高 尚， 曹小勇， 胡選萍， 蔣景龍， 秦公偉， 趙 垚

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院陜西省資源生物重點實驗室, 漢中723000)

天麻(GastrodiaelataBI.)又名定風(fēng)草、離合草、仙人腳、鬼督郵、赤箭等，屬蘭科(Orchidaceae)、樹蘭亞科(Epidendroidae)、天麻族(Gastrodieae)、天麻亞族(Gastrodinae)，是與真菌共生的多年生異養(yǎng)草本植物[1-2]。具鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁、抗焦慮、抗氧化、防病毒和抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性[3]。天麻不能自花授粉，而人工授粉可大幅度提高其產(chǎn)種量[4]。天麻種子細小如塵，自然條件下難以萌發(fā)，利用萌發(fā)菌在人工培養(yǎng)條件下進行共生萌發(fā)是解決這一問題的有效途徑[5]。關(guān)于蘭科植物果實及種子形態(tài)研究方面，楊文權(quán)[6]研究傳統(tǒng)授粉方式(不取唇瓣)和改進授粉方式(用授粉針挑掉唇瓣甚至花被筒的前面部分，然后進行授粉)對天麻果實的影響，統(tǒng)計了天麻果實、種子及種胚的大??；周元等[7]對不同授粉方式下的天麻果實、果實中種子和種胚的大小進行統(tǒng)計；Kiyohara等[8]測量了68種日本蘭科植物的種子和胚的大小。

關(guān)于不同授粉量對植物果實發(fā)育及結(jié)實影響研究較少，徐義流等[9]研究了不同品種花粉和授粉量對碭山酥梨果實萼片的影響。在蘭科植物方面Proctor等[10]用不同的授粉量對3種蘭科植物進行人工授粉研究；Nazarov等[11]表明蘭科植物花粉聚合成花粉塊，以“全或無”的方式進行授粉，花粉/胚珠的值不同種類變化不大，而每個柱頭上花粉的量不同種類變化大。Vale等[12]檢測了3種古巴布魯通蘭屬(Broughtonialindenii)植物花粉塊的數(shù)量和類型對果實和種子產(chǎn)量的影響，試驗包括：1枚小花粉團/1朵花，4枚小花粉團/1朵花，1枚大花粉團/1朵花，4枚大花粉團/1朵花。結(jié)果顯示：4種處理的花都能結(jié)果，果實大小和發(fā)育良好種子的比例顯然受到花粉的數(shù)量影響，而不是花粉塊的類型。1枚花粉塊處理的花朵，其果實長度較小并且發(fā)育良好的種子數(shù)量較少。但目前還未發(fā)現(xiàn)利用人工對蘭科植物切分的花粉塊進行授粉的研究，因此本文利用天麻作為試驗材料，以完整花粉塊為對照，在解剖鏡下將花粉塊切分成1/2、1/4、1/8、1/16，研究不同授粉量對天麻果實發(fā)育及結(jié)實影響，通過測量、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果分析，說明不同授粉量對果實、種子發(fā)育影響，并且為其他蘭科植物的研究提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所用天麻花序為采自陜西省漢中市留壩縣的天麻塊莖在實驗室中培育而成，果實和種子選自2019年培育成品。

1.2 儀器

解剖針、鑷子、解剖鏡、天平、尺子、體視顯微鏡(Leica M205C)、電子天平(梅特勒 AI204)

1.3 方法

人工授粉：花藥內(nèi)的花粉塊含2個花粉團，組成花粉塊的花粉粒呈微黃色，近球形，花粉粒之間都黏在一起，用解剖針在Nikon SMZ800解剖鏡下將完整花粉塊切分為原來的1/2、1/4、1/8、1/16(圖1)，以完整花粉塊授粉作為對照，并將切分好的花粉塊分別放在不同天麻花的柱頭上，每個處理重復(fù)20個。

(a)完整花粉;(b)花粉塊由大到小分別為1/2、1/4、1/8、1/16。圖1 完整花粉塊及切分后不同大小的花粉塊Figure 1 The whole pollinarium and different sizes of dividedpollinarium

