張建國(guó) 羅學(xué)剛

(1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 四川綿陽(yáng) 621010； 2. 西南科技大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院 四川綿陽(yáng) 621010)

核能的廣泛應(yīng)用、鈾礦的開(kāi)采以及鈾尾礦維護(hù)過(guò)程形成了不同賦存形態(tài)的含鈾廢水。含鈾廢水的環(huán)境泄露會(huì)損害身體健康、威脅生命安全。因此，對(duì)含鈾廢水的治理備受關(guān)注[1-3]。鈾的形態(tài)不僅與環(huán)境化學(xué)組成有關(guān)，也與pH值關(guān)系密切，鈾在堿性水體條件下主要以UO2(CO3)22-，UO2(OH)3-等陰離子形態(tài)存在[4-6]，而在酸性條件下主要以UO22+，(UO2)3(OH)5+等陽(yáng)離子形態(tài)存在[7-8]。目前，含鈾廢水的治理研究主要集中在物理化學(xué)和生物技術(shù)方法方面。生物富集是生物技術(shù)方法中的一種重要方式。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)活體生物進(jìn)行鈾富集的研究成果，但關(guān)于堿性條件下鈾的富集報(bào)道較少[1]。具有富集堿性水體鈾的生物篩選有利于拓寬生物修復(fù)應(yīng)用范圍。水網(wǎng)藻(Hydrodictyonreticulatum)是一種少見(jiàn)的大型網(wǎng)片狀能自由漂浮的淡水綠藻，具備容易采集的特征。水網(wǎng)藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低且生境廣泛，便于大規(guī)模培養(yǎng)，能廉價(jià)獲得以滿足應(yīng)用需求。已有文獻(xiàn)報(bào)道水網(wǎng)藻對(duì)重金屬污染水體有著較強(qiáng)的重金屬富集能力、耐受能力及良好的凈化效果[9-10]。1988年Rybova等[11]研究了鉈離子與水網(wǎng)藻的吸收交換；Gao等[12]研究發(fā)現(xiàn)水網(wǎng)藻對(duì)鉛離子具有很好的富集能力，每千克干重可以富集4 000 mg；林秋奇研究發(fā)現(xiàn)水網(wǎng)藻對(duì)Pb2+，F(xiàn)e3+，Cd2+等重金屬有著良好的富集能力[13]。雖然水網(wǎng)藻在重金屬富集方面有著良好的開(kāi)發(fā)前景[14]，但水網(wǎng)藻對(duì)鈾的富集研究鮮見(jiàn)報(bào)道。雖然作者在前期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)水網(wǎng)藻對(duì)鈾具有良好的生物富集能力，但對(duì)其富集機(jī)制了解不足。生物富集重金屬與其生理活性關(guān)系密切，生理活性又與其培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分關(guān)系密切，當(dāng)培養(yǎng)基組分存在差異時(shí)往往會(huì)引起培養(yǎng)最優(yōu)條件的差異從而導(dǎo)致細(xì)胞生理活性的差異[15]。生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)是描述生物細(xì)胞代謝活性的一種重要方式，也是機(jī)理分析的重要手段。本文基于BG11培養(yǎng)基優(yōu)化水網(wǎng)藻生長(zhǎng)條件，了解水網(wǎng)藻生長(zhǎng)和培養(yǎng)條件的關(guān)系；假設(shè)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)過(guò)程受到自身抑制，構(gòu)建其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，分析其抑制機(jī)理；構(gòu)建鈾脅迫對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)影響的模型，表征鈾濃度對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)影響規(guī)律。本研究可為水網(wǎng)藻富集鈾的生理機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種來(lái)源和預(yù)培養(yǎng)

