王夢蕊，劉淑梅，侯麗霞，王施慧，呂宏君，蘇曉梅

番茄頸腐根腐病抗性鑒定技術的建立及抗性種質資源篩選

王夢蕊1,2，劉淑梅1，侯麗霞1，王施慧1，呂宏君1，蘇曉梅1

1山東省農業(yè)科學院蔬菜研究所/山東省設施蔬菜生物學重點實驗室/國家蔬菜改良中心山東分中心/農業(yè)農村部黃淮地區(qū)蔬菜科學觀測實驗站（山東），濟南 250100；2中國農業(yè)大學園藝學院，北京 100193

【】探索番茄頸腐根腐?。‵usarium crown and root rot，FCRR）苗期抗性鑒定技術，并對番茄種質資源及品種進行抗性鑒定分析，挖掘和豐富可利用的抗性資源，為培育抗頸腐根腐病番茄品種打下基礎。以尖鐮孢番茄頸腐根腐病?；筒≡╢. sp.，Forl）和感病栽培番茄Heinz 1706為材料，研究接種菌液濃度、接種寄主苗齡、接種后管理溫度和不同接種方法對番茄頸腐根腐病人工接種鑒定效果的影響。隨后通過苗期人工接種鑒定方法結合文獻中已報道的與抗性基因連鎖的分子標記，對100份番茄種質材料進行頸腐根腐病抗性鑒定分析。在一定范圍內，番茄頸腐根腐病發(fā)病率及病情指數隨著接種菌液濃度的升高而增大，接種菌液濃度為107個孢子/mL時，發(fā)病率及病情指數分別為100%和89.2，可以反映寄主真實的抗性水平；接種寄主苗齡為2—5葉期均能使植株發(fā)病，不同苗齡間病情指數無顯著差異；接種后不同的管理溫度對番茄頸腐根腐病的病情指數影響顯著不同，其中較低的管理溫度（20℃）有利于番茄頸腐根腐病的發(fā)生；使用浸根法和灌根法進行鑒定，番茄頸腐根腐病發(fā)病率和病情指數較高且效果穩(wěn)定，顯著優(yōu)于莖注射法。對100份番茄種質材料進行分析，接種鑒定結果顯示有38份材料表現抗病，這些材料可用于番茄抗頸腐根腐病育種或生產。在已報道的與連鎖的分子標記中，SCAR的準確率最低，僅為51%，C2-25的準確率為59%，而PNU-D4的準確率為83%，該標記可用于番茄抗頸腐根腐病輔助選擇。建立的苗期抗性鑒定技術能客觀反映供試材料的實際抗性水平，可用于番茄抗頸腐根腐病材料的鑒定篩選。

