楊睿，張偉

1.上海市浦東新區(qū)光明中醫(yī)醫(yī)院，上海 201399； 2.上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生健康委員會監(jiān)督所，上海 200135

川楝子為楝科植物川楝的干燥成熟果實，具有舒肝行氣止痛、驅(qū)蟲的功效[1]，臨床上在婦科疾病中應(yīng)用甚廣，特別是治療痛經(jīng)效果顯著[2-9]。川楝子的主要化學(xué)成分為萜類成分，其中，川楝素被認(rèn)為是川楝子的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和毒性成分[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，川楝子有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗肉毒素及抑制腫瘤細(xì)胞生長等作用[14-17]，同時具有肌無力、抑制呼吸中樞及肝腎毒性等不良反應(yīng)[18-20]。現(xiàn)在臨床多將其炮制后及聯(lián)合其他藥物入藥，已達(dá)到“減毒增效”的作用[20-23]。本研究通過處方分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討其治療婦科痛經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 川楝子處方分析調(diào)取上海市浦東新區(qū)光明中醫(yī)醫(yī)院的信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)：2015年11月1日至2020年10月31日期間每月全院隨機抽查的100份中藥處方，全年共計6 000張?zhí)幏健?shù)據(jù)錄入，挑選其中含川楝子的中藥處方1 770張，對患者性別、開處方科室、處方主治疾病等進行分析。

1.2 川楝子活性成分及作用靶點的獲取通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http：：//Isp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)篩選川楝子的活性成分，以口服利用度(oral bioavailabity，OB)≥10%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選條件。將結(jié)果輸入?yún)R集Targetbank、Drugbank、 BindingDB和PDTD四大數(shù)據(jù)庫的Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，Select Targets Set 項選擇Human Protein Targets Only(v2010，2241)，Number of Reserved Matched Targets輸入100，其余參數(shù)均為默認(rèn)，獲得川楝子作用靶點。

1.3 痛經(jīng)靶點的獲取及活性成分-痛經(jīng)直接靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將痛經(jīng)設(shè)置為關(guān)鍵詞輸入GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)，獲得該疾病相關(guān)靶點。再與川楝子作用靶點取交集，獲得川楝子治療痛經(jīng)的直接靶點。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8軟件構(gòu)建川楝子治療痛經(jīng)的活性成分-直接靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析及GO功能富集分析、KEGG通路富集分析將直接靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，限定物種為“Homo sapiens”，置信度設(shè)為≥0.4，獲取靶點PPI、GO生物功能和KEGG通路富集的信息，將其中PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8軟件進行可視化分析。

1.5 核心成分與核心靶點的分子對接使用分子對接方法，先在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載核心成分的結(jié)構(gòu)保存為 mol2 格式。從 PDB 數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)篩選分辨率高、最新上傳的核心靶點蛋白的結(jié)構(gòu)*PDB 格式并下載，用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)和化合物進行去水、加氫等操作，運用Auto Dock1.5.6 軟件將其均轉(zhuǎn)換為*pdbqt 格式并確定盒子大小，運行 Vina 進行對接，最后用 PyMOL 軟件可視化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 含川楝子處方臨床應(yīng)用規(guī)律2015年11月至2020年10月，6 000張中藥飲片處方中含川楝子的1 770張，占總處方29.5%。在這些處方中，女性患者占比83.05%。圖1(A)反映的是含川楝子處方應(yīng)用科室情況，婦科、消化內(nèi)科、肛腸科三個科室占比總和高達(dá)87.57%。主治疾病共27種，頻數(shù)排名前5名的主要疾病如圖1(B)所示，占總處方的83.6%，其中，最高的為痛經(jīng)，占32.19%。

