。使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時使用Kimura的雙參數(shù)模型計算進(jìn)化距離，用bootstrap進(jìn)行檢驗，并重復(fù)1 000次。

1.4 PSB菌株溶磷能力分析

將初篩得到的PSB菌株劃線于TSA(15 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1大豆蛋白胨，5 g·L-1氯化鈉，瓊脂 15 g·L-1，pH值(7.3±0.2)平板上，待培養(yǎng)基上菌落形態(tài)清楚可見。挑取單菌落于TSA液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，離心收集對數(shù)生長期的菌體。用無菌生理鹽水洗滌對數(shù)生長期的菌體3次后，重懸菌體，并將菌懸液的OD600調(diào)至0.8。取10 μL菌懸液點于NBRIP平板上，并按1%的接種量接種至NBRIP液體培養(yǎng)基，每個處理設(shè)置6個重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)。每隔24 h觀察菌株的生長及溶磷情況，并用游標(biāo)卡尺測量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)，根據(jù)D/d比值的大小來初步判斷菌株的溶磷能力[22-23]。用鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液的可溶性磷含量[24-25]。

1.5 PSB菌株對白三葉生長的影響

選取菌株LT-4，LT-T17，LT-A20和F1-P7開展促生試驗。首先選取一批籽粒飽滿和色澤形態(tài)一致的白三葉種子(cultivar Huia，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈)，并用70%的乙醇表面消毒1 min。然后用2%次氯酸鈉消毒10 min后，用無菌水漂洗10次，洗滌過程中不斷攪動。將表面消毒完全的種子浸泡在無菌水中，置于4℃冰箱春化24 h后平鋪于培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)。種子種植和生長均在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室植物生長室進(jìn)行，培養(yǎng)條件如下：溫度為(28±2)/(23±2)℃(白天/黑夜)，光照周期為14 h/10 h(光照/黑暗)，光強度為800 μmol·m-2·s-1，相對濕度為(70±10)%。待種子長出子葉后，挑取萌發(fā)整齊的種子移入滅菌蛭石中，并在生長10天后進(jìn)行間苗，每盆留1株長勢一致的白三葉幼苗。對每株幼苗莖基部接種2 mL OD600=0.8的菌懸液，同時接種等量的無菌生理鹽水和大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)作為空白和陰性對照。接菌20天后取樣，用刻度尺測量株高和根長；用稱重法測定植株鮮干重；葉綠素含量和根系活力測定方法參考He等[26]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)及差異顯著性檢驗，并采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSB菌株的篩選及溶磷能力定性分析

以菌株在NBRIP平板上是否產(chǎn)生明顯、清晰的溶磷圈為篩選依據(jù)，初步獲得12株具有溶磷能力的菌株(圖1)。純化初篩獲得的菌株，對其溶磷特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上述PSB菌株在NBRIP固體培養(yǎng)基中的生長特性和溶磷能力存在顯著差異(P<0.05)(表1)。結(jié)果顯示，12株P(guān)SB菌株的菌落直徑、溶磷圈直徑和D/d的比值范圍分別為0.54～0.70，0.84～1.67和1.44～2.40。其中，菌株LT-0的菌落直徑最大，F(xiàn)1-P7次之，LT-N17的菌落直徑最小。與之對應(yīng)的菌落直徑分別為：0.70 cm，0.68 cm和0.54 cm。溶磷圈直徑最大的為菌株LT-0，F(xiàn)1-P7次之，LT-A18最小，其值分別為：1.67 cm，1.56 cm和0.84 cm。菌株LT-0的D/d比值最大，F(xiàn)1-P7次之，LT-A18最小，其值分別為：2.40，2.28和1.44。此外，菌株LT-2和菌株LT-4的菌落直徑比較接近，兩者無顯著差異，且溶磷圈直徑及D/d的比值也無顯著差異。

圖1 PSB菌株的NBRIP平板初篩結(jié)果

表1 12株P(guān)SB菌株的溶磷能力定性分析(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n =6)

