嚴玉婷，李玉杰，王倩，唐美君，郭華偉，李紅亮，孫亮*

化學感受蛋白直系同源基因在茶尺蠖及近緣種灰茶尺蠖中的表達分析

嚴玉婷1,2，李玉杰2,3，王倩4，唐美君2，郭華偉2，李紅亮1*，孫亮2*

1.中國計量大學生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，浙江 杭州 310018；2.中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制實驗室，浙江 杭州 310008；3.河南科技學院植物保護系，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江 杭州 311300

化學感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）在昆蟲化學通訊及其他生理過程中發(fā)揮重要功能。茶尺蠖與其近緣種灰茶尺蠖是茶園重要鱗翅目害蟲，對我國茶葉的安全生產(chǎn)造成嚴重危害。研究化學感受蛋白直系同源基因在茶尺蠖兩近緣種間的表達，有助于研發(fā)同時針對該兩種害蟲的綠色防控技術。通過熒光定量qRT-PCR分析了直系同源基因在灰茶尺蠖中的表達分布。結果表明，與具有保守的幼蟲期高表達模式，主要表達于灰茶尺蠖3齡幼蟲頭部。進一步比較在茶尺蠖兩近緣種間的表達發(fā)現(xiàn)在茶尺蠖中的表達量顯著高于在灰茶尺蠖中的表達量。此外，還分析了沃爾巴克氏體菌（）及揮發(fā)物誘導對表達的影響，發(fā)現(xiàn)顯著影響在灰茶尺蠖中的表達。該結果證實參與調(diào)控昆蟲CSPs基因的表達，為后續(xù)揭示介導CSPs表達，參與調(diào)控茶尺蠖兩近緣種化學感受及與茶樹的協(xié)同進化提供了新的研究思路。

茶尺蠖；灰茶尺蠖；化學感受蛋白；；表達分析

高度靈敏的嗅覺系統(tǒng)對昆蟲寄主定位、取食選擇、交配繁衍及躲避天敵等行為活動至關重要。觸角是昆蟲最重要的感受器官，其表面分布有多種類型的化學感受器感知外界化學信號[1]。外界信號分子主要通過感器表面的微孔進入嗅覺感器淋巴液。脂溶性的氣味分子無法直接穿過水溶性的感器淋巴液激活氣味受體（Odorant receptors，ORs），載體蛋白如氣味結合蛋白（Odorant binding protein，OBPs）、化學感受蛋白（Chemosensory protein，CSPs）在昆蟲感器淋巴液中大量表達，能夠選擇性的識別、結合運輸氣味分子穿過親水性的感器淋巴液至感覺神經(jīng)元樹突，激活氣味受體，最終引發(fā)昆蟲相應的行為反應[2]。

CSPs被發(fā)現(xiàn)可在沙漠蝗（）的接觸感器中表達，推測其具有化學感受功能，因而被命名為化學感受蛋白[3]。CSPs是一類水溶性小分子蛋白，分子量一般為10～15?kDa，具有4個半胱氨酸，可形成兩個二硫鍵。CSPs可以在昆蟲的各個組織廣泛表達，涉及調(diào)控昆蟲的多種生理過程[4]。例如NlugCSP10在褐飛虱（St?l）的多個發(fā)育時期表達，體外結合試驗與基因干擾證實NlugCSP10參與褐飛虱的感受識別順-3-己烯乙酸酯等寄主植物揮發(fā)物[5]。苜蓿盲蝽（Goeze）CSPs被證實能夠表達于多種化學感器的淋巴液，結合盲蝽性信息素及植物揮發(fā)物，推測其具有化學感受功能[6]。家蠶（）CSPs可在殺蟲劑誘導下顯著上調(diào)，可能具有除化學通訊以外的其他功能[7-8]。此外，CSPs還被證實可參與東亞飛蝗（）的行為相變[9]、蜚蠊（）足的再生[10-11]，以及紅火蟻（ta）的脫皮代謝等[12]。

