楊 蕾， 敖智廣， 項(xiàng) 坤， 何佳萌， 常 苗， 李 棟， 茆燦泉

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院四川省天然藥物仿生合成工程研究中心， 成都610031)

在抗擊新冠肺炎(COVID-19)疫情的全過(guò)程中，中醫(yī)藥全面、深度參與，從預(yù)防、治療到康復(fù)的全環(huán)節(jié)發(fā)揮了不可替代的重要作用[1]。我國(guó)各省市已廣泛開展中醫(yī)藥治療COVID-19的研究，并逐漸形成各自地方特色的治療方案。天然植物抗菌液(Natural plant antimicrobial solutions，PAMs)是由云南普洱丹州制藥股份有限公司研發(fā)的從多種傳統(tǒng)中草藥中提取制備的一種復(fù)方產(chǎn)品。2015年，其升級(jí)產(chǎn)品“紫云解毒止痛酊”獲云南省食品藥品管理局批準(zhǔn)為醫(yī)院制劑(滇藥制字Z20150009)。前期研究表明，PAMs具有抗菌消炎、止痛、促進(jìn)創(chuàng)口愈合等多種生物學(xué)功效[2-4]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多途徑-多成分-多靶點(diǎn)的全面調(diào)控，從分子和生物學(xué)的角度將中藥的有效成分與疾病的靶點(diǎn)相聯(lián)系，為中藥藥理藥效提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)支撐[5]。本研究期待通過(guò)PAMs作用于SARS-CoV-2的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探究，并結(jié)合其抗M13噬菌體病毒的作用測(cè)定結(jié)果，初步推斷PAMs潛在抗新型冠狀病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制，為PAMs在抗COVID-19中的可能應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 PAMs化學(xué)成分收集

通過(guò)TCMSP、BATMAN、YaTCM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索PAMs復(fù)方5種藥材(紅花、紫草、艾納香、蕓香草、刺天茄)所含的化合物，在TCMSP和YaTCM數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定類藥性(Drug-Likeness，DL)DL ≥0.18，BATMAN數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定Score≥20，對(duì)PAMs的活性成分進(jìn)行篩選。

1.2 藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

成分篩選結(jié)束后，收集成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息并統(tǒng)一在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行規(guī)范化整理。

1.3 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以冠狀病毒“coronavirus”、肺炎“pneumonia”為關(guān)鍵詞分別進(jìn)行檢索，獲得疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 潛在作用靶點(diǎn)的獲取

分別將藥物靶點(diǎn)、冠狀病毒疾病靶點(diǎn)以及疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1在線作圖工具平臺(tái)，對(duì)三者取交集，繪制韋恩圖，作為PAMs的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物潛在作用靶點(diǎn)及其所對(duì)應(yīng)的化合物導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建藥材-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，并對(duì)各個(gè)節(jié)點(diǎn)度的大小進(jìn)行分析。

1.6 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將藥物潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件的Bisogenet插件，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件的cytoNCA對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。

1.7 GO和KEGG富集分析

使用R語(yǔ)言對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，分別選取富集結(jié)果的前20名，繪制得到柱狀圖和氣泡圖。使用Cytoscape軟件構(gòu)建KEGG關(guān)系調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.8 分子對(duì)接

在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Mpro(PDB ID：6LU7)、ACE2(PDB ID：1R42)以及S刺突糖蛋白(PDB ID：5WGR)的3D結(jié)構(gòu)圖。從Pubchem獲取PAMs主要活性成分槲皮素(CID：5280343)、芹菜素(CID：5280443)、熊果酸(CID：64945)、木犀草素(CID：5280445)、山奈酚(CID：5280863)、楊梅素(CID：5281672)以及黃芩素(CID：5281605)的2-D結(jié)構(gòu)。選取洛匹那韋(CID：92727)、利巴韋林(CID：37542)、瑞德西韋(CID：12304016)、阿奇霉素(CID：447043)以及硫酸羥基氯喹(CID：12947)作為陽(yáng)性對(duì)照。將各藥物分子及受體蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock Tools進(jìn)行去水、加氫、平衡電荷等預(yù)處理；將處理后的文件輸入PyRx軟件，采用vina模塊進(jìn)行半柔性分子對(duì)接，計(jì)算次數(shù)設(shè)置為9次，其余參數(shù)為默認(rèn)。選取每個(gè)藥物分組與受體蛋白結(jié)合最低的一組，使用PyMOL軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.9 PAMs對(duì)M13噬菌體的抑制作用