供試水網(wǎng)藻采集自湖南省衡陽(yáng)市某鈾尾礦廢水溝渠中，經(jīng)分離純化獲得。將純化的水網(wǎng)藻接入含有BG11新鮮培養(yǎng)基的玻璃容器中, 將玻璃容器置于人工氣候培養(yǎng)箱 (MGC-1500HP-2, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)中進(jìn)行單種預(yù)培養(yǎng)。設(shè)定溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照/黑暗為14 h/10 h，培養(yǎng)時(shí)間約7 d。當(dāng)水網(wǎng)藻長(zhǎng)度為2～5 cm時(shí)即可作為種子。

1.1.2 鈾儲(chǔ)備液

稱取一定質(zhì)量硝酸鈾酰(238U，UO2(NO3)2·6H2O，分析純，西安鼎天化工有限公司)溶解于去離子水，適當(dāng)稀釋后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS, Agilent 7700x, Agilent Technologies, Ltd., USA)測(cè)定U的質(zhì)量濃度，然后將其稀釋調(diào)節(jié)為5 000 mg/L作為U儲(chǔ)備液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求利用鈾儲(chǔ)備液進(jìn)行調(diào)節(jié)至目標(biāo)濃度。

1.1.3 BG11培養(yǎng)基組分

90 mg/L NaNO3, 16 mg/L K2HPO4·3H2O,75 mg/L MgSO4·7H2O, 36 mg/L CaCl2·2H2O, 20 mg/L Na2CO3, 25 mg/L NaCl, 5 mg/L FeSO4·7H2O, 31 mg/L KOH 以及 1 mL/L 微量元素 (2.86 g/L H3BO3, 1.81 g/L MnCl2·4H2O, 0.222 g/L ZnSO4·7H2O, 0.39 g/L Na2MoO4, 0.079 g/L CuSO4·5H2O, 0.049 4 g/L CoNO3·6H2O)，pH值 8.35。所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的影響

每個(gè)300 mL的植物組織培養(yǎng)瓶中裝入100 mL BG11培養(yǎng)液，每瓶接入濕重為0.20±0.01 g的水網(wǎng)藻，置于人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)定溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照/黑暗為14 h/10 h，pH值8.35，分別按照以下因素梯度進(jìn)行單因素試驗(yàn)：

(1) 溫度梯度：10，15，20，25，30 ℃；

(2) 光照強(qiáng)度梯度：2 500，3 000，3 500，4 000，5 000 lx；

(3) pH值梯度： 5.98，7.01，8.01，9.04，9.98。

每個(gè)梯度試驗(yàn)5次以上重復(fù)，培養(yǎng)至48 h和72 h 時(shí)，測(cè)定水網(wǎng)藻濕重并計(jì)算其比生長(zhǎng)速率和溫度Q10(Q10表示溫度每升高10 ℃比生長(zhǎng)速率增加的系數(shù))，即Q10=(μ2/μ1)10/(T2-T1)，T和μ分別表示溫度和比生長(zhǎng)速率且T2>T1。

1.2.2 水網(wǎng)藻生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建

每個(gè)300 mL的植物組織培養(yǎng)瓶中裝入100 mL BG11培養(yǎng)液，每瓶接入濕重為0.20±0.01 g的水網(wǎng)藻。置于人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)定溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照/黑暗為14 h/10 h，培養(yǎng)18 d，間隔2 d稱其鮮重，并換算為干重。假設(shè)：(1) 水網(wǎng)藻在生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滿足且不對(duì)水網(wǎng)藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生底物抑制；(2) 無(wú)水網(wǎng)藻自身分泌物的抑制；(3) 存在自身生長(zhǎng)過(guò)程由于爭(zhēng)奪生存空間而產(chǎn)生抑制。根據(jù)假設(shè)獲得方程(1)：

(1)

式中：Cx為干水網(wǎng)藻質(zhì)量濃度(mg/L)；t為培養(yǎng)時(shí)間(h)；μmax為最大比生長(zhǎng)速率；Cx,max為干水網(wǎng)藻最大質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.2.3 鈾對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的影響

