劉富浩，范延艮，王域，孟凡月，張麗霞*

茶樹黃金芽CsHIPP26.1蛋白螯合離子的篩選與鑒定

劉富浩1,2，范延艮1,2，王域1,2，孟凡月1,2，張麗霞1,2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東 泰安 271018

重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白（HIPPs）由于其獨特的重金屬結(jié)合域和異戊二烯序列的結(jié)構(gòu)特點，成為一類重要的金屬分子伴侶。為鑒定茶樹（）黃金芽CsHIPP26.1蛋白的螯合離子，將重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，在分別添加4?mol·L-1的單一金屬離子（CuCl2、ZnCl2、MgCl2、FeCl3、CaCl2）或5種金屬離子混合液以及1?mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)的LB液體中培養(yǎng)，觀測大腸桿菌的生長情況，并用His-tag蛋白純化磁珠純化獲得融合目的蛋白，經(jīng)原子吸收分光光度計分析融合蛋白中金屬離子含量，計算蛋白螯合的離子數(shù)目。結(jié)果表明，CsHIPP26.1蛋白僅與Zn2+和Cu2+螯合，且螯合Zn2+的能力顯著強于Cu2+。根據(jù)其結(jié)合金屬離子與目的蛋白質(zhì)量摩爾比推測，CsHIPP26.1蛋白螯合Zn2+、Cu2+金屬離子的最大數(shù)目分別為2和1。

重金屬異戊二烯植物蛋白；CsHIPP26.1；金屬離子；茶樹

重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白（Heavy metal-associated isoprenylated plant protein，HIPP）是植物中一種特有的金屬伴侶蛋白。本課題組前期從茶樹[(L.) Kuntze]黃金芽品種中發(fā)現(xiàn)一個響應(yīng)強光且高表達的CsHIPP26.1蛋白，并對該蛋白基因進行了克隆、生物信息學(xué)分析和功能驗證[1]，同時，發(fā)現(xiàn)過量表達的蘋果愈傷組織對光脅迫的抗性增強，且CsHIPP26.1可與光敏色素互作因子CsPIF4（Phytochrome interacting factors）互作[2]。已有研究表明，HIPPs在植物體內(nèi)主要有3個方面的功能：（1）與蛋白互作對代謝起調(diào)控作用；（2）參與重金屬的解毒；（3）參與金屬離子的轉(zhuǎn)運[3]。而這些功能的發(fā)揮與螯合離子的種類密切相關(guān)。所以，明確CsHIPP26.1蛋白結(jié)合金屬離子的種類，可為該蛋白功能的研究提供一定的基礎(chǔ)，因而具有重要的理論意義。

有研究表明，HIPPs蛋白HMA結(jié)構(gòu)域的核心基序M/LXCXXC能螯合Cu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+[4-5]，但不與Co2+、Mn2+、Ca2+結(jié)合[6-7]。由于CsHIPP26.1蛋白表達響應(yīng)高光強下的葉色黃化，與重金屬離子（Ni2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+）的毒害無關(guān)，而與光逆境脅迫和葉色變化相關(guān)[2]，從而可能與光保護機制[8]、植物卟啉類化合物代謝[9]和植物信號通路[10]中涉及的離子（Zn2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+）相關(guān)。

為篩選和鑒定CsHIPP26.1蛋白所螯合的金屬離子，本研究構(gòu)建含有質(zhì)粒的大腸桿菌原核表達載體（pET-CHI），同時以空載體為對照（Control），分別在添加單一金屬離子（CuCl2、ZnCl2、MgCl2、FeCl3、CaCl2）和5種混合金屬離子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過誘導(dǎo)表達、純化獲得目的蛋白CsHIPP26.1，進一步分析并確定融合蛋白中金屬離子的種類和結(jié)合數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采摘種植于山東省泰安市茶園5年茶樹黃金芽的芽下第二葉，液氮冷凍，置于–80℃冰箱保存，用于總RNA提取。

1.2 試劑與儀器

T100TMPCR儀，美國Bio-Rad；DYY-12核酸電泳儀，北京六一儀器廠；Tanon-3500凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；YJ-VS-2超凈工作臺，無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；Z216MK臺式高速冷凍離心機，德國Hermle；ML204電子天平，美國METTLER TOLEDO；NanoDrop 2000紫外分光光度計，美國Thermo Scientific；ExceMagTM16孔金屬磁力架，蘇州莫納生物科技有限公司；MARS6微波消儀，美國CEM；HNY-200B恒溫培養(yǎng)震蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；GI80TW滅菌器，美國Zealway；TAS-986原子吸收分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA合成