指標測量：用體視顯微鏡(Leica M205C)對浸濕的種子進行拍照，Digimize軟件測量果實、種子和種胚的形態(tài)大小(長度、寬度)。用十萬分之一的電子天平(梅特勒 AI204)測量果實干、鮮重和單顆果實種子總干重(種子干重)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5、spss10.0進行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，使用tukey檢驗進行組間差異顯著性檢驗(P<0.05)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同授粉量對果實形態(tài)大小和重量的影響

不同授粉量影響果實大小、重量。完整花粉塊(對照)授粉的天麻果實長度、寬度分別為1.56 cm、0.72 cm，鮮重、干重分別為0.23 g、0.03 g(圖2)，1/2授粉量的與對照無顯著差異，1/4授粉量及以下時，果實的形態(tài)大小和重量均明顯下降。1/4、1/8、1/16授粉量的果實長度、寬度、鮮重之間無差異[圖2(a)(b)(d)]，授粉量1/8和1/16的果實干重?zé)o差異，見圖2(c)。1/4、1/8、1/16授粉量的果實長度分別為1.41 cm、1.34 cm、1.31 cm；果實寬度分別為0.61 cm、0.61 cm、0.57 cm；果實鮮重分別為0.16 g、0.14 g、0.13 g；果實干重分別為0.03 g、0.02 g、0.02 g。

(a)果實長度；(b)果實寬度；(c)果實干重；(d)果實鮮重。不同小寫字母表示不同授粉量下的各組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖2 不同授粉量對果實的影響Figure 2 The effects of different pollen load on fruits

2.2 不同授粉量對種子及種胚形態(tài)大小、果實中種子總重量的影響

不同授粉量對種子長度和種胚的大小沒有影響，與對照相比，種子寬度略有增加。完整花粉塊(對照)授粉的天麻種子長度、寬度分別約為0.56 mm、0.13 mm，種胚長度、寬度分別約為0.16 mm、0.10 mm(圖3)，不同授粉量(1/2、1/4、1/8、1/16)的種子長度、種胚長度和寬度與對照無差異，見圖3(a)(c)和(d)；不同授粉量(1/4、1/8、1/16)的種子寬度與對照組具有差異，并且授粉量越低，種子寬度越大，見圖3(b)。

(a)種子長度；(b)種子寬度；(c)種胚長度；(d)種胚寬度；(e)種子干重。不同小寫字母表示不同授粉量下的各組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖3 不同授粉量對種子及種胚大小影響Figure 3 The effect different pollen load on seed and embryo size

不同授粉量對單顆果實中的種子總干重具有影響，且授粉量越低，總干重越小。授粉量1/2與授粉量1的種子干重都約為0.006 g，授粉量1/4和授粉量1/8的種子干重約為0.003 g和0.0016 g。說明在授粉量為1/2、1/4和1/8時，花粉量與果實中凈種子干重成正比，見圖3(e)。

2.3 不同授粉量的天麻果實大小與果實內(nèi)種子總干重的關(guān)系

天麻果實大小與果實內(nèi)種子總干重的相關(guān)性分析結(jié)果如表1所示，果實長度、果實寬度與果實內(nèi)種子總干重的相關(guān)性呈強相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為0.975和0.977)，說明果實越大，果實內(nèi)種子總干重越高。以上可以得出：天麻果實大小可以作為評價果實內(nèi)部種子量的依據(jù)。

表1 天麻果實大小與果實內(nèi)種子總干重的相關(guān)性分析Table 1 The correlation of fruit size and total dry weightof seeds in fruit of Gastrodia elata