番茄；頸腐根腐病；抗性鑒定；分子標記

0 引言

【研究意義】番茄頸腐根腐?。‵usarium crown and root rot，FCRR）是由尖鐮孢番茄頸腐根腐病?；停╢. sp.，Forl）引起的番茄土傳性真菌病害[1-2]。該病害在世界范圍內均有發(fā)生[3-8]，設施栽培地區(qū)較為嚴重，在連作栽培區(qū)造成的損失逐年加大，是設施番茄生產的限制因素之一[9-10]。抗源材料的利用是抗病育種的前提和基礎，對種質資源進行抗性鑒定和篩選，對于抗性基因的克隆以及加速番茄抗頸腐根腐病育種進程具有重大意義。【前人研究進展】近年來，番茄頸腐根腐病已成為威脅我國設施番茄冬春生產的最重要的病害之一，侵染后可造成番茄嚴重減產甚至絕收[11-15]。我國東北、華北地區(qū)發(fā)病比較嚴重，尤以山東省壽光地區(qū)病情最為突出。據調查，壽光日光溫室番茄頸腐根腐病發(fā)病率達80%以上，致死率達30%以上[12]，給當地生產造成了嚴重影響。培育和利用抗病品種是控制該病害最為經濟、有效的措施，抗性鑒定是抗病育種的基礎工作，也是抗源篩選、挖掘和利用的前提條件。國外開展頸腐根腐病抗性鑒定及抗源篩選利用工作較早，并且在抗性基因研究和分子標記應用方面也取得了一定的進展[16-21]，然而不同研究者得到的結果也并不一致，其中STANIASZEK等[18]根據與緊密連鎖的保守序列位點C2_At2g38025設計的CAPS標記C2-25應用最為廣泛。【本研究切入點】我國有關番茄抗頸腐根腐病的研究報道較少，多數集中在對病原菌的鑒定以及防治措施的簡單描述，在頸腐根腐病抗性鑒定及抗源篩選方面的工作相對落后，抗病育種工作進展也較為緩慢[22-25]。在不同的室內條件下，使用不同的接種方法產生的效果也不盡相同，因此建立一套快速、高效、穩(wěn)定并且適用于大批量試材的抗性鑒定技術十分必要?！緮M解決的關鍵問題】以高感頸腐根腐病的栽培番茄Heinz 1706為材料，研究人工接種番茄頸腐根腐病的最佳條件，為番茄抗頸腐根腐病材料的選育提供切實可行的鑒定技術，同時利用苗期人工接種鑒定技術結合分子標記分析，對收集的100份番茄種質材料進行抗頸腐根腐病鑒定，明確其抗病水平，為番茄抗頸腐根腐病育種提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

抗病鑒定技術所用材料為高感頸腐根腐病的番茄品系Heinz 1706，抗性種質資源篩選材料共100份，由山東省農業(yè)科學院蔬菜研究所番茄課題組收集保存，包括49份自交系材料和51份雜交種。以上材料均選取粒飽滿無病種子，10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min消毒處理，清洗后在28℃恒溫箱中催芽，待露白后播種于滅菌的基質土中。試驗于2020年8月在山東省農業(yè)科學院蔬菜研究所培養(yǎng)室內進行，苗期控制室內溫度24—28℃，正常栽培管理。

供試病原菌采集于山東省農業(yè)科學院蔬菜研究所核心試驗區(qū)溫室內，采用組織分離法進行分離純化，經鑒定為尖鐮孢番茄頸腐根腐病?；停?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將培養(yǎng)在PDA平板培養(yǎng)基上的病原菌接種于盛有150 mL PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，25℃下140 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)液經過濾除去菌絲體后4 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，加滅菌蒸餾水稀釋成一定濃度的接種懸浮液。

1.2.2 不同接種條件試驗 不同接種菌液濃度：當番茄長至2—3片真葉時，使用濃度為106、107、108個/mL的孢子懸浮液，采用浸根法對番茄幼苗進行接種。不同寄主苗齡：采用浸根法，使用濃度為107個/mL的孢子懸浮液對2—3、3—4、4—5葉期的番茄幼苗進行接種。不同管理溫度：采用浸根法，使用濃度為107個/mL的孢子懸浮液對2—3葉期的番茄幼苗進行接種后，將其分別置于20、25、30℃環(huán)境中進行培養(yǎng)。

不同接種方法：當番茄長至2—3片真葉時，使用濃度為107個/mL的孢子懸浮液進行接種。浸根法：將番茄幼苗從穴盤中輕輕拔起后用水洗掉根部泥土，把主根尖端剪去0.5 cm左右后，將幼苗的根系在菌懸液中浸泡15 min，然后移栽至滅菌的育苗基質中[20-21]。灌根法：當番茄長至2—3片真葉時，在幼苗根部一側用刀片將部分根輕輕切斷，給根系造成機械傷害，將濃度為107個/mL孢子懸浮液30 mL灌入傷根部位[14]。莖基部注射法：用注射器吸取0.1 mL病原菌孢子懸浮液，由番茄幼苗的莖基部刺入并將接種菌液注射到番茄幼苗莖基部木質部，每株注射兩處[26]。