參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取茶樹總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA質(zhì)量。提取的茶樹總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于–20℃冰箱備用。

1.3.2 融合蛋白表達載體的構(gòu)建

目的基因克隆：根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中基因的編碼序列MK654903，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，上游引物（5'-3'）為ATGGGTGCTCTGGATCATCTC，下游引物（5'-3'）為CATGACAACACAAGCAGCAG。以黃金芽cDNA為模板，利用PCR擴增目的基因全長，回收目的片段連接到平末端克隆載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞中，挑取氨芐西林（Amp）抗性陽性單克隆測序。

重組載體的構(gòu)建：用Steady Pure Plasmid DNA Extraction Kit試劑盒提取測序正確菌液中的質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒與載體同時進行SalI與BamHI雙酶切，所獲得的陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序，確定其堿基序列的完整性。

設(shè)計新穎、技術(shù)前沿、風(fēng)格獨特、性能卓越，無論從美學(xué)上還是機械設(shè)計上，Defy系列無疑都是未來革新的風(fēng)向標(biāo)，代表著真力時的先鋒巨制。尤其是2017年問世的Defy El Primero 21以及DefyLab表款則以其劃時代的變革意義象征著品牌再攀制表巔峰，更為全球制表界指明未來的方

融合蛋白的誘導(dǎo)表達：將重組質(zhì)粒（）及對照質(zhì)粒（）分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。挑取重組菌株以及對照菌株單克隆，培養(yǎng)于LB+Amp培養(yǎng)基中。加入終濃度為1?mmol·L-1的IPTG，誘導(dǎo)His-tag融合蛋白的表達。分別于0、60、120?min和240?min收集菌液，提取菌液粗蛋白，利用SDS-PAGE進行蛋白質(zhì)變性凝膠電泳檢測。

1.3.3 不同金屬離子溶液處理下大腸桿菌生長曲線的測定

分別在OD600=0.1的重組菌和對照菌株LB培養(yǎng)液中加入終濃度為1?mmol·L-1的IPTG和4?mol·L-15種金屬離子單一溶液或其混合溶液（CuCl2、ZnCl2、MgCl2、FeCl3、CaCl2），同時以未添加金屬離子培養(yǎng)的菌株為對照，在37℃、180?r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2?h測定OD600值，試驗重復(fù)3次，繪制生長曲線。

1.3.4 目的蛋白純化

以O(shè)D600=0.6的重組菌（pET-CHI）及對照菌（Control）液為材料，經(jīng)高速離心機按照5?000?r·min-1離心15?min，收集菌體，稱重。將1?g濕質(zhì)量的大腸桿菌加入10?mL Binding buffer（20?mmol·L-1PBS，500?mmol·L-1NaCl，20?mmol·L-1咪唑，pH7.4）重懸，依據(jù)一步法細菌活性蛋白提取試劑盒說明書，加入10?mL的裂解液，4℃下，混勻30?min。超聲裂解后將液體轉(zhuǎn)移至離心管，在高速冷凍離心機中4℃條件下以1?200?r·min-1轉(zhuǎn)速離心20?min，收集上清液；然后加入His-tag蛋白純化磁珠顛倒混勻，室溫孵育15?min。將離心管置于磁力架上分離，待溶液澄清，移出上清液。向離心管中加入10?mL Wash buffer（20?mmol·L-1PBS，500?mmol·L-1NaCl，100?mmol·L-1咪唑，pH7.4），反復(fù)吹打5～10次進行洗滌，磁分離，吸出上清液。最后向離心管中加入10?mL Elution buffer（20?mmol·L-1PBS，500?mmol·L-1NaCl，500?mmol·L-1咪唑，pH7.4）進行洗脫，磁分離，待溶液澄清，收集上清液即為目的蛋白組分CsHIPP26.1。

1.3.5 目的蛋白中離子種類及配體數(shù)量確定

蛋白含量測定：取1?mL分離純化后的目的蛋白，按考馬斯亮藍法測定目的蛋白的濃度，試驗步驟參考文獻[11]，測得目的蛋白濃度（mmol·L-1）。

金屬離子含量測定：取10?mL分離純化液置于四氟乙烯微波消解罐的內(nèi)罐中，加入10?mL HNO3-HClO4（5∶1）混合液，輕微振蕩后靜置20?min，放入微波消解儀中消解，消解完畢后冷卻至室溫，取出內(nèi)罐，將消解液轉(zhuǎn)移至100?mL容量瓶中并定容，最后將溶液通過原子吸收分光光度計，測得目的蛋白中各金屬離子的濃度（mmol·L-1）。