2.2 PSB菌株的16S rRNA基因序列分析

根據(jù)16S rRNA基因序列的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示篩選獲得的12株P(guān)SB菌株均屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)。表2和圖2分別是基于16S rRNA基因序列的相似度比對結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹。其中，與菌株LT-2和LT-4的16S rRNA基因序列比對相似度最高的典型菌株皆為假單胞菌屬的Pseudomonasyamanorum8H1T；系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，菌株LT-2和LT-4與Pseudomonasyamanorum8H1T的親緣關(guān)系最近。菌株LT-A11，LT-N11，LT-N17和LT-A18均與假單胞菌屬的典型菌株P(guān)seudomonassilesiensisA3T的16S rRNA基因序列相似度最高；基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，這四株菌均與PseudomonassilesiensisA3T的親緣關(guān)系最為相近。菌株LT-0的16S rRNA基因序列比對相似度與PseudomonasluteolaKS0921T最高；系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，菌株LT-0與PseudomonasluteolaKS0921T位于同一分支，兩者親緣關(guān)系最近。菌株F1-P7的16S rRNA基因序列相似度與Pseudomonasbrassicacearumsubsp.neoaurantiacaCIP 109457T最高；系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，菌株F1-P7與Pseudomonasbrassicacearumsubsp.neoaurantiacaCIP 109457T位于同一分支，兩者親緣關(guān)系最近。菌株LT-A20，LT-N10，LT-A19和LT-T17的16S rRNA基因序列相似度最高及系統(tǒng)進(jìn)化樹中親緣關(guān)系最相近的菌株均分別為PseudomonasfrederiksbergensisJAJ28T，PseudomonasmarginalisATCC 10844T，PseudomonassalomoniiCFBP 2022T和PseudomonasavellanaeBPIC 631T。因此，在菌株溶磷能力定性分析和進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，選取了D/d比值較高的4株菌株LT-0，LT-4，F(xiàn)1-P7，LT-A20及D/d比值相對較低但其分類地位與其他菌株較遠(yuǎn)的菌株LT-T17進(jìn)行下一步溶磷能力定量分析。

表2 基于16S rRNA基因序列的PSB菌株的鑒定

圖2 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 PSB菌株的溶磷能力定量分析

菌株LT-T17，LT-0，F(xiàn)1-P7，LT-4和LT-A20的溶磷能力定量分析結(jié)果如圖3所示。所有菌株在NBRIP液體搖瓶中產(chǎn)生的可溶性磷含量隨培養(yǎng)時間而顯著變化，并且48 h內(nèi)可溶性磷含量增長較快。其中，菌株LT-0，F(xiàn)1-P7和LT-4發(fā)酵液的可溶性磷在96 h達(dá)到最大值，其值分別為431.68 μg·mL-1，441.67 μg·mL-1和479.87 μg·mL-1。菌株LT-A20在144 h時，發(fā)酵液的可溶性磷含量達(dá)到峰值，其值為490.22 μg·mL-1。而菌株LT-T17培養(yǎng)液的可溶性磷含量隨時間變化的峰值現(xiàn)象不明顯，且可溶性磷含量的最大值為388.48 μg·mL-1。

圖3 5株P(guān)SB菌株在NBRIP液體培養(yǎng)基中的溶磷能力定量分析

此外，菌株在溶解難溶性無機(jī)磷酸鹽的過程中會伴隨著發(fā)酵液pH值的下降。在培養(yǎng)過程中，5株菌株發(fā)酵液的pH值隨培養(yǎng)時間的變化情況如圖4所示。其中，菌株LT-0，F(xiàn)1-P7和LT-4發(fā)酵液的pH值在24 h內(nèi)下降速度最快，pH值分別降低了2.87，2.84和2.77。隨著培養(yǎng)時間的增加，菌株LT-0，F(xiàn)1-P7和LT-4發(fā)酵液的pH值緩慢增加。但在144 h后，菌株LT-0和LT-4發(fā)酵液的pH值呈現(xiàn)下降趨勢。菌株LT-A20培養(yǎng)液的pH值在48 h內(nèi)降低了2.4，之后基本趨于穩(wěn)定。而菌株LT-T17發(fā)酵液的pH值在24 h時略有增加，之后隨培養(yǎng)時間的增長而降低，并于72 h后基本趨于穩(wěn)定。