試驗設置3次重復，每重復10株苗，4周后調查發(fā)病情況。

1.2.3 番茄種質資源抗病性鑒定 當番茄幼苗長至2—3葉期時，用清水將根系清洗干凈后剪去主根尖端0.5 cm，放在濃度為107個/mL的孢子懸浮液中浸根處理15 min，然后移栽至滅菌基質土中，對照組用清水浸根處理，接種后置于18—22℃室內環(huán)境中，16 h·d-1光照條件，4周后調查發(fā)病情況。試驗設置2次重復，每重復8株苗。病情分級（disease- severity scale，DSS）按照Kim等[20]的標準稍作修改。0級：根系正常；1級：主根基部輕微褐變，側根正常，莖縱剖維管束正常；2級：主根基部褐變，側根輕微褐變，莖縱剖維管束褐變；3級：主根側根明顯褐變，側根脫落，莖縱剖維管束明顯褐變；4級：植株萎蔫死亡或莖基部、根部嚴重褐變甚至腐爛，側根脫落，莖縱剖維管束嚴重褐變（圖1）。病情指數（disease index，DI）=[Σ（病級數值×該病級株數）]/（病級最高值×調查株數）×100。寄主抗性等級為免疫：DI =0；高抗：0＜DI＜12.5；抗?。?2.5≤DI＜25；中抗：25≤DI＜50；感病：50≤DI＜75；高感：75≤DI≤100。

1.2.4 番茄種質資源分子標記檢測 當番茄長至2—3片真葉時，每個編號混合取樣，采用CTAB法提取基因組DNA，使用文獻中已報道的與連鎖的分子標記及功能標記對收集的番茄種質材料進行標記分析（表1）。PCR擴增體系為10 μL：50 ng·μL-1DNA模板2 μL，2×PCR mix 5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.25 μL，ddH2O補足至10 μL。引物C2-25、Tm-2和PNU-D4的PCR產物經酶切后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

a：0級DSS-0；b：1級DSS-1；c：2級DSS-2；d：3級DSS-3；e：4級DSS-4

表1 番茄頸腐根腐病抗性基因（Frl）分子標記

1.3 數據分析

采用Excel和SPSS 20.0軟件進行數據的統(tǒng)計與分析，應用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1 不同接種條件對人工接種鑒定效果的影響

2.1.1 接種菌液濃度 不同接種菌液濃度下，番茄幼苗頸腐根腐病病情指數差異極顯著。接種菌液濃度為106個/mL時，病情指數為66.7，發(fā)病率為90%，試驗所用高感材料部分表現為抗病，不能真實反映植株本身的抗性。隨著菌液濃度的增加，病情指數也隨之增加，接種菌液濃度為107、108個/mL時，病情指數分別為89.2和96.7，發(fā)病率均為100%，能夠真實反映材料本身的抗病性（表2）。

2.1.2 接種寄主苗齡 2—3、3—4、4—5葉期進行人工接種，番茄均可發(fā)病，發(fā)病率均為100%。隨著苗齡的增加，病情指數略有下降，2—3片真葉時發(fā)病最重，病情指數為91.7，但不同苗齡接種對病情指數影響差異并不顯著（表2）。

表2 不同接種條件對人工接種鑒定效果的影響

數據后不同大、小寫字母分別表示經Duncan’s新復極差法檢驗在= 0.01和= 0.05水平差異顯著

Different capital and lowercase letters after the data indicate significant differences at 0.01 and 0.05 levels by DMRT, respectively

2.1.3 接種后管理溫度 番茄幼苗植株接種頸腐根腐病病原菌后，在不同的溫度環(huán)境中發(fā)病率均為100%，在20℃時病情指數最高，隨著溫度的上升，病情指數也隨之下降，差異極顯著，表明接種后較低的管理溫度有利于番茄頸腐根腐病的發(fā)生（表2）。

2.1.4 接種方法 采用不同的接種方法，番茄發(fā)病情況有所不同。使用浸根法和灌根法進行鑒定，番茄頸腐根腐病發(fā)病率和病情指數較高，顯著優(yōu)于莖注射法（表2）。