蛋白中離子配體數(shù)計算：蛋白結(jié)合的離子配體數(shù)=金屬離子濃度（mmol·L-1）/蛋白濃度（mmol·L-1）

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性檢驗（=0.05），利用GraphPad Prism 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹擴增

PCR擴增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的檢測，在460?bp左右的位置獲得了目的條帶（圖1），與基因預(yù)測的CDS區(qū)域序列大小完全一致[1]。

圖1 CsHIPP26.1基因RT-PCR擴增

2.2 pET-32a-CsHIPP26.1重組載體的構(gòu)建

將PCR擴增獲得的基因片段連接到大腸桿菌表達載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆的重組質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI進行酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在460?bp附近出現(xiàn)了目的基因條帶，表明原核表達載體構(gòu)建成功。

2.3 pET-32a-CsHIPP26.1重組載體的表達

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21中，利用1?mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達茶樹CsHIPP26.1融合蛋白。從圖3可知，與空白載體相比，重組載體表達的蛋白譜帶在37kDa處有新的條帶，且隨時間的延長表達量增加。由此表明，通過IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中重組的基因能被正確地表達。

2.4 重組菌生長情況分析

將重組菌和對照菌在單一或混合金屬離子溶液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，分析不同離子溶液培養(yǎng)條件下大腸桿菌的生長情況，結(jié)果如圖4所示。除添加Zn2+對對照菌的生長具有明顯的抑制作用外，其余處理對重組菌和對照菌的生長情況沒有顯著影響。由此表明，CsHIPP26.1與Zn2+存在一定的關(guān)聯(lián)。

圖2 pET-32a-CsHIPP26.1重組質(zhì)粒的BamHI和SalI酶切鑒定

圖3 重組載體pET-32a-CsHIPP26.1原核表達

圖4 不同金屬離子下大腸桿菌生長曲線

2.5 CsHIPP26.1蛋白螯合金屬離子種類和含量的分析

將重組菌和對照菌在單一或混合金屬離子溶液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，從菌液中提取純化目的蛋白CsHIPP26.1，并對其螯合的離子含量進行分析，結(jié)果如圖5和圖6所示。結(jié)果表明，經(jīng)單一金屬離子溶液培養(yǎng)處理的重組菌目的蛋白中檢測到的Zn2+、Cu2+含量顯著高于對照（<0.000?1），分別為對照的34.9倍和13.7倍；而重組菌目的蛋白和對照蛋白中Fe3+、Ca2+、Mg2+含量相近，無顯著差異。經(jīng)混合金屬離子溶液培養(yǎng)處理，獲得的重組菌目的蛋白中也可檢測到Zn2+、Cu2+含量顯著高于對照（<0.000?1），分別為對照的42.9倍和6.7倍。與單一金屬離子溶液處理相比，混合離子溶液處理獲得的重組菌目的蛋白中Zn2+比例增加，而Cu2+比例下降，由此表明，CsHIPP26.1蛋白對Zn2+的結(jié)合能力顯著強于Cu2+。

2.6 CsHIPP26.1蛋白螯合金屬離子數(shù)分析

將重組菌分別在添加濃度為0、0.5、5?mol·L-1的ZnCl2、CuCl2溶液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，提取純化目的蛋白CsHIPP26.1，測定和分析蛋白的表達量及螯合金屬離子含量，結(jié)果如表1所示。從表1可知，不同離子濃度培養(yǎng)條件下目的蛋白CsHIPP26.1的表達量無顯著差異，但目的蛋白中Zn2+和Cu2+濃度隨添加離子濃度的增加呈現(xiàn)顯著上升趨勢。當(dāng)添加Zn2+和Cu2+的濃度從0.5?mol·L-1上升到5?mol·L-1時，Zn2+含量與CsHIPP26.1蛋白含量的比值從0.639?9上升到1.975?5，Cu2+含量與CsHIPP26.1蛋白含量的比值從0.406?3上升到0.952?1。根據(jù)CsHIPP26.1蛋白所結(jié)合的金屬離子與目的蛋白質(zhì)量摩爾比推測，每分子蛋白螯合的Zn2+、Cu2+數(shù)目分別為2和1。