2.4 PSB菌株對白三葉生長的影響

2.4.1PSB菌株對白三葉株高和根長的影響 基于系統(tǒng)進(jìn)化分析和菌株溶磷能力結(jié)果，對菌株LT-4，LT-T17，F(xiàn)1-P7和LT-A20接種白三葉后植株的生長效應(yīng)進(jìn)行了研究(圖5)。與空白對照相比，接種菌株LT-4，LT-T17，LT-A20和F1-P7后，白三葉株高分別增加了13.27%，3.26%，2.81%和1.35%(圖5c)，根長分別是空白對照的1.14，1.09，0.91和0.96倍(圖5 d)。接種菌株LT-4的白三葉株高的增加與空白對照相比差異顯著(P<0.05)，菌株LT-T17，F(xiàn)1-P7和LT-A20對白三葉株高和根長的增加效果與空白對照相比差異不顯著。另外與陰性對照(大腸桿菌DH5α)相比，經(jīng)菌株LT-4和LT-T17處理的白三葉株高分別增加了12.51%和2.57%(圖5c)，根長分別是陰性對照的1.07和1.02倍(圖5 d)，并且接種菌株LT-4的白三葉株高的增加與陰性對照相比也存在差異顯著(P<0.05)。經(jīng)菌株F1-P7和LT-A20處理的白三葉株高和根長與陰性對照相比差異不顯著。根據(jù)上述結(jié)果表明，接種菌株LT-4對白三葉株高增加效果顯著；接種菌株LT-4對白三葉根長的增加效果雖未達(dá)到顯著差異，但其根長在所有處理中是最長的。

圖5 不同PSB菌株對白三葉株高和根長的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n =6)

2.4.2PSB菌株對白三葉生物量積累的影響 如圖6所示，主要展示了本研究中篩選的PSB菌株對白三葉生物量積累的影響。與空白對照相比，接種菌株LT-4和LT-T17的白三葉的生物量積累增加效果較為明顯。菌株F1-P7對白三葉地上部鮮干重和地下部鮮干重的增加效果均低于空白對照。菌株LT-A20對白三葉地上部鮮重和地下部鮮重的增加效果均低于空白對照，但對白三葉地上部干重和地下部干重的增加效果均略高于空白對照。接種菌株LT-4和LT-T17后白三葉地上部鮮重分別是空白對照的1.13和1.05倍，地下部鮮重分別是空白對照的1.25和1.19倍(圖6a，6b)；地上部干重分別增加了87.01%和45.12%，地下部干重分別增加了74.83%和49.57%(圖6c，6d)。接種菌株LT-4的白三葉地上部干重和地下部干重的增加與空白對照相比差異顯著(P<0.05)。

同空白對照結(jié)果類似，經(jīng)菌株LT-4和LT-T17處理的白三葉生物量積累較陰性對照增加效果明顯。接種菌株F1-P7的處理中，白三葉地上部鮮干重和地下部鮮干重的增加均低于陰性對照。接種菌株LT-A20的處理中，白三葉地上部鮮重和地下部鮮重的增加低于陰性對照，但白三葉地上部干重增加略高于陰性對照，白三葉地下部干重的增加與陰性對照相同。接種LT-4和LT-T17的白三葉地上部鮮重分別是陰性對照的1.33和1.24倍，地下部鮮重分別是陰性對照的1.71和1.63倍(圖6a，6b)；地上部干重分別是陰性對照的1.91和1.48倍，地下部干重分別是陰性對照的1.44和1.23倍(圖6c，6d)。上述結(jié)果顯示，菌株LT-4對白三葉生物量積累的提高效果最為顯著(P<0.05)，菌株LT-T17次之；而接種菌株F1-P7和LT-A20對白三葉生物量積累無顯著提高。

圖6 不同PSB菌株對白三葉生物量積累的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n =6)

