林花王欣宇金龍哲刁春研安然武文琳車成來

(1.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.吉林省汪清縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,吉林 汪清 133100)

人參(Panax ginseng G.A.Meyer)為五加科植物，味甘，微苦，性平和，是我國具有代表性的傳統(tǒng)中藥，有多年的中醫(yī)臨床應(yīng)用歷史，具有強(qiáng)大的治愈作用[1]。經(jīng)研究表明，人參皂苷是人參主要的活性成分，其種類和含量是評價人參及其產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。按照人參皂苷苷元的差別，將人參皂苷分成齊墩果酸型皂苷、原人參三醇型皂苷和原人參二醇型皂苷。二醇型人參皂苷含有多種人參皂苷，如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg、Re等，是人參的主要活性成分，具有抗腫瘤[2]、增強(qiáng)免疫[3]、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)[4]、改善心腦血管功能[5]、保護(hù)肝臟[6]、延緩衰[7]等功效。本研究采用高效液相色譜法測定人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd，為人參的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 試驗儀器

高效液相色譜儀(1260,安捷倫)，十萬分之一電子天平(OHAUS)，超聲波清洗機(jī)(KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司)，獨(dú)立超純水系統(tǒng)(OminiG，廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司)，冷凍干燥機(jī)(Benchtop Pro 3L ES-55,SP Scientific),離心機(jī)(TG16-WS,湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)，pH計(STARTER 2100，奧豪斯上?；瘜W(xué)有限公司)。

1.2 試驗試藥

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rb2、Rc、Rd(成都德銳可生物科技有限公司)，氫氧化鈣(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，20160618)，甲醇(沈陽化學(xué)試劑場)，磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，20141009)，乙腈(沈陽化學(xué)試劑場)，乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。人參(長白山紅參)。

2 試驗方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

分別稱取對照品Rb1、Rb2、Rc、Rd各2mg,分別加入甲醇2mL，得到1mg·mL-1的單標(biāo)品溶液，用于人參皂苷的定性分析，確定各個單體的出峰時間。另分別稱取人參皂苷對照品Rb1 2.16mg,Rb2 2.30mg,Rc 2.28mg,Rd 2.10mg,再分別加入2mL甲醇，制備成濃度為1.08mg·mL-1、1.15mg·mL-1、1.14mg·mL-1與1.05mg·mL-1的儲備液，分別從4份儲備液中提取0.25mL，混勻，即得混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

將人參切成1cm3的小塊，再用刀片式粉碎機(jī)粉碎成粗粉，過40目篩，即得人參粗粉。蒸餾水用飽和石灰水調(diào)節(jié)成pH13的堿水，精密稱取人參粉末5g，加入50mL堿水，攪拌均勻，利用超聲清洗機(jī)在溫度20℃，功率180W的條件下堿水超聲提取30min，取出燒杯，將提取液用離心機(jī)進(jìn)行離心5min轉(zhuǎn)速為10000r·min-1，得到濾液進(jìn)行冷凍干燥3d，取出干燥物，磨成粉末，得到粉末1.12g，取粉末500mg，加入50mL甲醇，超聲溶解，即得10mg·mL-1的供試品溶液。

2.2 含量測定方法

2.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱Hypersil Gold C18 (250mm×4.6μm,5μm),檢測波長為203nm，進(jìn)樣量為10μL，柱溫為40℃，流速為1.000mL·mL-1，梯度洗脫如表1所示。

表1 梯度洗脫

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取4種單標(biāo)溶液，分別用移液槍吸取1mL放入4個進(jìn)樣小瓶，在2.2.1色譜條件下進(jìn)行高效液相檢測分析，每種皂苷都會出現(xiàn)其特征峰，記錄出峰時間，用于人參皂苷的定性分析，可用來確定4種人參皂苷混合時的出峰順序。另分別從Rb1、Rc、Rb2、Rd 4種儲備液中各吸取100μL放入同一進(jìn)樣小瓶，各皂苷濃度均為0.25mg·mL-1。分別從4種儲備液中吸取90μL，放入同一進(jìn)樣小瓶，再加入甲醇40μL配制成總體積為400μL，濃度為0.225mg·mL-1的混合對照品溶液。分別從4種儲備液中吸取80μL放入同一進(jìn)樣小瓶，再加入甲醇80μL，配制成總體積為400μL，濃度為0.2mg·mL-1的混合對照品溶液。按此方法，配制出濃度梯度為0.175mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.125mg·mL-1和0.1mg·mL-1、0.075mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.025mg·mL-1的10組混合對照品溶液。將10個濃度梯度的進(jìn)樣小瓶用于高效液相檢測，按照已經(jīng)確定的出峰順序來判斷各個時間所出的峰為哪種人參皂苷，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 精密度試驗

取2.1.1中制備的混合對照品溶液，在2.2.1的色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測分析，每次進(jìn)樣10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，利用得到的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中各個皂苷單體的峰面積計算RSD值。若RSD值均不大于2%，則儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取4種人參皂苷混合的供試品溶液，在0h、2h、4h、8h、12h分別進(jìn)樣10μL，在2.2.1的色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測分析，根據(jù)所得到的混合樣品中各個皂苷單體的峰面積，計算RSD值。如果RSD值不大于2%，則說明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗

