王綠陽(yáng)，崔雷鴻，馮江銀，洪秋霞，游美敬，保浩宇，杭蘇琴

鈣敏感受體和膽囊收縮素-1受體介導(dǎo)大豆蛋白水解物對(duì)小鼠食欲的影響

王綠陽(yáng)，崔雷鴻，馮江銀，洪秋霞，游美敬，保浩宇，杭蘇琴

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心/江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/消化道微生物研究室，南京 210095

【】探究大豆蛋白水解物（soy protein hydrolysate，SPH）對(duì)小鼠食欲的影響及其機(jī)制，以期從營(yíng)養(yǎng)角度為豬采食調(diào)控技術(shù)的研究提供新思路。利用胃蛋白酶水解大豆蛋白產(chǎn)生SPH。首先探究灌胃不同濃度SPH對(duì)小鼠短期采食量及十二指腸肽鈣敏感受體（Calcium sensing receptor，CaSR）、G蛋白偶聯(lián)受體93（G protein-coupled receptor 93，GPR93）和肽轉(zhuǎn)運(yùn)受體（Oligopeptide transporter 1，PepT1）基因表達(dá)的影響；在此基礎(chǔ)上，通過腹腔分別注射CaSR抑制劑NPS2143和外周CCK-1受體（Cholecystokinin-1 receptor，CCK-1R）抑制劑Devazepide，探究SPH是否通過CaSR-CCK- CCK-1R-下丘腦途徑抑制機(jī)體采食。灌胃1.5g·kg-1SPH顯著降低小鼠0—1 h采食量（<0.05）、顯著提高十二指腸的表達(dá)（<0.05）；與SPH組相比，SPH+NPS2143組小鼠0—1 h采食量升高，血液CCK水平降低，且均與對(duì)照組無差異（0.05<<0.5）。同時(shí)，SPH顯著降低小鼠0-1 h胃排空速率，顯著提高下丘腦厭食神經(jīng)因子POMC的基因表達(dá)（<0.05），而SPH+Devazepide組這種作用消失。但灌胃SPH對(duì)小腸傳輸速率和下丘腦促食相關(guān)因子NPY（Neuropeptide Y）和AgRP（Agoutirelated peptide）的基因表達(dá)均無影響。十二指腸CaSR介導(dǎo)SPH促進(jìn)CCK分泌，并通過外周CCK-1R延緩胃排空速率、提高下丘腦厭食神經(jīng)因子POMC（Pro-opiomelanocortin）的基因表達(dá)來抑制食欲。