茶尺蠖（Prout）與灰茶尺蠖（Warren）是茶園鱗翅目尺蛾科的一對近緣種害蟲，二者形態(tài)相似，均以幼蟲取食葉片危害茶樹[13]。近年來兩近緣種在我國局部茶區(qū)頻繁暴發(fā)，對茶葉安全生產(chǎn)和品質(zhì)造成嚴重威脅。研究表明茶尺蠖兩近緣種在地理分布、生長發(fā)育歷期、求偶交配等方面存在明顯差異。茶尺蠖主要分布在浙江、江蘇和安徽等地茶園，灰茶尺蠖分布范圍更廣，二者存在混合發(fā)生區(qū)域[14-15]?；也璩唧妒来l(fā)育歷期比茶尺蠖短，發(fā)育速率也較茶尺蠖快，繁殖能力更強[16]。此外，二者存在明顯的生殖隔離和生殖競爭[17-18]，兩種尺蠖雌蛾合成釋放的性信息素在組分和比例上存在差異[19]。共生菌尤其是沃爾巴克氏體菌（）在兩近緣種間的攜帶率也顯著不同；利用快速進化基因外膜蛋白基因wsp分子檢測發(fā)現(xiàn)，主要在灰茶尺蠖中，茶尺蠖幾乎不攜帶[20]。四環(huán)素等抗生素處理茶樹葉片飼喂幼蟲，可以去除灰茶尺蠖體內(nèi)的，建立不攜帶的灰茶尺蠖突變體種群[21]。

本實驗室前期研究鑒定了14個茶尺蠖化學感受蛋白基因，并明確了其在茶尺蠖中的發(fā)育時期及組織表達分布，其中被證明能夠表達于茶尺蠖的3齡幼蟲[22]。為鑒定兩近緣種幼蟲表達的化學感受蛋白，篩選重要的靶標功能基因調(diào)控幼蟲與茶樹互作行為，本研究繼續(xù)聚焦，采用實時熒光定量PCR技術著重研究直系同源基因在灰茶尺蠖中的表達分布及其在兩近緣種間的表達差異，旨在為后續(xù)揭示茶尺蠖兩近緣種與茶樹互作的化學通訊機制，研發(fā)針對兩近緣種幼蟲的綠色防控技術提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

茶尺蠖幼蟲采于浙江省安吉縣（119.31°E，30.27°N），野外采集的茶尺蠖幼蟲根據(jù)前期研究報道進行分子鑒定確定種屬關系[18]。在實驗室建立茶尺蠖種群，溫度為(25±1)℃、光周期為L∶D=13∶11、相對濕度75%～80%。幼蟲用新鮮的茶樹葉片飼喂，化蛹后在顯微鏡下按雌雄分開。將新羽化的雌雄蛾配對交配，待雌蛾產(chǎn)卵后，收集試蟲卵條保存于4℃冰箱備用。灰茶尺蠖以及利用四環(huán)素處理去除共生菌的突變體（以下簡稱灰茶尺蠖突變體）種群已在實驗室繁殖飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)方法與上述茶尺蠖相同。

為研究共生菌對靶標基因表達量的影響，本研究試樣收集前，根據(jù)前期研究報道，對灰茶尺蠖及灰茶尺蠖突變體種群進行攜帶檢測驗證，確?；也璩唧锻蛔凅w種群中共生菌被去除[23]。

1.2 組織樣品收集

1.2.1 灰茶尺蠖各個發(fā)育時期樣品收集

為研究直系同源基因在灰茶尺蠖的各個發(fā)育時期的表達分布，分別取灰茶尺蠖卵（200粒）、3齡幼蟲（15頭）、雌雄蟲蛹（0～1?d）各30頭、未交配雌雄蛾（羽化0～1?d）各15頭。每個樣品收集3個生物學重復，樣品經(jīng)液氮冷凍后迅速轉移至–80℃冰箱備用。

1.2.2 灰茶尺蠖3齡幼蟲各組織樣品收集

為研究在灰茶尺蠖3齡幼蟲各組織的表達情況，取20頭灰茶尺蠖3齡幼蟲進行解剖，分別收集幼蟲頭部、中腸、表皮及脂肪體，每個組織樣品至少收集3個生物學重復。收集樣品于液氮中冷凍后迅速轉移至–80℃冰箱備用。

1.2.3 茶尺蠖、灰茶尺蠖及灰茶尺蠖突變體3齡幼蟲樣品收集

為研究直系同源基因在茶尺蠖兩近緣種間是否存在表達量的差異，并分析其與的相關性，分別收集茶尺蠖、灰茶尺蠖及灰茶尺蠖突變體3齡幼蟲。收集30頭幼蟲頭部作為1個生物學重復，重復3次，樣品于液氮冷凍后迅速轉移至–80℃冰箱備用。

1.2.4 揮發(fā)物誘導試蟲樣品收集

有研究指出，茶樹揮發(fā)物順-3-己烯-1-醇參與茶尺蠖與茶樹互作調(diào)控[24-25]，本研究選擇順-3-己烯-1-醇（純度＞97%）作為誘導揮發(fā)物，分析茶尺蠖兩近緣種被誘導后體內(nèi)的表達量變化。