每個(gè)300 mL的植物組織培養(yǎng)瓶中裝入100 mL BG11培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)鈾質(zhì)量濃度分別為0 ，1，2 ，3，4 ，5，10，20，30 mg/L，然后每瓶接入濕重為0.20±0.01 g 的水網(wǎng)藻，置于人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)定溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照/黑暗為14 h/10 h，培養(yǎng)28 h。分別于0 ，28 h稱其鮮重，并換算為干重，計(jì)算0～28 h間水網(wǎng)藻的比生長(zhǎng)速率。每個(gè)濃度梯度5次重復(fù)，取其平均值且相對(duì)誤差小于10%。

1.2.4 水網(wǎng)藻干重與濕重的關(guān)系及比生長(zhǎng)速率計(jì)算方法

利用吸水紙吸走鮮活的水網(wǎng)藻表面水分，隨機(jī)分成質(zhì)量不等10份，烘干至恒重，以濕重為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的干重為縱坐標(biāo)作圖，擬合曲線得到干重與濕重標(biāo)準(zhǔn)曲線，mdry= 0.0128+0.2268mwet(R2=0.9987)。mdry表示水網(wǎng)藻干重(mg)，mwet表示水網(wǎng)藻濕重(mg)。

比生長(zhǎng)速率：μ=ln(mt/m0)/t

其中:mt為時(shí)間t時(shí)水網(wǎng)藻的質(zhì)量(mg),m0為起始時(shí)水網(wǎng)藻的質(zhì)量(mg)，t為間隔時(shí)間h。

生長(zhǎng)代時(shí)：tG=ln2/μ。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

未特殊說(shuō)明平行試驗(yàn)為3次重復(fù)，取其平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后，使用SPSS 20.0軟件工具進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的影響

水網(wǎng)藻比生長(zhǎng)速率與溫度關(guān)系如圖1所示。水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃，比生長(zhǎng)速率為0.193 1 g·g-1·d-1。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于25 ℃時(shí)，比生長(zhǎng)速率與溫度(T)關(guān)系服從μ=0.0087T-0.0219 (R2=0.9874，P<0 .05)，可見(jiàn)水網(wǎng)藻在高于2.6 ℃ 溫度環(huán)境就可生長(zhǎng)，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的4 ℃ 有偏差，但比較接近。2.6 ℃ 至25 ℃ 水網(wǎng)藻生長(zhǎng)溫度Q10值為 2.38(Q10表示溫度每升高10 ℃，比生長(zhǎng)速率增加的系數(shù)，可以用來(lái)描述溫度對(duì)水網(wǎng)藻的生長(zhǎng)影響程度,Q10越高,說(shuō)明溫度對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)影響越大)。一般藻類(10～20 ℃)Q10為1.8～3.5[16]。王朝暉等[15]和Hawes等[3]報(bào)道了水網(wǎng)藻在不同條件下Q10分別為 2.86和3.50，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)條件下水網(wǎng)藻對(duì)溫度的敏感度降低，但也可能與藻種有關(guān)。當(dāng)溫度超過(guò)25 ℃ 時(shí)，根據(jù)兩點(diǎn)法可以推測(cè)水網(wǎng)藻停止生長(zhǎng)的上限溫度為38 ℃，略低于文獻(xiàn)[13]報(bào)道的40 ℃。由此可見(jiàn)，水網(wǎng)藻能在較為寬泛的溫度條件下生長(zhǎng)，最適溫度為25 ℃，尤其適合鈾尾礦豐富的南方水體，為水網(wǎng)藻用于鈾尾礦修復(fù)提供了有利條件。

圖1 水網(wǎng)藻不同溫度條件下的比生長(zhǎng)速率Fig.1 Specific growth rate of H. reticulatum under different temperatures