3 討論與結(jié)論

在蘭科植物花藥形態(tài)方面，孫崇波等[13]利用掃描電鏡對蘭科常見栽培植物5屬10種21個品種(系)的花粉塊形態(tài)進行了觀察，表明花粉塊表面形態(tài)在屬間差異較大，在蘭屬的種間也有一定的差異，但在蘭屬種內(nèi)品種間則差異較小；李璐等[14]研究了巾唇蘭(Pennilabiumyunnanense)的花粉團發(fā)育，表明巾唇蘭花粉塊由2個球形花粉團、粘盤和粘盤柄組成，與天麻相似；天麻花藥內(nèi)的花粉塊含2個花粉團，組成花粉塊的花粉粒呈微黃色，近球形。

在不同授粉量對果實和種子影響研究方面，國內(nèi)外研究較少，在非蘭科植物中，徐義流等[9]研究了不同品種花粉和授粉量授粉對碭山酥梨果實萼片的影響，研究表明：適當降低花粉濃度有利于提高果實脫萼率；在蘭科植物方面，Proctor等[10]用不同的授粉量對3種蘭科植物(Cypripediumcalceolus,Amerorchisrotundifolia,Calypsobulbosa)進行人工授粉，對蒴果稱重，并通過液體懸浮進行二次采樣來估計種子數(shù)，表明授粉量影響C.bulbosa的種子數(shù)量，但對C.calceolus或A.rotundifolia沒有顯著影響，說明天麻與C.bulbosa相似；Vale等[12]研究了3種古巴布魯通蘭屬(Broughtonialindenii)植物，檢測了花粉塊的數(shù)量和類型對果實和種子產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明果實大小和發(fā)育良好種子的比例顯著受到花粉塊的數(shù)量影響，而不是花粉塊的類型。本研究是人為將天麻花粉塊進行切分，完整花粉塊和不同大小花粉塊對天麻進行授粉之后，子房發(fā)育為果實，而后結(jié)實，通過測量和數(shù)據(jù)整理分析發(fā)現(xiàn)授粉量降低影響果實大小和重量，但對種子和種胚的形態(tài)影響不大。授粉量為1/2與授粉量為1的果實大小、重量無差異，而花粉量為1/4及以下時，與對照的差異顯著，說明花粉越少，果實越小，可能是由于化學(xué)刺激或物理刺激(發(fā)育胚珠較少)下降所導(dǎo)致，研究發(fā)現(xiàn)，少量的NAA也可刺激天麻果實發(fā)育并且果實內(nèi)部有少量的無胚種子，可能是由于化學(xué)刺激減少所導(dǎo)致的。

花粉數(shù)量與胚珠數(shù)量的比值(P/O)是生殖系統(tǒng)的一個重要定量特征。 Cruden認為：P/O反映了產(chǎn)生最大的種子數(shù)與到達每個柱頭足夠花粉粒數(shù)量關(guān)系?；ǚ蹅鬟f效率越高，P/O應(yīng)該越低，他回顧了96種植物物種的P/O比率，發(fā)現(xiàn)比率與有性生殖系統(tǒng)相關(guān)(r=0.947)，P/O比在閉花受粉的平均水平為4.7，專性自花授粉的為27.7，兼性自花授粉的為168.5，兼性異花授粉的為796.6，異花授粉的為5 859.2[15]。然而，一些兼性和專性異花授粉的物種，比如柳葉菜科、含羞草科、蘿藦科是不遵循Cruden規(guī)則的，在柳葉菜科(407)，含羞草科(559)和蘿摩科(7)低P/O比率被認為是通過聚集花粉提高花粉效率。柳葉菜科的一些花粉結(jié)成塊，在含羞草和蘿摩科中以花粉聚合的方式出現(xiàn)[16]。因此，隨著花粉聚集體大小的增加，柳葉菜科、含羞草科和蘿摩科的P/O比值降低。蘭花也不遵循Cruden規(guī)則，在一些異花授粉的蘭科植物中P/O比值3.9～24.0變化[17-18]；Nazarov等[11]研究表明蘭科植物對應(yīng)子房有大量的胚珠，花粉聚合成花粉塊，P/O的值不同種類變化不大，而每個柱頭上花粉的量不同種類變化大，相近種類的柱頭面積與胚珠數(shù)量相關(guān)，軟質(zhì)和可分性的花粉，柱頭面積越大，可接受的花粉越多，在不同屬之間則相反，對硬質(zhì)花粉，由于不可分，以全或無的方式進行授粉，蘭花花粉量：胚珠量=1.2～3.2。本研究天麻花粉粒聚合成由兩個花粉團組合成一個花粉塊，不易切分(圖1)，授粉量1/2與對照的種子干重都約為0.006 g，授粉量1/4和1/8的種子干重約為0.003 g和0.001 6 g，說明1/2的花粉塊可以讓天麻果實內(nèi)部所有胚珠發(fā)育，并且授粉量1/4時的種子干重約為授粉量1/2的一半，1/8為1/4的一半，推測天麻的花粉數(shù)量與胚珠的數(shù)量比值接近2∶1，符合上述前人的研究結(jié)果。