大豆蛋白水解物；采食；鈣敏感受體；膽囊收縮素；CCK-1受體；下丘腦

0 引言

【研究意義】與其他營(yíng)養(yǎng)素相比，日糧蛋白質(zhì)更易引起機(jī)體的飽腹感[1]；且高蛋白飲食能夠抑制機(jī)體采食并降低體重，這可能與胃腸道對(duì)蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物的感應(yīng)有關(guān)[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，十二指腸及空腸前端分布的內(nèi)分泌I細(xì)胞分泌的CCK（cholecystokinin）是重要的內(nèi)源性飽感激素，它能夠抑制胃排空、抑制膽囊收縮等，并作為腦腸肽通過外周CCK-1受體（CCK-1 receptor，CCK-1R）將信號(hào)傳至下丘腦而抑制機(jī)體采食[3]。體內(nèi)外研究表明蛋白水解物能夠有效地刺激縮膽囊素分泌。CUBER等對(duì)豬十二指腸在體灌注酪蛋白水解物，發(fā)現(xiàn)豬血液CCK水平迅速升高[4]；此外酪蛋白水解物可刺激內(nèi)分泌細(xì)胞系STC-1細(xì)胞分泌CCK[5]。據(jù)報(bào)道，胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞（enteroendocrine cells，EECs）表達(dá)眾多G蛋白偶聯(lián)型受體（G protein-coupled receptors，GPCRs），負(fù)責(zé)感應(yīng)和識(shí)別日糧營(yíng)養(yǎng)素而介導(dǎo)胃腸激素的分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體采食[6]。其中感應(yīng)受體鈣敏感受體（Galcium sensing receptor，CaSR）和G蛋白偶聯(lián)型受體93（G protein-coupled receptor 93，GPR93）可介導(dǎo)蛋白水解物刺激STC-1細(xì)胞分泌CCK[7]。此外，位于腸上皮細(xì)胞的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體PepT1（oligopeptide transporter 1，PepT1）也可間接介導(dǎo)蛋白水解物刺激STC-1細(xì)胞分泌CCK[8]。但這些研究大多集中于細(xì)胞試驗(yàn)，而體內(nèi)的研究很少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大豆蛋白是飼料蛋白質(zhì)的主要來源之一。機(jī)體進(jìn)食大豆蛋白后，首先經(jīng)胃蛋白酶初步消化再進(jìn)入小腸被感應(yīng)、消化和吸收，而大豆蛋白對(duì)采食的影響及調(diào)控機(jī)制目前還不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選用經(jīng)胃蛋白酶水解的大豆蛋白-即大豆蛋白水解物（soy protein hydrolysate，SPH），作為大豆蛋白在體內(nèi)的生理形式，以小鼠為模型探究SPH對(duì)小鼠食欲的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年10—12月于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)基地進(jìn)行。每次試驗(yàn)結(jié)束小鼠恢復(fù)一周。

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取若干只8周齡體重相近（39.79 ± 0.23 g）的雄性ICR小鼠，單籠飼養(yǎng)，鼠房溫度（25 ± 2）℃，保持12 h光照循環(huán)；自由采食飲水，提供嚙齒動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒料。飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)符合我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。小鼠及顆粒料均購(gòu)自南京市青龍山動(dòng)物繁殖中心。

1.2 SPH的制備

根據(jù)KIM[9]的描述，將大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）（貨號(hào)：S9510，索萊寶）溶于去離子水（10 %，w/v），用2 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH= 2.0。加入豬胃蛋白酶（貨號(hào)：P8160，索萊寶）（1%，w/v），于37℃恒溫持續(xù)攪拌1 h，最后用2 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH = 7.0終止酶解反應(yīng)。將水解物置于-20℃冷凍24 h，用真空冷凍干燥機(jī)（型號(hào)：Alpha 1-2LDplus，德國(guó)CHRIST）凍干得到SPH固體粉末。SPH固體粉末可完全溶于生理鹽水。

1.3 抑制劑

抑制劑NPS2143（HY-10007）和Devazepide（HY-106301）均購(gòu)自MedChem Express（中國(guó)，上海）。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

1.4.1 試驗(yàn)一：灌胃不同濃度SPH對(duì)小鼠采食的影響 試驗(yàn)時(shí)間線如圖1-A所示。選取體重相近的小鼠隨機(jī)分為4組（n = 8），分為對(duì)照組（生理鹽水）、SPH 0.5 g·kg-1組、SPH 1.0 g·kg-1組和SPH 1.5 g·kg-1組[10]。研究上午10：00禁食，下午18：00分別灌胃2 mL生理鹽水和0.5/1.0/1.5 g·kg-1SPH。分別于18：30、19：00、20：00和22：00測(cè)定0.5/1.0/2/4 h采食量。根據(jù)采食量結(jié)果確定顯著降低小鼠采食的SPH濃度，用于后續(xù)灌胃試驗(yàn)。

1.4.2 試驗(yàn)二：SPH對(duì)小鼠十二指腸氨基酸感應(yīng)/轉(zhuǎn)運(yùn)受體表達(dá)的影響 禁食和灌胃的時(shí)間點(diǎn)與試驗(yàn)一相同。根據(jù)試驗(yàn)一的結(jié)果，選取體重相近的小鼠隨機(jī)分為2組（n = 8），分別灌胃2 mL生理鹽水和1.5 g·kg-1SPH。1 h后頸椎脫臼處死，采集十二指腸黏膜檢測(cè)感應(yīng)受體的基因表達(dá)。