2.2 番茄種質資源接種鑒定

采用苗期人工接種鑒定方法對100份番茄種質材料進行抗頸腐根腐病鑒定，其中高代自交系49份，雜交種51份。接種后4周進行病情分級調查，計算病情指數并確定材料抗性級別。鑒定結果如表3所示，在49份高代自交系材料中，抗病種質有12份，包括來自TGRC含的5份抗源材料LA1791、LA2829、LA3273、LA3292和LA3471，以及課題組篩選的3份砧木材料ZM-4、ZM-6和ZM-7。在51份雜交種中，表現抗病的品種有26份，包括來自偉麗公司的5份砧木以及不同單位或公司選育的商業(yè)栽培品種。

2.3 番茄種質資源分子標記檢測

對100份番茄種質材料進行分子標記檢測（圖2），不同標記檢測結果與人工接種鑒定結果有所差異。改良C2-25標記準確率為59%，PNU-D4標記的準確率為83%，而改良SCAR標記準確率僅為51%（表3）；Tm-2（I）標記檢測結果顯示，有37份材料攜帶了純合，37份材料攜帶了雜合。

M：DNA ladder，100 bp；R：抗病型resistant；S：感病型susceptible；H：雜合型heterozygous

表3 番茄種質資源人工接種鑒定與分子標記檢測結果

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

續(xù)表3 Continued table 3

IL：自交系inbred line；CAAS：中國農業(yè)科學院Chinese Academy of Agricultural Sciences；SAAS：山東省農業(yè)科學院Shandong Academy of Agricultural Sciences；WAAS：溫州市農業(yè)科學研究院Wenzhou Academy of Agricultural Sciences；WDT：宛東番茄Wandong Tomato；WLS：偉麗種苗Weili Seeding；

DSS：病情分級Disease-severity scale；DI：病情指數Disease index；RT：抗病等級Resistance type；I：免疫Immune；HR：高抗Highly resistant；R：抗病Resistant；MR：中抗Moderately resistant；S：感病Susceptible；HS：高感Highly susceptible。H：雜合（分子標記一欄）Heterozygous (the column of molecular marker) a：已知含有的抗源材料Resistant material known to contain the；b：生產中已知抗病商業(yè)品種Resistant commercial varieties known in production

3 討論

3.1 番茄頸腐根腐病苗期抗性鑒定技術體系的建立

苗期人工接種鑒定是種質資源抗病性鑒定的重要方法之一，其優(yōu)點在于可以有效控制環(huán)境因子，且保證寄主只被單一病原菌侵染，同時能夠避免因病原菌蔓延而造成的生產影響，因此得到育種工作者的普遍重視。本試驗結果表明，在一定范圍內，隨著接種菌液濃度的升高，番茄頸腐根腐病病情指數增加，當菌液濃度為107—108個/mL時接種效果明顯，能夠真實反映番茄幼苗抗性?？紤]到108個/ml的孢子懸浮液制備需大量搖菌，因此接種菌液濃度為107個/ml即可。在番茄2—5葉期，接種頸腐根腐病原菌后均能發(fā)病，但差異并不明顯，其中2—3葉期接病效果稍好，這可能是幼苗接種苗齡越大，植物本身的抗性越強，病情指數就會越低，并且在調查中發(fā)現，接種苗齡越大，發(fā)病時間也會隨之推遲。另外試驗結果表明，在接種病原菌之后的不同溫度環(huán)境中，番茄頸腐根腐病的發(fā)病情況不同。當溫度在20℃左右時，番茄頸腐根腐病發(fā)生情況較重，表明該病原菌適宜較低的土壤溫度[27]，這也可能是該病常發(fā)生于冬春低溫季節(jié)的原因之一[11]。采用不同的人工接種方法，番茄頸腐根腐病發(fā)病情況有所不同。浸根法和灌根法相較于注射法效果較好，浸根法操作技術要求相對較低，菌液可以多次使用，對菌液量要求少，適合大規(guī)模的抗性資源篩選，該方法也是眾多研究者普遍使用的接種鑒定方法；而灌根法是在李瀟等[14]的基礎上進行了改良，對植株根系進行處理后使其存在傷口而更容易被病原菌侵染，該方法省時省力，但對菌液數量要求極大，適合對少量材料進行接種鑒定；注射法操作技術要求較高，且病情指數不同重復間偏差較大，推測可能是因為注射進幼苗莖基部的菌液溢出，導致無法定量每個單株注射的菌液，從而影響試驗結果，另外不同操作者產生的效果也可能不同，因此該方法并不適合大批量材料的鑒定。本試驗使用苗期人工接種鑒定方法對100份番茄種質材料進行抗頸腐根腐病鑒定，其中有38份材料對番茄頸腐根腐病表現抗性。盡管室內苗期接種鑒定具有諸多優(yōu)點，但經該方法篩選獲得的抗性材料仍需要進一步在田間進行鑒定，以明確其在生產環(huán)境中的抗性表現。