2.2 川楝子的活性成分、作用靶點TCMSP數(shù)據(jù)庫記載的川楝子33個成分中經(jīng)篩選條件后得到14個有效成分：苦楝子酮、豆甾醇、羅漢柏二烯、印楝波力定C、皮樹脂醇、印楝波力定D、蜂花酸、正三十醇、川楝素、蛇菰寧、印楝波力定A、槲皮素、亞麻酸乙酯、甘露醇，在pharmmapper數(shù)據(jù)庫得到的作用靶點去重合并后共305個。經(jīng)分析痛經(jīng)靶點共301個，與川楝子活性成分的作用靶點取交集得到20個治療痛經(jīng)的直接靶點，Venn圖見圖2(A)。將14個活性成分、20個直接靶點導(dǎo)入Cytoscape3.8軟件構(gòu)建川楝子治療痛經(jīng)的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2(B)，圖中共34個節(jié)點，131條邊，其中菱形代表成分，圓形代表靶點，每個成分平均與9.36個靶點相互作用，每個靶點平均與6.55個成分相互作用，體現(xiàn)川楝子治療痛經(jīng)多成分、多靶點共同作用的機制。其中成分(正三十醇、川楝素、印楝波力定D、苦楝子酮)因均能與11個靶點連接、排名最前而在整個網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用。

注：A：川楝子科室處方量；B：川楝子處方病種占比圖1 川楝子處方臨床應(yīng)用規(guī)律

A：Venn圖；B：活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖圖2 川楝子活性成分-直接靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 川楝子的直接靶點PPI分析20個直接靶點在置信度≥0.4的條件篩選下，共產(chǎn)生20個節(jié)點、59條邊，每個靶點平均與5.9個靶點有相互作用。其中靶點EGFR、ESR1、CASP3的節(jié)點度≥10，依次為14、12、11。其中圓形代表靶點，圓的大小、顏色深淺與節(jié)點度的高低成正比，見圖3。

2.4 川楝子直接靶點的GO生物功能和KEGG通路分析選取GO生物功能分析按綜合排名各前5條生物過程、分子功能、細(xì)胞成分，與綜合排名前5條KEGG通路富集的結(jié)果進行分析，結(jié)果見表1。其中，內(nèi)分泌抵抗和雌激素信號通路與治療痛經(jīng)關(guān)聯(lián)較大。

2.5 分子對接驗證川楝子治療痛經(jīng)的核心成分與靶點的結(jié)合作用結(jié)合高節(jié)點度靶點和KEGG通路的功能信息，ESR1(雌激素受體α)有可能在川楝子治療痛經(jīng)中發(fā)揮重要作用。在PDB數(shù)據(jù)庫中挑選ESR1蛋白列表中解析方法為“X-RAY DIFFRACTION 1.8 ?”。2021年1月20日上傳數(shù)據(jù)庫、人源的6ZOQ號結(jié)構(gòu)為受體，苦楝子酮、川楝素、正三十醇、印楝波力定D的小分子結(jié)構(gòu)作為配體，兩兩進行分子對接。分子對接示意圖和具體相互作用的氨基酸展示見圖4。各組分子對接結(jié)合能、pharmmapper數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點 z′score 分?jǐn)?shù)、口服利用度、類藥性的信息見表2。

圖3 川楝子治療痛經(jīng)直接靶點的相互作用

表1 川楝子治療痛經(jīng)直接靶點的GO生物功能和KEGG通路分析

注：A：苦楝子酮；B：川楝素；C：正三十醇；D：印楝波力定D圖4 ESR1與川楝子治療痛經(jīng)核心化合物的分子對接圖

表2 川楝子治療痛經(jīng)核心成分的藥動學(xué)參數(shù)及其與 ESR1 的結(jié)合數(shù)據(jù)