蘭科植物種子形態(tài)變化很大，Molvray[19]將種子分成5類：梭形或紡錘形、線狀或絲狀、棒狀、橢球形及帶翅狀；Barthlott[20]僅將種子形態(tài)區(qū)分為3類：鋸屑狀、絲狀和有翅的。就當前對蘭科植物果實、種子和種胚研究而言，Shimizu等[21]研究了61種日本蘭科植物，通過掃描電鏡觀察，大多數(shù)附生、生長在濕潤陸地和林下明亮環(huán)境中的種子為橢圓形；一些生長在陸地黑森林中的種子極其長且窄，僅Galeolaseptentrionalis的種子為碟形，中央部分膨出；日本黑森林濕度大、風(fēng)力弱，種子長且窄有利于散播，說明種子的形態(tài)與植物生長環(huán)境有關(guān)。Kiyohara 等[8]測量了68種日本蘭科植物的種子和胚的大小，大多數(shù)種子的長度為0.3～2 mm，寬度為0.07～0.2 mm，種胚的長度和寬度分別為0.1～0.3 mm和0.04～0.2 mm。周元等[7]對不同授粉方式下的天麻果實、果實中種子和種胚的大小進行統(tǒng)計，研究表明該實驗所選天麻的果實長度、寬度和重量分別為1.74 cm、0.92 cm、0.41 g， 種子的長度、寬度和果實中種子總重量分別為0.52 mm、0.13 mm、0.04 g，種胚的長度及寬度分別為0.17 mm和0.08 mm。楊文權(quán)[6]研究傳統(tǒng)授粉方式(不去唇瓣)和改進授粉方式對天麻果實的影響，以觀察這兩種授粉方式對天麻的果實、種子及種胚的影響，研究表明紅天麻果實長度、寬度和重量分別為1.68 cm、0.68 cm、0.34 g，種子長度、寬度分別為0.58 mm、0.14 mm，種胚的長度及寬度分別為0.17 mm和0.08 mm。本實驗所測完整授粉的天麻果實長度和寬度、鮮重和干重、種子長度、寬度、種胚長度和寬度、果實中種子的凈干重，與上述前人的研究結(jié)果類似，說明天麻果實和種子的發(fā)育很穩(wěn)定，并且外界環(huán)境對天麻果實與種子的形態(tài)影響很小。

本研究以完整花粉塊為對照，在解剖鏡下將花粉塊切分成1/2、1/4、1/8、1/16，于授粉后16 d對天麻果實和種子的各項數(shù)據(jù)進行測量，表明授粉量降低影響天麻果實大小和重量，但對種子和種胚的形態(tài)影響不大。完整授粉的天麻果實長度、寬度分別為1.56 cm、0.72 cm，鮮重和干重分別為0.23 g、0.03 g，種子長度、寬度分別為0.56 mm、0.13 mm，種胚長度、寬度分別為0.16 mm、0.10 mm，果實中種子的凈干重為0.006 g，推測天麻的花粉數(shù)量與胚珠的數(shù)量比值接近2∶1，說明天麻的傳粉效率極高，表明此方法可以作為研究其他蘭科植物花粉數(shù)量與胚珠比值的新方法。