2.2 pH值對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的影響

pH值對(duì)水網(wǎng)藻比生長(zhǎng)速率的影響見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，水網(wǎng)藻適合于堿性條件生長(zhǎng)，雖然水網(wǎng)藻在pH值6時(shí)也能夠較好生長(zhǎng)但其比生長(zhǎng)速率顯著低于pH值7～10時(shí)的比生長(zhǎng)速率(P<0.05), pH值9時(shí)水網(wǎng)藻的比生長(zhǎng)速率明顯高于其他pH值條件下的比生長(zhǎng)速率(P<0.05)，說(shuō)明水網(wǎng)藻最適pH值為9。通過(guò)圖2可以得知水網(wǎng)藻生長(zhǎng)pH值跨度寬泛，便于培養(yǎng)，適合堿性條件下鈾的富集。

圖2 水網(wǎng)藻在不同pH值條件下的比生長(zhǎng)速率Fig.2 Specific growth rate of H. reticulatum under different pH values

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的影響

不同光照強(qiáng)度對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)速率的影響結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，在光照強(qiáng)度為2 500 lx時(shí), 水網(wǎng)藻雖能較好生長(zhǎng)，但比生長(zhǎng)速率顯著低于3 000～5 000 lx光照強(qiáng)度下的比生長(zhǎng)速率。 3 000～ 5 000 lx光照強(qiáng)度下，水網(wǎng)藻比生長(zhǎng)速率差異不顯著，說(shuō)明在25 ℃時(shí),水網(wǎng)藻的光飽和點(diǎn)在3 000 lx 以上。Hawes等[3]和王朝暉等[15]的研究結(jié)果分別表明水網(wǎng)藻的光飽和點(diǎn)為3 000 lx和6 800 lx。光飽和點(diǎn)的差異，一方面和水網(wǎng)藻藻種差異有關(guān)，另一方面與溫度有關(guān)。當(dāng)溫度較高時(shí)，代謝加快，不能及時(shí)通過(guò)光照獲得物質(zhì)補(bǔ)給與能量供給，可能會(huì)導(dǎo)致水網(wǎng)藻生長(zhǎng)減緩甚至負(fù)增長(zhǎng)[15]。不過(guò)，Raven 等[17]研究表明新西蘭水網(wǎng)藻和非洲水網(wǎng)藻對(duì)光強(qiáng)要求不太高, 均適合于弱光環(huán)境，認(rèn)為水網(wǎng)藻趨向于陰生性。

圖3 水網(wǎng)藻不同光照強(qiáng)度條件下的比生長(zhǎng)速率Fig.3 Specific growth rate of H. reticulatum under different light intensities

2.4 水網(wǎng)藻生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

將式(1)按照張建國(guó)等[18]方法進(jìn)行積分，獲得方程(2)：

(2)

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)帶入式(2)進(jìn)行非線性擬合獲得水網(wǎng)藻生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cx,0，Cx,max，μmax分別為64.573 2，621.427 1，0.016 4，再帶入式(2)獲得水網(wǎng)藻生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程(3)：

(3)

利用式(3)獲得模型預(yù)測(cè)值并與實(shí)驗(yàn)值比較進(jìn)行模型驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出，模型可以較好模擬水網(wǎng)藻的生長(zhǎng)，準(zhǔn)確度可達(dá)85.51%以上。

圖4 水網(wǎng)藻生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型及其驗(yàn)證Fig.4 Growth kinetics model and its verification of H. reticulatum

從圖4可以看出，水網(wǎng)藻生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到自身生長(zhǎng)空間爭(zhēng)奪，導(dǎo)致相互抑制。當(dāng)干水網(wǎng)藻質(zhì)量濃度為621.427 1 mg/L時(shí)，水網(wǎng)藻生物量增加緩慢甚至不增加，稱為水網(wǎng)藻最大生長(zhǎng)抑制濃度，可為水網(wǎng)藻的后期研究方案設(shè)計(jì)提供參考。假設(shè)水網(wǎng)藻沒(méi)有抑制時(shí)，最大比生長(zhǎng)速率為0.016 4 g·g-1·h-1，計(jì)算獲得其代時(shí)為42.5 h。