1.4.3 試驗(yàn)三：CaSR抑制劑對(duì)小鼠采食的影響 試驗(yàn)時(shí)間線如圖1-B所示。選取體重相近的小鼠隨機(jī)分為4組（n = 8），分為對(duì)照組（生理鹽水）、NPS 2143組（20 mg·kg-1）、SPH（1.5g·kg-1）組和SPH（1.5g·kg-1）+ NPS 2143組（20 mg·kg-1）。NPS 2143溶于生理鹽水，并加入5 %二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）助溶[11]。上午10：00禁食，下午17：30對(duì)其中兩組灌胃100 μL生理鹽水，另外兩組灌胃100 μLNPS 2143溶液。18：00對(duì)灌胃NPS 2143兩組中的一組灌胃2 mL生理鹽水，另一組灌胃2 mL 1.5 g·kg-1SPH；灌胃生理鹽水的兩組也如此。灌胃后于18：00—19：00通過頜下靜脈每15 min進(jìn)行采血，血液收集至含有20 μL1% EDTA（v/v）的無菌1.5 mL離心管中，4 °C、3 500×離心10 min，取上清用于后續(xù)CCK濃度的測(cè)定；并于18：30、19：00、20：00和22：00測(cè)定0.5/1.0/2/4 h采食量。

1.4.4 試驗(yàn)四：CCK-1受體抑制劑對(duì)小鼠采食的影響 試驗(yàn)時(shí)間線如圖1-B所示，選取體重相近的小鼠隨機(jī)分為4組（n = 8），分為對(duì)照組（生理鹽水）、Devazepide組（600 μg·kg-1）、SPH（1.5g·kg-1）組和SPH（1.5g·kg-1）+ Devazepide組（600 μg·kg-1）。Devazepid溶于生理鹽水，并加入3 % DMSO助溶[12]。上午10：00禁食，下午17：30對(duì)其中兩組灌胃100 μL生理鹽水，另外兩組腹腔注射100 μL Devazepid溶液。其他試驗(yàn)操作同試驗(yàn)三。

1.4.5 試驗(yàn)五：CCK-1受體抑制劑對(duì)小鼠胃排空、小腸傳輸和下丘腦食欲相關(guān)因子表達(dá)的影響 禁食和灌胃的時(shí)間點(diǎn)與試驗(yàn)三相同。試驗(yàn)時(shí)間線如圖1-C所示，選取體重相近的小鼠隨機(jī)分為3組（n=8），分為對(duì)照組（生理鹽水）、SPH（1.5g·kg-1）組和SPH（1.5g·kg-1）+ Devazepide組（600 μg·kg-1）。上午10：00禁食，下午17：30對(duì)前兩組腹腔注射100 μL生理鹽水，最后一組腹腔注射100 μL Devazepide溶液。18：00對(duì)第一組小鼠灌胃2 mL生理鹽+ 0.05 %酚紅（w/v），后兩組小鼠均灌胃2 mL SPH + 0.05 %酚紅。30 min后進(jìn)行頸椎脫臼處死，5 min內(nèi)完整地取出胃腸組織置于4 ℃冰墊上。根據(jù)SHIN等的描述[13]，將胃剪碎放入5 mL 0.01 mol·L-1NaOH溶液中震蕩搖勻，并加入1 mL20 %三氯乙酸，1 050×離心10 min，取0.05 mL上清加入0.2 mL 0.5 mol·L-1NaOH，于560 nm測(cè)定吸光值，胃排空速率（%）=（1-胃殘留量/初始量）×100；取小腸并沿中線剪開，從十二指腸滴加0.01mol·L-1NaOH溶液，測(cè)量顯色部位到十二指腸前端的距離，小腸傳輸速率（%）=（1-顯色部位長(zhǎng)度/小腸全長(zhǎng)）×100；5 min內(nèi)將腦從小鼠頭骨中取出置于4 ℃冰墊上，根據(jù)小鼠腦的解剖結(jié)構(gòu)識(shí)別下丘腦區(qū)域[14]，利用無菌刀片分出下丘腦區(qū)域迅速凍存于液氮，用于食欲相關(guān)因子表達(dá)的測(cè)定。