取20頭3齡茶尺蠖幼蟲置于500?mL玻璃養(yǎng)蟲瓶中，瓶內(nèi)放置2～3片茶樹葉片。取10?μL溶于石蠟的1?μg·μL-1順-3-己烯-1-醇加到3?cm×4?cm的濾紙條內(nèi)，將濾紙條置于茶樹葉片中。玻璃瓶口用正方形的梨酸紙封口，再用直徑9?cm的培養(yǎng)皿蓋在瓶口，減少空氣流通。對照組將揮發(fā)物換成石蠟，其他條件與處理組相同。處理4、8、12?h后分別從處理組和對照組取5頭幼蟲作為1個樣品重復，共收集3個生物學重復。試蟲樣品經(jīng)液氮速凍后轉移至–80℃冰箱保存?zhèn)溆??；也璩唧对囅x處理方法與茶尺蠖相同。

1.3 總RNA提取及第一鏈cDNA合成

將樣品在滅菌的研缽中用液氮充分研磨，加入Trizol（Invitrogen），按照Trizol法提取樣品總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。利用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo，美國）測定總RNA的濃度。經(jīng)檢測驗證的各組織總RNA于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司]進行第一鏈cDNA的合成。第一步10?μL反應體系：2.0?μL 5×gDNA Eraser buffer，1.0?μL gDNA Eraser，6.0?μL ddH2O，1.0?μL RNA，42℃反應2?min，4℃保存?zhèn)溆谩５诙?0?μL反應體系：4.0?μL 5×PrimeScript Buffer，1.0?μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0?μL RT Primer Mix，4.0?μL ddH2O，與第一步反應體系充分混勻，37℃反應15?min，85℃5?s，4℃保存?zhèn)溆谩＠肗anoDrop 2000分光光度計測定cDNA模板的濃度，稀釋至200～300?ng·μL-1存于–20℃冰箱備用。

通過內(nèi)參基因進行反轉錄cDNA模板的驗證，20?μL PCR反應體系包括rTaq酶反應混合物10.0?μL，上下游引物（表1）各0.8?μL，cDNA模板1.0?μL，ddH2O 7.4?μL。反應程序：94℃預變性3?min；94℃變性30?s，56℃退火30?s，72℃延伸1?min，40個循環(huán)；72℃ 10?min，4℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物條帶。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

2 結果與分析

2.1 EgriCSP8在灰茶尺蠖不同發(fā)育時期的表達分析

前期研究發(fā)現(xiàn)，在茶尺蠖3齡幼蟲期高表達[22]。為了明確其直系同源基因是否在灰茶尺蠖幼蟲期大量表達，本研究收集了灰茶尺蠖不同發(fā)育時期，包括卵、幼蟲期（3齡）、雌雄蛹期和雌雄成蟲期，通過qRT-PCR分析在各發(fā)育時期的表達動態(tài)。結果表明，在灰茶尺蠖各個發(fā)育階段都有表達，但相對表達豐度存在差異。在灰茶尺蠖卵期表達水平很低，在3齡幼蟲期表達量最高，進入蛹期后雌雄兩性的表達量均迅速下降，直至成蟲期都維持相對較低的表達水平（圖1）。表達量在3齡幼蟲期與其他發(fā)育時期存在顯著差異；卵、雌雄蛹期及雌雄成蟲期之間差異不顯著。

表1 實時熒光定量PCR引物

2.2 EgriCSP8在灰茶尺蠖幼蟲不同組織的表達分布

解剖灰茶尺蠖3齡幼蟲，利用qRT-PCR比較在灰茶尺蠖幼蟲頭部、中腸、表皮和脂肪體中的相對表達量。結果表明，主要表達于幼蟲頭部和表皮，其他部位的相對表達量很低，其中幼蟲頭部表達量較其他組織差異顯著（圖2）。

注：不同字母表示樣品之間存在顯著差異（P＜0.05），下同

圖2 EgriCSP8在灰茶尺蠖3齡幼蟲不同組織的表達

2.3 Eobl-EgriCSP8在茶尺蠖兩近緣種間的表達分析

利用qRT-PCR比較分析了在茶尺蠖兩近緣種3齡幼蟲間的表達量，結果表明，在茶尺蠖與灰茶尺蠖間的表達量存在顯著差異，在茶尺蠖3齡幼蟲中的表達量顯著高于其直系同源基因在灰茶尺蠖3齡幼蟲中的表達（圖3）。