3 討論

痛經(jīng)為最常見的婦科疾病之一，通常伴隨腰痛、腹痛等癥狀，以難治愈、需長期持續(xù)治療為特點，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生可能與子宮、內(nèi)分泌、精神等有關(guān)[24]，但迄今為止尚無統(tǒng)一意見。根據(jù)文獻(xiàn)報道與我們的處方分析結(jié)果，川楝子用于治療婦科痛經(jīng)病歷史悠久，效果顯著，中醫(yī)藥治療痛經(jīng)的處方中與延胡索、香附等配伍，共奏行氣止痛之功，但是其治療婦科痛經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制均尚未明確。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，305個川楝子作用靶點中有20個為文獻(xiàn)報道過的與痛經(jīng)相關(guān)的靶點，故推測這20個靶點為川楝子治療痛經(jīng)的直接靶點，并據(jù)此開展活性成分——直接靶點網(wǎng)絡(luò)、PPI、GO功能和KEGG通路富集等生物信息學(xué)分析。在活性成分-直接靶點網(wǎng)絡(luò)中，4個成分(正三十醇、川楝素、印楝波力定D、苦楝子酮)均能與11個靶點連接、排名最前在整個網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，故推測其為核心成分。在直接靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中，有3個靶點(EGFR、ESR1、CASP3)相互作用節(jié)點度大于10。其中，表皮生長因子受體在許多上皮組織源性腫瘤上高表達(dá)，是一種重要的腫瘤標(biāo)志物[25]。CASP3是半胱氨酸肽酶3，參與蛋白水解、細(xì)胞凋亡的過程。而ESR1是雌激素受體α，一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，可與雌激素受體2形成同二聚體或異二聚體，對性發(fā)育和生殖功能至關(guān)重要。由于女性月經(jīng)周期本就由雌激素分泌參與調(diào)控，痛經(jīng)與雌激素的關(guān)聯(lián)不言而喻，故推測其是川楝子治療痛經(jīng)的核心靶點。KEGG通路富集排名前五的通路發(fā)現(xiàn)，內(nèi)分泌抵抗通路的核心是雌激素類藥物，與乳腺疾病相關(guān)，對應(yīng)的川楝子靶點為MMP2、EGFR、ESR2、MMP9、ESR1、MDM2。而雌激素信號通路主要通過雌激素與受體結(jié)合而發(fā)揮作用，在雌性第二特征維持、乳腺癌等發(fā)生發(fā)展中有重要作用，對應(yīng)的川楝子靶點為MMP2、EGFR、ESR2、MMP9、ESR1、NOS3。2條信號通路的功能和靶點高度重合，與痛經(jīng)、雌激素均緊密相關(guān)，且核心靶點ESR1均在其中，故推測川楝子可能通過調(diào)控ESR1參與這2條通路來治療痛經(jīng)。

從分子結(jié)構(gòu)角度驗證4個核心成分與治療痛經(jīng)核心靶點ESR1的關(guān)系。分子對接結(jié)果中結(jié)合能小于0，說明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，數(shù)值越低證明親和力越大。z′score是pharmmapper數(shù)據(jù)庫中結(jié)合了分子擬合分?jǐn)?shù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有資料的算法分?jǐn)?shù)，數(shù)值大小與其是靶點的可能性成正比，范圍一般在0.5～2.5。OB是重要的藥動學(xué)參數(shù)之一，表示口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達(dá)體循環(huán)并被吸收的速度與程度，值越高通常表示藥物的生物活性分子越好。DL指化合物與已知藥物的相似性，值越高意味著具有成為藥物的可能性越大。本研究的結(jié)果提示，ESR1與4個核心成分均有結(jié)合位點，初步驗證了我們的猜想，其中苦楝子酮的親和力最大。其他3個藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果中，苦楝子酮以1.33的z′score、40.73%的口服利用度、0.81的類藥性表現(xiàn)出有成為治療痛經(jīng)藥物的潛力?？嚅油莵碓创ㄩ?、苦楝子的黃酮類成分，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其能抑制黃病毒、沙門氏菌等[26-27]，尚無關(guān)聯(lián)痛經(jīng)的報道。

綜上所述，本研究通過處方分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川楝子廣泛應(yīng)用于治療婦科痛經(jīng)。檢索篩選出14個川楝子活性成分、20個治療痛經(jīng)直接靶點，活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)包含34個節(jié)點與131條邊，直接靶點PPI網(wǎng)絡(luò)包含20個節(jié)點與59條邊。其中，川楝素、苦楝子酮、正三十醇、印楝波力定D為核心成分，ESR1為核心靶點。KEGG富集分析出川楝子治療痛經(jīng)與內(nèi)分泌抵抗、雌激素這2條信號通路有關(guān)。分子對接提示苦楝子酮與ESR1結(jié)合活性最佳，首次預(yù)測苦楝子酮與ESR1、內(nèi)分泌抵抗通路的關(guān)系，為闡釋川楝子治療婦科痛經(jīng)的機制提供理論基礎(chǔ)。