1.5 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.5.1 血清CCK濃度測(cè)定 嚴(yán)格按照小鼠CCK ELISA試劑盒（南京奧青）說明書檢測(cè)血清中CCK的濃度。CCK試劑盒檢測(cè)濃度范圍為10—200 ng·L-1，批次間變異系數(shù) < 15%，批次內(nèi)變異系數(shù) < 9%。

1.5.2 十二指腸氨基酸感應(yīng)/轉(zhuǎn)運(yùn)受體和下丘腦食欲相關(guān)基因的表達(dá)分析 按照Trizol法（TaKaRa，中國(guó)大連）提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Master Mix（RR036A，TaKaRa，中國(guó)）將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用StepOne-Plus定量PCR儀（Thermo Scientific，USA）及StepOne軟件（version 2.2.2，Applied Biosystems）進(jìn)行熒光定量。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR Premix 10 μL，上、下引物分別為0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，無RNA酶水6.8 μL，cDNA2 μL。PCR條件為 95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。測(cè)定十二指腸、和肽轉(zhuǎn)運(yùn)體;下丘腦厭食神經(jīng)因子（）和促食神經(jīng)因子（和）。引物序列詳見表1。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行初步分析后，采用SPSS 23.0單因素方差分析模型（one-way ANOVA）中的Tukey test進(jìn)行多重比較，< 0.05代表差異顯著。結(jié)果均以平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 SPH對(duì)食欲及十二指腸肽感應(yīng)/轉(zhuǎn)運(yùn)受體基因表達(dá)的影響

如圖2所示。灌胃1.5 g·kg-1SPH顯著降低小鼠0—1 h采食量（< 0.05），但對(duì)0—2和0—4 h的采食量沒有影響，因此選取1.5 g·kg-1的濃度進(jìn)行后續(xù)灌胃試驗(yàn)。此外，1.5 g·kg-1SPH顯著提高小鼠十二指腸的表達(dá)（< 0.05），但對(duì)感應(yīng)受體和肽轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)無影響。

圖1 試驗(yàn)時(shí)間線

Control：生理鹽水；SPH：大豆蛋白水解物；“*”表示Control vs SPH且差異顯著（P<0.05）；不同字母表示差異顯著（P<0.05）。下同

表1 熒光定量PCR引物序列

2.2 CaSR抑制劑對(duì)SPH抑制采食及促CCK分泌的影響

如圖3所示。與對(duì)照組相比，SPH組小鼠0—1 h采食量顯著降低，血液15 min時(shí)的CCK水平顯著提高（< 0.05）；而SPH + NPS2143組0—1 h采食量高于SPH組（= 0.365），且與對(duì)照組無差異（= 0.282），并伴隨15 min時(shí)血液CCK水平的顯著降低（<0.05）（圖3-A，B）。進(jìn)一步通過曲線下面積（area under the cure，AUC）分析結(jié)果表明，SPH組1 h內(nèi)血液CCK分泌的總水平顯著高于對(duì)照組（< 0.05），且雖然也高于SPH + NPS2143組，但差異不顯著（= 0.255）（圖3-C）。上述結(jié)果表明CaSR參與介導(dǎo)SPH抑制小鼠采食和CCK分泌。