2.4 Wolbachia對Eobl-EgriCSP8表達的影響

為分析共生菌是否與在茶尺蠖兩近緣種間表達差異有關。本研究利用qRT-PCR比較分析了灰茶尺蠖3齡幼蟲在去除前后表達量的變化。結果表明，的去除對的表達量存在顯著影響，與未處理組相比，去除的灰茶尺蠖3齡幼蟲中的表達量顯著降低（圖4）。

進一步分析比較在去除的灰茶尺蠖中表達量與在茶尺蠖3齡幼蟲中的表達量發(fā)現(xiàn)，在茶尺蠖中的表達量顯著高于在灰茶尺蠖突變體中的表達量（圖5）。

圖3 Eobl-EgriCSP8在茶尺蠖兩近緣種3齡幼蟲間的表達量

圖4 EgriCSP8在灰茶尺蠖與灰茶尺蠖Wolbachia突變體3齡幼蟲間的表達量

圖5 EoblCSP8在茶尺蠖與其直系同源EgriCSP8在灰茶尺蠖Wolbachia突變體3齡幼蟲間的表達量

2.5 順-3-己烯-1-醇對Eobl-EgriCSP8表達的影響

由圖6可知，茶尺蠖3齡幼蟲在順-3-己烯-1-醇誘導處理后，轉錄表達水平均略高于對照組，但統(tǒng)計分析表明誘導處理前后的表達均無顯著差異。

灰茶尺蠖3齡幼蟲在順-3-己烯-1-醇誘導處理4?h和8?h時，轉錄表達水平?jīng)]有顯著變化，誘導12?h處理后表達量有所上升但差異不顯著（圖7）。

3 討論

鱗翅目蛾類幼蟲是害蟲危害農(nóng)作物主要蟲期，研究幼蟲中高表達的靶標功能基因有助于研發(fā)幼蟲的綠色防控技術。本研究比較分析了化學感受蛋白基因在茶尺蠖兩近緣種幼蟲間的轉錄表達，有助于解析CSPs在調(diào)控茶尺蠖兩近緣種識別定位茶樹中的生理功能。

CSPs被報道表達于昆蟲的化學感受器官，參與調(diào)控昆蟲的化學通訊行為[27]。大螟（）被證實表達于雄蛾觸角，并且強烈結合雌蛾合成釋放的性信息素[28]。CSPs在半翅目盲蝽類昆蟲中也被廣泛研究，通過免疫組織定位研究發(fā)現(xiàn)苜蓿盲蝽的CSP1-6均可在成蟲觸角化學感器中表達，體外熒光競爭性結合試驗證實CSP1-6可以結合大多數(shù)寄主植物揮發(fā)物[6,29]。本實驗室前期研究鑒定了14個茶尺蠖化學感受蛋白基因，表達譜分析發(fā)現(xiàn)在茶尺蠖3齡幼蟲期表達水平較高[22]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)灰茶尺蠖中存在的直系同源基因，明確的發(fā)育時期及組織表達分布，有助于分析其潛在的生理功能。

本研究首先利用qRT-PCR分析了在灰茶尺蠖不同發(fā)育時期的表達動態(tài)，結果表明，與其直系同源基因具有保守的發(fā)育表達模式，和都在茶尺蠖兩近緣種幼蟲期大量表達。組織表達譜分析發(fā)現(xiàn)，與相似，均表達于幼蟲頭部與表皮，統(tǒng)計分析結果顯示在灰茶尺蠖幼蟲頭部表達量顯著高于表皮和其他組織。鱗翅目蛾類幼蟲頭部是其主要的化學感受器官[30-32]。灰茶尺蠖幼蟲頭部感器結構研究表明，頭部觸角上著生有栓錐形感器、錐形感器、刺形感器，上下唇與上下顎等也分布有化學感器[33]。與在茶尺蠖兩近緣種幼蟲頭部高表達暗示其可能涉及幼蟲化學通訊行為，然而該推論還需進一步提供在茶尺蠖兩近緣種幼蟲頭部化學感器表達的證據(jù)。此外，均可表達于茶尺蠖兩近緣種3齡幼蟲表皮，尤其是在茶尺蠖3齡幼蟲表皮中表達量較高[22]，據(jù)此推測，在茶尺蠖與灰茶尺蠖兩近緣種間可能還涉及調(diào)控其他生理過程。