3.2 Frl分子標記的應用與分析

分子標記輔助選擇技術已成為番茄育種過程中不可或缺的一種輔助手段，可以有效加速育種進程，然而其準確性取決于分子標記與目標基因的連鎖程度。國內外研究者在分子標記的開發(fā)和應用方面做了很多工作。最初應用于育種篩選的是由C2_At2g38025標記改造的CAPS標記C2-25[18]。程琳等[12]用人工接種鑒定病原菌的方法對25份番茄種質材料進行抗病性鑒定，并使用分子標記C2-25對其進行檢測，結果表明人工病原菌接種鑒定結果與分子標記檢測結果高度吻合，吻合率達100%。然而在本試驗中，該標記的準確率僅為59%，其原因可能在于前人研究試驗中所檢測的材料均引自荷蘭，其遺傳背景較為單一，因此分子標記檢測結果與人工接種鑒定結果高度吻合。而本試驗中的材料為收集保存的自然群體及不同來源的新品種，其遺傳背景較為復雜，因此該標記準確率較低。Mutlu等利用抗病材料Fla.7781構建群體，篩選獲得了一個SCAR標記SCAR，該標記距離僅0.016 cM，位于9號染色體的61.8 Mb位置[19]，與標記C2-25的物理位置較遠，然而Kim等[20]驗證了標記SCAR在43份商品種中準確率不到45%，與本試驗中該標記51%的準確率較為相近。Kim等篩選的標記PNU-D4，在F2群體及60份商品種番茄中的準確率分別為92.8%和90%[20]，在本試驗中該標記的準確率為83%，可用于番茄抗頸腐根腐病的分子標記輔助選擇。

研究表明番茄抗煙草花葉病毒基因與緊密連鎖[16]，在本試驗鑒定的38份抗頸腐根腐病的材料中，有31份同時攜帶，這些材料可用于番茄抗病育種或商業(yè)生產。另有研究表明較早應用到抗病育種中的秘魯番茄PI128650同時攜帶抗病基因和，研究者對300多份栽培番茄材料基因組重測序，通過與PI128650基因組相似性比較發(fā)現，其中20個個體攜帶有秘魯番茄9號染色體長約51.7—54.7 Mb的部分片段，該外源野生片段占據了番茄9號染色體的大部分區(qū)域[28]。由于野生番茄和栽培種番茄存在結構變異[29-30]，在長期的自交和回交育種過程中，該外源片段依舊沒有完全被打斷。而在本試驗中，標記Tm-2和標記SCAR的分析結果中二者的吻合率為92%，表明該染色體區(qū)間緊密連鎖，這與前人的研究結果一致。