2.5 鈾對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的影響模型

將0～28 h水網(wǎng)藻的平均比生長(zhǎng)速率與對(duì)應(yīng)鈾脅迫濃度作圖，如圖5所示。由圖5可以看出，隨著鈾濃度增長(zhǎng)，水網(wǎng)藻的比生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)先升高后降低的拋物線形式，可見(jiàn)鈾對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的影響呈現(xiàn)“低促高抑”的生物學(xué)效應(yīng)[19]?？梢哉J(rèn)為水網(wǎng)藻對(duì)鈾的脅迫響應(yīng)過(guò)程由3個(gè)部分組成：第一部分是無(wú)鈾脅迫時(shí)的比生長(zhǎng)速率P0; 第二部分是低濃度鈾(x)促進(jìn)的比生長(zhǎng)速率函數(shù)S(x)；第三部分是高濃度鈾(x)抑制的比生長(zhǎng)速率函數(shù)I(x)?；形镔|(zhì)誘導(dǎo)的低促高抑現(xiàn)象被稱為赫米斯(Hormesis)現(xiàn)象，常用式(4)表達(dá)[20-21]：

P(x)=P0+S(x)-I(x)

(4)

雖然鈾作為重金屬并非化感物質(zhì)，但是呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，因而在形式上可以采用該方程進(jìn)行描述。米氏專門構(gòu)建了米氏方程(Mitscherlich model)用以描述限制因子影響生物生長(zhǎng)的數(shù)學(xué)模型：

μ=μmax(1-exp(-c·f(i)))

(5)

式中：μ為生長(zhǎng)比速；i為限制性因子；μmax為最大比生長(zhǎng)速度；c為常數(shù)；f(i)為關(guān)于i的函數(shù)。

鈾對(duì)水網(wǎng)藻生長(zhǎng)的影響與化感物質(zhì)對(duì)生物體生長(zhǎng)的影響在本質(zhì)上都與酶的活性表達(dá)或活性抑制有關(guān), 將米氏方程(5) 引入方程(4)中的S(x)和I(x)就可以賦予方程(4)具有酶促反應(yīng)的生物學(xué)特征[22]。

Hormesis模型中引入米氏(Mitscherlich)因子后的模型描述如下：

P(x)=P0+Smax(1-exp(-ks·x))-

Imax(1-exp(-ki·x))

(6)

將P0設(shè)置為對(duì)照值，即P0=0.0066，采用最小二乘法進(jìn)行非線性曲線擬合獲得模型參數(shù)代入方程(6)，得到描述鈾對(duì)水網(wǎng)藻脅迫呈現(xiàn)的“低促高抑”方程(7)。

m=0.0066+0.0187(1-exp(-0.9563CU))-

0.0215(1-exp(-0.2978CU))

(7)

式中CU表示鈾的質(zhì)量濃度(mg/L)。

將模型預(yù)測(cè)值(如圖5中紅線所示)與實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較得到的相關(guān)系數(shù)為 0.991 4，說(shuō)明該模型能夠較好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)值。

圖5 鈾脅迫下的水網(wǎng)藻比生長(zhǎng)速率模型Fig.5 Specific growth rate model of H. reticulatum under uranium stress

3 結(jié)論

(1)水網(wǎng)藻具有2.6～38 ℃ 的模型生長(zhǎng)溫度，最適溫度為25 ℃，能夠適合我國(guó)南方水體鈾的富集；pH值 6～10水網(wǎng)藻都能較好生長(zhǎng)，且pH值 9時(shí)最適生長(zhǎng)，水網(wǎng)藻適合用于堿性條件下含鈾廢水的富集。

(2)水網(wǎng)藻的生長(zhǎng)存在藻間的相互抑制，可利用生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)模型描述，最大比速為0.016 4 g·g-1·h-1，最小代時(shí)為42.5 h。

(3)Hormesis模型中引入米氏(Mitscherlich)因子能夠描述鈾脅迫下水網(wǎng)藻呈現(xiàn)的“低促高抑”現(xiàn)象。