圖6 順-3-己烯-1-醇誘導對EoblCSP8在茶尺蠖中表達的影響

圖7 順-3-己烯-1-醇誘導對EgriCSP8在灰茶尺蠖中表達的影響

昆蟲CSPs可以被農(nóng)藥等外源性化合物誘導表達例如被證實在煙粉虱（）B生物型和Q生物型中的表達量不同，新煙堿類農(nóng)藥噻蟲嗪誘導處理后的表達量提高了5～10倍[34]；阿維菌素處理家蠶也可以顯著改變基因的轉錄表達[8]；體外表達的中華蜜蜂（）CSP1重組蛋白可以與新煙堿類農(nóng)藥吡蟲啉發(fā)生互作[35]。本研究分析了茶樹揮發(fā)物順-3-己烯-1-醇對的誘導表達情況，結果顯示，揮發(fā)物順-3-己烯-1-醇誘導處理后，與的表達量在不同處理時間略有變化，但與相同時間下的對照組差異不顯著。功能基因的誘導表達可能受處理時間、誘導底物、組織樣品間的變異等多種因素影響，是否是誘導底物選擇、處理劑量或樣品間的變異等導致該結果仍然需要后續(xù)更為詳細的研究分析。

CSPs在蛾類昆蟲近緣種幼蟲間的比較分析報道較少。本研究比較分析了在茶尺蠖兩近緣種幼蟲間的表達量，結果顯示，在茶尺蠖3齡幼蟲中的表達量顯著高于在灰茶尺蠖3齡幼蟲中的表達。進一步研究比較灰茶尺蠖與灰茶尺蠖突變體、茶尺蠖與灰茶尺蠖突變體間的表達量發(fā)現(xiàn)，共生菌的去除顯著降低了在灰茶尺蠖3齡幼蟲中的表達量，導致灰茶尺蠖突變體中的表達量顯著低于茶尺蠖3齡幼蟲。亞致死劑量吡蟲啉處理褐飛虱可增加褐飛虱體內(nèi)的，同時誘導提高了細胞色素P450基因的表達，當利用四環(huán)素清除后基因的誘導表達被明顯減弱[36]。本研究中，在灰茶尺蠖中的去除同樣顯著降低了在灰茶尺蠖中的轉錄表達，證實共生菌可能參與調(diào)控昆蟲化學感受相關基因在近緣種間的轉錄表達。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所孫曉玲研究員提供本研究中茶樹揮發(fā)物順-3-己烯-1-醇。

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The Expression Profiles of Chemosensory Protein 8 Orthologs in Two Closely Related Tea Geometrid Species,Prout andWarren

YAN Yuting1,2, LI Yujie2,3, WANG Qian4, TANG Meijun2, GUO Huawei2, LI Hongliang1*, SUN Liang2*

1.College of Life Science, China Jiliang University/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection and Quarantine, Hangzhou 310018, China; 2.Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3.Department of Plant Protection, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China; 4.College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, China

Chemosensory proteins (CSPs) play crucial roles in insect chemosensory and non-chemosensory processes.Prout and its sibling species,Warren are serious lepidopteran moth pests in tea gardens and they cause destructive damages to tea plants.The development of greener and environmentally friendly pest managements would benefit from orthologous CSPs’ investigation on the interaction between twospecies and tea plants.This study mainly examined the expression profiles of, the orthologs ofinby using the real-time quantitative PCR experiment.The qRT-PCR results show thatandhad a conserved larvae-enriched expression pattern.was mainly expressed in the heads of the third instar oflarvae.Next, the expression levels ofwere compared betweenand.The results show that the expression level ofinwas higher than that ofin.In addition, the effects ofand tea plant volatiles onexpression levels inandwere also estimated.The results show that theexpression level declined significantly whenwas removed in, which provided the first evidence that the insect CSPs’ expression is associated with.These findings laid a foundation for the future studies on the molecular mechanisms of chemosensory and coevolution between the geometrid sibling species and tea plants.

Prout,Warren, chemosensory protein,, expression analysis

S571.1，S435.711

A

1000-369X(2022)02-200-11

2021-03-19

2021-04-14

中國科協(xié)青年人才托舉工程項目（2018QNRC001）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(1610212020001，1610212018010)、國家自然科學基金（31501652，31871977）

嚴玉婷，女，碩士研究生，主要從事昆蟲生化與分子生物學方面的研究。*通信作者：hlli@cjlu.edu.cn；liangsun@tricaas.com

（責任編輯：黃晨）