精密吸取4種人參皂苷混合的供試品溶液，平均分為5份，在2.2.1的色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測分析，平行5次試驗，根據(jù)所得到的混合樣品中各個皂苷單體的峰面積，計算RSD值。如果RSD值小于3%，則表明重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗

取已被準(zhǔn)確定量的混合對照品溶液：濃度分別為Rb1 0.102mg·mL-1、Rb2 0.128mg·mL-1、Rc 0.128mg·mL-1、Rd 0.111mg·mL-1，從中吸取1mL作為空白樣品溶液。另取濃度為0.1mg·mL-1的單標(biāo)溶液，分別將每種單標(biāo)溶液取0.1mL放進(jìn)空白溶液中。在2.2.1的色譜條件下進(jìn)行HPIC檢測分析，平行5次試驗，根據(jù)所得到的各個皂苷單體的峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計算各個皂苷單體的濃度，從而計算各個單體的加樣回收率。

2.3 樣品測定

將供試品溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜抽濾后，精密吸取1mL，在2.2.1的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣會得到4種單體的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，會計算出每種單體的濃度，繼而可以計算出每種單體的含量，3次進(jìn)樣后每種單體會有3個含量，取平均值。

3 試驗結(jié)果

3.1 人參皂苷的定性分析

取單標(biāo)準(zhǔn)品溶液，根據(jù)2.2.1的色譜條件進(jìn)行4種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rb2、Rc、Rd的定性分析，確定其出峰時間，如圖1～4所示。

圖1 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1色譜圖

圖2 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rc色譜圖

圖3 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb2色譜圖

圖4 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rd色譜圖

結(jié)果顯示，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rc、Rb2、Rd的出峰時間分別為16.000～17.000min、17.000～19.000min、20.000～22.000min、26.000～28.000min。

在2.2.1的液相色譜條件下，將4種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC檢測分析，檢測分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 混合人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rb1,Rc,Rb2,Rd色譜圖

根據(jù)結(jié)果顯示，上述4種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣品中，人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd的出峰時間范圍分別在16.000～17.000min、17.000～19.000min、20.000～22.000min、26.000～28.000min的范圍內(nèi)，因此，混合標(biāo)準(zhǔn)品與各人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品單品所檢測到的出峰時間具有良好的對應(yīng)關(guān)系。從而確定該液相色譜條件能夠很好地分離出4種人參皂苷。

3.2 人參皂苷的定量分析

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取按照濃度梯度稀釋的混合對照品溶液，根據(jù)上述的色譜條件進(jìn)行高效液相檢測，根據(jù)已經(jīng)得知的出峰時間和出峰順序記錄各個人參皂苷單體的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6～9所示。

圖6 人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 人參皂苷Rc的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 人參皂苷Rb2的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程，Rb1：Y=3E+07X+140948，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995；Rc：Y=3E+07X-165794,相關(guān)系數(shù)R2=0.9995；Rb2：Y=2E+07X+55853,相關(guān)系數(shù)R2=0.9995；Rd：Y=3E+07X-155679,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。根據(jù)結(jié)果得知4種人參皂苷有良好的線性關(guān)系。

3.2.2 精密度試驗

通過2.2.3的試驗方法，所得到的峰面積如表2所示。

圖9 人參皂苷Rd的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 精密度

由表2可知，4種人參皂苷的RSD值分別為Rb1是0.54%、Rc是0.86%、Rb2是0.98%、Rd是1.10%，均不大于2%，因此表明儀器精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗

通過2.2.4的試驗方法，所測得的峰面積如表3所示。

表3 穩(wěn)定性

由表3可知，4種人參皂苷的RSD值分別為Rb1是1.2%、Rc是1.5%、Rb2是1.3%、Rd是1.7%，RSD值均不大于2%，因此說明4種人參皂苷的穩(wěn)定性良好。

3.2.4 重復(fù)性試驗

通過2.2.5的試驗方法，檢測所得到的峰面積如表4所示。

表4 重復(fù)性

由表4可知，4種人參皂苷的RSD值分別為Rb1是2.5%、Rc是2.4%、Rb2是2.5%、Rd是2.4%，RSD值均不大于3%，因此表明供試品溶液的重復(fù)性良好。

3.2.5 加樣回收率試驗

通過2.2.6的試驗方法，進(jìn)行測定，計算加樣回收率，所得結(jié)果如表5所示。

表5 加樣回收率

如表5可知，加樣回收率均在95%～105%，RSD值均不大于2%，表明加樣回收率符合標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 樣品測定

取供試品溶液進(jìn)行測定，所得結(jié)果如表6所示。

表6 樣品測定

由表6可知，所測得含量為Rb1是0.522%、Rc是0.679%、Rb2是0.864%、Rd是0.177%。

4 結(jié)論

本文通過高效液相色譜法測定4種人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的含量。此法準(zhǔn)確、有效、經(jīng)濟(jì)、簡便，并且具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，確定了測定的條件方法，驗證了方法的準(zhǔn)確性與可靠性，為人參皂苷的分離提純奠定了基礎(chǔ)。