2.4.3PSB菌株對白三葉根系活力和葉綠素含量的影響 接種PSB菌株對白三葉根系活力和葉綠素含量的影響如圖7所示。接種LT-4，LT-T17，LT-A20和F1-P7后，白三葉根系活力分別是空白對照的3.09，1.75，1.72和1.24倍，是陰性對照的2.82，1.60，1.57和1.13倍(圖7a)。菌株LT-4，LT-T17和LT-A20對白三葉根系活力的增加效果與空白對照相比差異顯著(P<0.05)。但與陰性對照相比，僅菌株LT-4對白三葉根系活力的增加效果差異顯著(P<0.05)。

經(jīng)菌株LT-4，LT-T17，LT-A20和F1-P7接種處理的白三葉，葉綠素a含量分別是空白對照的1.88，1.57，1.57和1.29倍(P<0.05)，葉綠素b含量分別是空白對照的1.27，1.01，1.12和0.92倍，且菌株LT-4對白三葉葉綠素b含量的增加效果與空白對照相比差異顯著(P<0.05)。接種PSB菌株LT-4，LT-T17，F(xiàn)1-P7和LT-A20后，葉綠素a含量分別是陰性對照的1.56，1.31，1.31和1.07倍(P<0.05)，葉綠素b含量分別是陰性對照的1.41，1.12，1.24和1.02倍(圖7b)，且菌株LT-4對白三葉葉綠素b含量的增加效果與陰性對照相比差異顯著(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，菌株LT-4與空白對照以及陰性對照相比，提升白三葉葉綠素含量的效果最為顯著(P<0.05)。因此，根據(jù)PSB菌株對白三葉根系活力和葉綠素含量的影響，發(fā)現(xiàn)菌株LT-4對白三葉根系活力和葉綠素含量提高的效果最為顯著(P<0.05)。

圖7 不同PSB菌株對白三葉根系活力和葉綠素含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n =6)

3 討論

溶磷細(xì)菌(PSB)是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它的生命活動直接或間接地影響著土壤健康[25,27]。長久以來，研究者們期望從不同的生態(tài)環(huán)境中篩選到強效的PSB。祁連山作為我國西部重要的生態(tài)安全屏障，氣候多變，植被類型多樣。這種獨特而極端的生境中蘊藏著豐富的微生物資源，具有較高的研究價值[13,28]。張宇龍等[18]從東祁連山高寒草地土壤中篩選出三株具有較好溶無機(jī)磷能力的菌株。因此本研究聚焦于祁連山典型森林生態(tài)系的優(yōu)勢植被—云杉林，采用以磷酸鈣為唯一難溶性磷源的選擇性培養(yǎng)基從其生長的根際土壤中分離篩選出12株具有溶解磷酸鈣能力的菌株，經(jīng)16S rRNA基因序列的相似度比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)12株P(guān)SB均為Pseudomonas屬的菌株，與之前學(xué)者們得出PSB的優(yōu)勢菌屬是假單胞菌這一研究結(jié)果相吻合[8,10]。

PSB增溶難溶性磷的主要方式之一是通過分泌有機(jī)酸類物質(zhì)，產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)通過羥基和羧基螯合與磷酸鹽結(jié)合的陽離子，或通過釋放H+降低pH值，最終提供可溶性的磷酸鹽供有機(jī)體生長所需[18,27,29-31]。因此，在PSB發(fā)揮功能的過程中，會伴隨著pH值的下降，并且與菌株自身的溶磷能力密切相關(guān)。Pande等[32]采用磷酸三鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基，共分離鑒定出8個PSB菌株，其中3株具有較高的溶磷能力，其發(fā)酵液的可溶性磷含量在277.72～305.49 μg·mL-1之間，pH值下降到3.08～3.82之間。韓麗珍等[31]對2株具有較強溶磷能力的芽孢桿菌的溶磷機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中的可溶磷含量與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)菌株LT-4，F(xiàn)1-P7和LT-A20在培養(yǎng)6天時，發(fā)酵液的可溶性磷含量峰值在441.67～490.22 μg·mL-1之間，說明這三株菌株具有較好的溶解無機(jī)磷的能力。在這一過程中，發(fā)酵液的pH值降至5.12～4.36之間，進(jìn)一步驗證了難溶性磷增溶與pH值密切相關(guān)，且呈負(fù)相關(guān)。由上可見，本研究從祁連山云杉林下采集的土壤中，篩選到具有較強溶磷性能的PSB菌株，蘊藏著巨大的開發(fā)價值，有望為開發(fā)高效的生物溶磷菌肥提供菌種資源。