3 討論

本研究結(jié)果表明，CsHIPP26.1對Zn2+、Cu2+具有螯合能力，且對Zn2+的結(jié)合能力顯著大于Cu2+，但對Ca2+、Fe3+、Mg2+無螯合能力。已有研究表明，HIPPs蛋白HMA結(jié)構(gòu)域主要結(jié)合的金屬離子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+[4-5]，但不與Co2+、Mn2+、Ca2+離子結(jié)合[6-7]。另外，Dykema等[4]發(fā)現(xiàn)擬南芥中ATFP3（farnesylated protein 3）蛋白也含有HMA結(jié)構(gòu)域，并且證明該類蛋白具有螯合Zn2+、Cu2+的特性，這與本研究CsHIPP26.1蛋白對Zn2+、Cu2+具有螯合能力但不結(jié)合Ca2+的結(jié)果相吻合。

圖6 多金屬離子培養(yǎng)條件下目的蛋白中金屬離子含量

表1 不同金屬離子濃度培養(yǎng)條件下目的蛋白和其螯合的金屬離子含量及比值

通過對CsHIPP26.1蛋白及螯合的金屬離子含量分析，確定了每分子CsHIPP26.1螯合Zn2+、Cu2+數(shù)目分別為2和1。已有研究表明，HIPPs蛋白是通過HMA結(jié)構(gòu)域核心基序CXXC中2個半胱氨酸的巰基與Zn2+、Cu2+結(jié)合[4]。在CsHIPP26.1蛋白的一級結(jié)構(gòu)中，N端的第37—40位氨基酸具有CXXC核心基序[1]，為Zn2+或Cu2+的結(jié)合位點。而本研究發(fā)現(xiàn)，CsHIPP26.1蛋白可以結(jié)合2分子的Zn2+，所以CsHIPP26.1蛋白中還存在其他Zn2+結(jié)合位點。根據(jù)金屬離子螯合理論，除半胱氨酸（C）外，組氨酸（H）的咪唑基、谷氨酸（E）和天冬氨酸（D）的羧基也可與Zn2+螯合。前期研究結(jié)果顯示，在CsHIPP26.1蛋白中還含有3個組氨酸、11個谷氨酸、8個天冬氨酸、2個半胱氨酸[1]，可以為Zn2+提供結(jié)合位點，但具體位點還有待進一步研究。

茶樹黃金芽CsHIPP26.1蛋白在強光下高表達，且與葉色黃化程度正相關(guān)。在響應(yīng)強光時，CsHIPP26.1蛋白是與Zn2+和Cu2+等量結(jié)合還是選擇性地與Zn2+或Cu2+結(jié)合？其功能主要是提高黃金芽在強光逆境的抗性？還是直接調(diào)控光信號傳導(dǎo)途徑或葉綠素代謝途徑相關(guān)酶基因表達的轉(zhuǎn)錄因子？以上問題還有待深入研究。

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Screening and Identification of Chaperone CsHIPP26.1 Chelating Ionsin Tea Cultivar‘Huangjinya’

LIU Fuhao1,2, FAN Yangen1,2, WANG Yu1,2, MENG Fanyue1,2, ZHANG Lixia1,2*

1.College of Horticulture Science and Engineering, Tai'an 271018, China; 2.State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China

Heavy metal-associated isoprenylated plant proteins(HIPPs) is an important metallochaperones due to its unique heavy metal binding domains(HMA) and the structural characteristics of isoprenylation motif.In order to identify the chelating ions of CsHIPP26.1 protein in(L.) cv.‘Huangjinya’, therecombinant plasmids and empty carriers were respectively transferred intoBL21, and then were cultured in LB liquid culture medium with 4?mol·L-1single metal ions (CuCl2, ZnCl2, MgCl2, FeCl3, CaCl2) or multiple metal ions and 1?mmol·L-1IPTG.The growth ofin different ion media was observed, meanwhile the fusion target protein was obtained by His-tag protein purification magnetic bead.The contents of metal ions in fusion protein were analyzed by atomic absorption spectrophotometer, and the number of ions chelated by the protein was calculated.The results show that CsHIPP26.1 protein was only chelated with Zn2+and Cu2+, and the chelating ability to Zn2+was significantly higher than Cu2+.Based on the molar ratio of its bound metal ionsto the target protein, the maximum number of Zn2+, Cu2+chelated by CsHIPP26.1 protein was 2 and 1, respectively.

heavy metal-associated isoprenylated plant protein, CsHIPP26.1, metal ions,

S571.1

A

1000-369X(2022)02-179-08

2021-12-06

2022-02-18

山東省“雙一流”獎補資金項目（SYL2017YY03）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-19-05）、魯渝科技協(xié)作計劃項目（2020LYXZ005）

劉富浩，男，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。*通信作者：lxzhang@sdau.edu.cn

（責(zé)任編輯：黃晨）