挑取噬菌體單克隆，擴(kuò)增，將其滴度調(diào)整至1.0×1010pfu/μL。使用LB液體培養(yǎng)基稀釋PAMs，使其終濃度為4.0%～20.0%；同時(shí)設(shè)置LB空白對(duì)照組、食用酒精對(duì)照組(濃度為2.0%～10.0%)。取1.0 μL稀釋好的噬菌體液分別與200.0 μL實(shí)驗(yàn)組、空白組、酒精對(duì)照組混合，作用4 h，4 ℃輕微振蕩。測(cè)定作用結(jié)束后的噬菌體滴度，計(jì)算PAMs對(duì)噬菌體的抑制作用(IR)，公式為IR=(1-N/N0)×100%

式中，N為酒精處理后噬菌體的滴度；N0為投入噬菌體滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAMs活性成分及靶點(diǎn)獲取

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共得到PAMs中活性成分166個(gè)，其中花生酸、咖啡酸、槲皮素、油酸、棕櫚酸和硬脂酸為多種藥材共同含有。對(duì)各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)去重后，一共得到藥物靶點(diǎn)1 007個(gè)。

表1 藥材-成分-靶點(diǎn)信息總結(jié)

2.2 疾病靶點(diǎn)及藥物潛在作用靶點(diǎn)獲取

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共得到與冠狀病毒相關(guān)的基因351個(gè)，與肺炎相關(guān)的基因4 575個(gè)。對(duì)疾病靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)三者取交集，共得到73個(gè)PAMs潛在作用靶點(diǎn)(圖1)。

圖1 PAMs與冠狀病毒靶點(diǎn)交集韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the intersection of PAMs andCoronavirus targets

2.3 藥材-成分-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將73個(gè)潛在作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件，構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖2)。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括186個(gè)節(jié)點(diǎn)(其中5種藥材，108個(gè)化合物，73個(gè)基因)，511條邊。結(jié)果采用度值進(jìn)行排序，槲皮素、芹菜素、熊果酸、木犀草素、山奈酚、楊梅素、黃芩素、油酸、水楊酸等9個(gè)化學(xué)物均能與10個(gè)以上的靶點(diǎn)相結(jié)合，推測(cè)其可能為PAMs抗新型冠狀病毒的關(guān)鍵成分。PTGS2、PTGS1、PPARG、DPP4、CALM1、CASP3、PELA、BAX等8個(gè)基因的度數(shù)均>10，推測(cè)其可能是PAMs抗SARS-CoV-2的關(guān)鍵作用基因靶點(diǎn)。

2.4 PPI互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將73個(gè)潛在藥物作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Bisogenet軟件，得到PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)(圖3)。該原始網(wǎng)絡(luò)共包含4256個(gè)節(jié)點(diǎn)，99 375條邊，節(jié)點(diǎn)度中位數(shù)為26。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度中位數(shù)2倍(DC≥52)進(jìn)行篩選，得到子網(wǎng)絡(luò)(b)。子網(wǎng)絡(luò)(b)共有1 118個(gè)節(jié)點(diǎn)，介度中心度中位數(shù)為406，根據(jù)介度中心度的中位數(shù)2倍(BC≥812)進(jìn)行篩選，得到子網(wǎng)絡(luò)(d)。子網(wǎng)絡(luò)(d)共有316個(gè)節(jié)點(diǎn)，緊密中心度中位數(shù)為0.56，根據(jù)CC≥0.56過(guò)濾，得到子網(wǎng)絡(luò)(c)。子網(wǎng)絡(luò)(c)共有158個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中NTRK1、RELA、RB1、CDK2、RNF2、 EGFR、TP53、AR、FUS等靶點(diǎn)蛋白排名靠前，推測(cè)可能為PAMs的重要作用靶點(diǎn)。

ANX、HH、CTQ、ZC、YXC分別代表艾納香、紅花、刺天茄、紫草、蕓香草。圖2 藥材-成分-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Network for medicinal plant-ingredient-target-diseaseregulation