PSB作為一類優(yōu)良的根際促生菌，主要是通過增加難溶性磷的溶解，提高土壤有效磷含量，易于為植物吸收利用，從而促進(jìn)植物的生長[27]。在可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，常采用根際微生物管理的方法來提高磷對作物的生物有效性，以達(dá)到促進(jìn)農(nóng)作物生物量積累，提高其單產(chǎn)量的目的[8]。研究表明，無論是盆栽還是田間試驗，接種溶磷微生物都可以促進(jìn)植物生長和提高農(nóng)作物產(chǎn)量[12,24,29,32-33]，如李玉娥等[29]發(fā)現(xiàn)在盆栽條件下接種具有溶磷能力的解淀粉芽孢桿菌LM12和LM18后，苜蓿(Medicagosativa L.)株高分別增加43.9%和19.0%，干重分別增加24.5%和29.6%。關(guān)于PSB菌株對農(nóng)作物的促生已有較多研究，但對牧草促生方面的相關(guān)報道較少[12,24,29,34]。呂俊等[12]從貴陽市花溪區(qū)馬尾松人工林中篩選出1株溶磷效果最優(yōu)的菌株Burkholderiasp．WJ27，其接種劑能夠分別提高馬尾松(PinusmassonianaL.)幼苗地上部鮮重，干重和根系鮮重，干重44.7%，60.0%，158.3%和100.0%。本研究獲得的PSB菌株中LT-4可顯著提高白三葉的株高、根長和鮮干重。接種LT-4的白三葉，其根系活力和葉綠素含量也得到顯著增加，由此可知，接種菌株LT-4能顯著促進(jìn)白三葉根系發(fā)育以及提升其光合作用能力，最終表現(xiàn)為植物的生物量積累。這也驗證了呂俊等[12]的研究結(jié)果，即PSB菌株的溶磷能力和促生效果之間存在一定的相關(guān)性。此外，溶磷能力和促生效果的相關(guān)性還可能來源于菌株LT-4分泌的有機(jī)酸類物質(zhì)，其將不溶性的磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)供植物生長所需，菌株LT-4分泌的有機(jī)酸種類及相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，PSB菌株LT-4對其他牧草的促生穩(wěn)定性和復(fù)合接種效果也需進(jìn)一步展開試驗進(jìn)行驗證。然而在本研究中發(fā)現(xiàn)篩選獲得的同屬不同種的PSB菌株F1-P7和LT-A20也具有較好的溶磷能力，但對白三葉的生長無明顯促生效果。正如Taurian等[35]研究結(jié)果，菌株J157可以產(chǎn)生較大的溶磷圈，但對花生(ArachishypogaeaL.)產(chǎn)量沒有明顯的影響。這可能與菌株的遺傳變異的多樣性以及對宿主的選擇性密切相關(guān)，這也是植物與微生物相互作用的研究熱點，尚待于進(jìn)一步從分子機(jī)制和生理機(jī)制深入挖掘。

4 結(jié)論

從祁連山云杉林下采集的土樣中共分離篩選到12株P(guān)SB菌株，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明這12株P(guān)SB菌株都屬于假單胞菌屬。通過溶磷定量分析后，獲得了5株具有較好溶磷能力的菌株(LT-A20，LT-4，F(xiàn)1-P7，LT-0和LT-T7)。接種牧草白三葉結(jié)果表明，菌株LT-4和LT-T17皆可促進(jìn)白三葉的生長，以菌株LT-4效果最佳。本研究獲得的菌株LT-4因其所具有的高溶磷性能和強促生效應(yīng)可作為開發(fā)栽培牧草專用微生物菌劑或菌肥的菌種資源。