到目前為止，對于的定位和分子標記的應用，不同研究者的結果并不一致，特別是不同標記在商品種中驗證的準確率往往有很大差別，其原因可能在于不同商品種的遺傳背景不同，不同研究者所檢測的商品種來源不一，其遺傳背景在很大程度上會影響標記的準確率。另外，在本次鑒定的100份材料中，有12份材料（TS-211、TS-272、SD-16、Ah2001、Ah2003、Ah2013、金棚8號、飛躍、甌秀806、百利、天祿1號、傳奇）人工接種鑒定結果均為高感，而分子標記檢測均為抗病，其原因除了遺傳背景差異造成的影響外，還可能在于外源野生片段在轉育到栽培種的過程中，該基因內部發(fā)生某些突變導致功能喪失，而本研究中所使用的標記均為連鎖標記，因此二者鑒定結果不吻合。只有開發(fā)基因內部的功能標記才能提高選擇效率，因此該基因的定位克隆及分子標記輔助育種研究仍是當前亟待解決的重大科學和生產實際問題。

4 結論

建立了適用于大批量番茄頸腐根腐病苗期抗性鑒定的技術，即當番茄長至2—3片真葉時，使用濃度為107—108個/mL的病原菌孢子懸浮液，采用浸根法進行接種，接種后管理溫度為20℃左右，4周后調查發(fā)病情況。同時，對收集的100份番茄材料進行了接種鑒定及分子標記分析，明確了其抗性，這些材料可用于番茄抗頸腐根腐病育種或生產。

致謝：感謝中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所、宛東番茄科技（廣州）有限公司、山東偉麗種苗有限公司提供的部分資源材料。

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Development of artificial inoculation methodology for evaluation of resistance to Fusarium crown and root rot and screening of resistance sources in tomato

WANG MengRui1,2, LIU ShuMei1, HOU LiXia1, WANG ShiHui1, Lü HongJun1, SU XiaoMei1

1Institute of Vegetables, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Province Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables/Shandong Branch of National Improvement Center for Vegetables/Huanghuai Region Scientific Observation and Experimental Station of Vegetables (Shandong), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Ji’nan 250100;2College of Horticulture, China Agricultural University, Beijing 100193

】The objective of this study is to explore the resistance identification technology of Fusarium crown and root rot (FCRR), carry out the resistance identification and analysis of tomato germplasm resources and varieties, enrich the available tomato resources resistant to FCRR, and to lay the foundation for the cultivation of tomato varieties that resistant to FCRR.【】In the present study, four parameters that influence the inoculation effect including inoculum concentration, seedlings stage, environmental temperature and inoculation methods were studied using susceptible line Heinz 1706 infected withf. sp.(Forl). Subsequently, 100 tomato materials were identified through artificial inoculation at seedling stage as well as the molecular markers linked to the resistance gene.【】The disease incidence and disease index of FCRR increased in a certain range along with the increase of inoculum concentration, and the actual levels of plant resistance could be revealed with the inoculum of 107spores/mL, for which the disease incidence and disease index were 100% and 89.2, respectively. The disease index was not significantly different among different seedling ages when the host was inoculated at 2 to 5 leaf stage. The effects of different environmental temperatures after inoculation on the disease index of FCRR were significantly different and the lower temperature (20℃) condition was more favorable to the occurrence of FCRR.The incidence and disease indexwere higher and the effect was stable using root dipping and root irrigation methods, which were significantly better than stem injection. The result of inoculation identification suggested that 38 materials showed resistance to FCRR among 100 tomato materials, which could be used for breeding or production in tomato for FCRR resistance. In addition, among the reported markers linked to, SCARhas the lowest accuracy of 51%, while C2-25 has the accuracy of 59% and the accuracy of PNU-D4 is 83%, which is expected to be used in marker-assisted selection (MAS) for FCRR resistance.【】The established assessment system can identify levels of the resistance to FCRR in tomato seedlings, which can be used for identification and screening of tomato materials.

tomato; Fusarium crown and root rot (FCRR); resistance identification; molecular marker

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.007

2021-07-23；

2021-08-28

山東省自然科學基金（ZR2020QC152）、國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS-23-G13）、山東省農業(yè)良種工程（2020LZGC005）

王夢蕊，E-mail：wangmr151@qq.com。劉淑梅，E-mail：lsmei78@126.com。王夢蕊和劉淑梅為同等貢獻作者。通信作者蘇曉梅，Tel：0531-66659184；E-mail：sxm198846@126.com

（責任編輯 岳梅）