圖3 CaSR抑制劑對(duì)小鼠采食和CCK分泌的影響

2.3 CCK-1受體抑制劑對(duì)SPH抑制采食的影響

如圖4所示。與對(duì)照組相比，SPH組0—1和0—2 h采食量顯著降低，而SPH + Devazepide組0—1和0—2 h采食量顯著高于SPH組（< 0.05），且與對(duì)照組無差異（圖4-A）；同時(shí)，SPH組顯著降低小鼠0—1 h胃排空速率（< 0.05），而對(duì)小腸蠕動(dòng)速率沒有影響，而SPH+Devazepide組胃排空速率顯著高于SPH組（< 0.05），且與對(duì)照組無差異（圖4-B，C）。此外，灌胃SPH顯著提高下丘腦厭食神經(jīng)因子的表達(dá)（< 0.05），而注射Devazepide后這種作用消失；但SPH對(duì)促食神經(jīng)因子和的表達(dá)均無影響（圖4-D）。上述結(jié)果表明SPH抑制小鼠食欲是通過刺激分泌的CCK作用于外周CCK-1受體而抑制胃排空，并提高下丘腦厭食神經(jīng)因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

3 討論

3.1 SPH抑制小鼠食欲，提高十二指腸CaSR的表達(dá)

研究表明蛋白水解物能抑制機(jī)體采食，Sufian等[18]灌胃豬肉蛋白水解物能顯著抑制大鼠0—1 h的采食。同樣地，本研究顯示灌胃1.5 g·kg-1SPH顯著降低小鼠0—1 h采食量，但對(duì)0—2和0—4 h的采食量無影響，這表明SPH可抑制小鼠食欲。β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin，7S）和大豆球蛋白（glycinin，11S）是大豆蛋白的主要成分[19]。研究表明十二指腸灌注經(jīng)胃蛋白酶水解后的7S蛋白而非完整的大豆蛋白，能顯著降低大鼠采食量[10]，這表明SPH中抑制采食的主要成分可能是水解后的7S蛋白。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)7S中富含精氨酸的β51-63肽（Val-Arg-Ile-Arg-Leu-Leu- Gln-Arg-Phe-Asn-Lsy-Arg-Ser）是抑制食欲的關(guān)鍵活性肽[20]。

灌胃的SPH能夠首先進(jìn)入十二指腸并被該部位的營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)受體所識(shí)別，同時(shí)十二指腸也是分泌CCK的主要部位，因此筆者進(jìn)一步檢測(cè)了十二指腸肽感應(yīng)/轉(zhuǎn)運(yùn)受體的基因表達(dá)。結(jié)果顯示感應(yīng)受體的表達(dá)顯著提高，這提示CaSR可能是介導(dǎo)SPH抑制小鼠采食的關(guān)鍵受體。CaSR既可以感應(yīng)L-氨基酸（L-苯丙氨酸和L-色氨酸）[21]，也可以感應(yīng)γ-Glu-Cys- Gly[22]、多聚-L- Lys[23]等不同分子量的多肽。但是對(duì)于蛋白水解物而言（包括肉蛋白、酪蛋白等），CaSR主要感應(yīng)其中分子量大于500Da的肽，而非游離氨基酸或二/三肽等[5]。這也提示CaSR可能主要感應(yīng)SPH中的7S蛋白而抑制采食。但目前為止并無研究明確蛋白水解物中特異性激活CaSR的多肽序列。而灌胃SPH對(duì)和的表達(dá)無影響。研究表明STC-1細(xì)胞可被蛋白水解物激活促進(jìn)和的表達(dá)，并提高CCK基因的轉(zhuǎn)錄和CCK的分泌[7-8]；但以上這些研究均在細(xì)胞層面被證明，而體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜多樣可能是導(dǎo)致差異結(jié)果的原因。

Devazepid：CCK-1R抑制劑；“#”表示SPH vs SPH+Devazepid，且差異顯著

3.2 CaSR介導(dǎo)SPH刺激CCK分泌，抑制小鼠食欲

前一部分已證明SPH抑制小鼠采食的同時(shí)，提高了十二指腸的表達(dá)，因此筆者進(jìn)一步通過腹腔注射CaSR特異性抑制劑NPS2143探究CaSR是否在SPH抑制小鼠采食中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)果表明，SPH+NPS2143組0—1 h采食量高于SPH組且與對(duì)照組無差異，這表明抑制CaSR能夠降低SPH對(duì)采食的抑制作用。研究表明CaSR可介導(dǎo)蛋白水解物刺激STC-1細(xì)胞分泌CCK[5]；此外用酪蛋白水解物刺激由CaSR-/-小鼠分離得到的I細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其分泌CCK的能力顯著降低[24]。由此推測(cè)CaSR可能參與介導(dǎo)SPH刺激CCK的分泌而抑制小鼠采食。結(jié)果表明SPH組15 min 時(shí)血液CCK水平顯著高于對(duì)照組；而SPH + NPS 2143組血液CCK水平在15 min時(shí)顯著低于SPH組。同時(shí)SPH組0—1 h CCK分泌的總水平顯著高于對(duì)照組，而SPH+NPS2143組低于SPH組但差異不顯著，這表明CaSR參與介導(dǎo)SPH刺激CCK的分泌。研究表明，蛋白水解物激活的CaSR一方面能通過cAMP促進(jìn)PKA及CREB（cAMP-response element binding protein，CREB）轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，激活CCK基因啟動(dòng)子來促進(jìn)CCK的轉(zhuǎn)錄[3]；另一方面通過信號(hào)分子PLC及電壓門控鈣離子通道（voltage-gated calcium channel，VGCC）等通道，提高胞內(nèi)Ca2+水平而促進(jìn)CCK的分泌[25]。

作為主要的飽感激素，CCK主要在進(jìn)食后的短時(shí)間內(nèi)分泌來發(fā)揮抑制食欲的作用[26]。本研究中血液CCK水平在15 min時(shí)達(dá)到最高，這也可以部分解釋為什么僅0—1 h的采食量顯著降低。此外CaSR抑制劑并沒有完全抑制SPH所引起的CCK分泌，這表明除了CaSR以外可能還存在其他調(diào)控通路介導(dǎo)SPH刺激CCK的分泌。研究表明腸黏膜能夠分泌一種腸腔CCK釋放因子（luminal CCK-releasing factor，LCRF），它可直接作用于分泌CCK的細(xì)胞，并通過L-型鈣離子通道增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而促進(jìn)CCK分泌[27]。

3.3 CCK通過外周CCK-1R抑制小鼠食欲

CCK抑制食欲的作用主要由外周CCK-1受體介導(dǎo)，且該信號(hào)能夠通過迷走神經(jīng)傳入下丘腦并整合轉(zhuǎn)變?yōu)椴墒车闹噶頪28]。因此筆者進(jìn)一步腹腔注射CCK-1R特異性抑制劑Devazepide，探究SPH刺激分泌的CCK如何抑制小鼠采食。結(jié)果表明SPH顯著降低小鼠0—1 h的胃排空速率，而這種作用在SPH+ Devazepide組消失，這表明CCK可通過外周CCK-1R延緩胃排空速率而抑制食欲。RAYBOULD等[29]發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)素刺激CCK分泌而抑制胃排空主要是通過激活迷走神經(jīng)來實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)一步的研究揭示了這一過程，主要包括CCK通過迷走神經(jīng)CCK-1R將信號(hào)傳至孤束核，激活兒茶酚胺、膽堿能等抑胃神經(jīng)信號(hào)并通過迷走傳出神經(jīng)傳至肌間神經(jīng)叢而抑制胃平滑肌收縮[30]。

進(jìn)一步檢測(cè)下丘腦攝食相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)SPH組厭食神經(jīng)因子阿黑皮素原（pro‐opiomelanocortin，POMC）的表達(dá)顯著提高，而SPH+Devazepide組與對(duì)照組的表達(dá)無變化，這表明CCK可通過CCK-1受體將信號(hào)傳至下丘腦，并通過提高的表達(dá)產(chǎn)生厭食效應(yīng)而抑制采食。大量研究表明POMC與食欲調(diào)節(jié)相關(guān)，F(xiàn)AN等[31]發(fā)現(xiàn)CCK可通過調(diào)節(jié)下丘腦POMC神經(jīng)元降低小鼠采食；此外家兔飼喂高蛋白日糧可顯著提高十二指腸CCK及下丘腦弓形核POMC的表達(dá)[32]。但是本研究中促食相關(guān)因子神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）和野鼠相關(guān)肽（agouti- related peptide，AgRP）的表達(dá)均無顯著變化。研究表明，NPY的表達(dá)主要隨機(jī)體對(duì)能量需求的增強(qiáng)而升高[33]。在本試驗(yàn)中小鼠可自由獲取食物，沒有產(chǎn)生明顯饑餓感，這可能導(dǎo)致灌胃SPH沒有顯著影響NPY基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

大豆蛋白水解物能激活十二指腸鈣敏感受體，刺激縮膽囊素分泌，抑制采食；主要通過外周縮膽囊素-1受體形成迷走神經(jīng)回路，延緩胃排空速率，并提高了下丘腦厭食神經(jīng)因子POMC的表達(dá)，共同抑制采食。

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Effects of CaSR and CCK-1R Mediated Soybean Protein Hydrolysate on Appetite Using Mouse

WANG LüYang, CUI LeiHong, FENG JiangYin, HONG QiuXia, YOU MeiJing, BAO HaoYu, HANG SuQin

National Center for International Research on Animal Gut Nutrition/Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Nutrition and Animal Health/Laboratory of Gastrointestinal Microbiology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【】The study aimed to investigate the effects and mechanisms of soy protein hydrolysate (SPH) on the appetite in mice, so as to provide the new frame work guidelines for strategies towards manipulating feed intake in pigs.【】In this study, the pepsin was used to hydrolyze soy protein to produce SPH. Firstly, the effects on short-term feed intake and the expressions of duodenal peptide sensing receptors calcium sensing receptor (CaSR), G protein-coupled receptor 93 (GPR9)3 and oligopeptide transporter 1 (PepT1) were investigated by intragastrically different concentrations of SPH in mice. Based on this, the CaSR inhibitor NPS2143 and the peripheral cholecystokinin-1 receptor (CCK-1R) inhibitor Devazepide were intraperitoneally injected, respectively, to investigate whether SPH inhibited feed intake by the CASR-CCK-CCK-1R-hypothalamus pathway.【】The amount of 1.5g·kg-1SPH reduced the 0-1 h feed intake (<0.05), and increased theexpression (<0.05). Compared with SPH group, the feed intake of SPH+NPS2143 group were increased at 0-1 h, and the plasma CCK levels were decreased, and there were no differences from the control group (0.05<<0.5). Meanwhile, SPH reduced 0-1 h gastric emptying rate and increased the expression of hypothalamus anorexia nerve factor pro-opiomelanocortin (POMC) (<0.05), while the effects disappeared in SPH+Devazepide group. However, SPH had no effect on the small intestine transit rate or the expression of the hypothalamic food-promoting factors neuropeptide Y (NPY) and agouti related peptide (AgRP).【】CaSR mediated SPH to promote CCK secretion, delayed gastric emptying rate through the peripheral CCK-1 receptor, and improved the expression of hypothalamic anorexia nerve factor POMC to suppress appetite.

soy protein hydrolysate; food intake; calcium sensing receptor; cholecystokinin; CCK-1 receptor; hypothalam

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.015

2020-12-24；

2021-05-13

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”項(xiàng)目）（2013CB127301）、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（202017YX04）

王綠陽(yáng)，Tel：18168080743；E-mail：2018105079@njau.edu.cn。通信作者杭蘇琴，E-mail：suqinhang69@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）