(a)PAMs抗冠狀病毒潛在靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；(b)根據(jù)DC≥52，從(a)中提取關(guān)鍵蛋白創(chuàng)建的子網(wǎng)絡(luò)；(d)根據(jù)BC≥812，從(b)中提取關(guān)鍵蛋白創(chuàng)建的子網(wǎng)絡(luò)；(c)根據(jù)CC≥0.56，從(d)中提取關(guān)鍵蛋白創(chuàng)建的子網(wǎng)絡(luò)。圖3 PAMs與潛在蛋白靶點(diǎn)的PPI互作網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI interaction network between PAMs and potentialprotein targets

2.5 GO和KEGG富集分析

73個(gè)潛在藥物靶點(diǎn)經(jīng)過(guò)R軟件運(yùn)行后，共得到GO富集分析(P<0.05)2 109個(gè)條目，其中包括1 952個(gè)生物學(xué)過(guò)程(Biological process，BP)、50個(gè)細(xì)胞組分(Cell component，CC)和107個(gè)分子功能(Molecular function，MF)。生物學(xué)過(guò)程主要與脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞因子生成的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)等相關(guān)；細(xì)胞組分主要涉及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、核孔復(fù)合體、線粒體等；分子功能主要集中在與細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子受體以及蛋白磷酸酶等的結(jié)合[圖4(a)(b)(c)]。KEGG富集分析共得到144條信號(hào)通路，其中人巨細(xì)胞病毒感染、TNF、甲型流感信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒信號(hào)通路等被顯著富集[圖4(d)]。使用Cytoscape構(gòu)建KEGG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路，該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共有69個(gè)節(jié)點(diǎn)(20個(gè)信號(hào)通路、49個(gè)基因)，359條邊。節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)度數(shù)成正比(圖5)，與炎癥、病毒相關(guān)信號(hào)通路在PAMs抗冠狀病毒及肺炎中可能起著關(guān)鍵調(diào)控作用，RELA、 MAPK1、NFCCL2、MAPK14、CASP3、TNF等為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

(a)生物過(guò)程；(b) 細(xì)胞組分；(c)分子功能；(d)KEGG富集分析。圖4 GO和KEGG富集分析Figure 4 GO and KEGG enrichment analysis

圖5 基因-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖Figure 5 Regulation network for gene and signaling pathway

2.6 PAMs主要成分與SARS-CoV-2相關(guān)蛋白的分子對(duì)接

將PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中最新解析的SARS-CoV-2關(guān)鍵蛋白Mpro、S刺突糖蛋白以及受體蛋白ACE2的3-D結(jié)構(gòu)作為蛋白受體分子，將藥材復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中化合物度數(shù)排名前7的化合物以及幾種對(duì)照藥物作為配體與之對(duì)接，結(jié)果如表2所示。根據(jù)結(jié)合能大小判斷結(jié)合能力強(qiáng)弱，PAMs中排名前3的化合物與受體蛋白的結(jié)合模式圖(圖6)。

2.7 PAMs抗M13噬菌體作用

PAMs對(duì)M13噬菌體的影響由圖7可知，隨著PAMs濃度增加，抑制率也隨之上升。PAMs濃度為4.0%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%時(shí)，抑制率均值分別為36.3%、39.5%、63.2%、70.0%、99.1%。

表2 PAMs主要成分與SARS-CoV-2關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白的分子對(duì)接結(jié)果

(a)(b)(c) 槲皮素、黃芩素以及楊梅素與AEC2分子對(duì)接；(d)(e)(f)槲皮素、黃芩素以及木犀草素與Mpro分子對(duì)接；(g)(h)(i)槲皮素、黃芩素以及木犀草素與S刺突糖蛋白分子對(duì)接。圖6 PAMs主要核心成分與新冠病毒關(guān)鍵蛋白分子對(duì)接Figure 6 Molecular docking of the main active components of PAMsto the keyproteins of SARS-CoV-2

圖7 PAMs對(duì)M13噬菌體的抑制作用Figure 7 Inhibitory effects of PAMs for M13 phages

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，共檢索到PAMs潛在的活性化合物166個(gè)，主要來(lái)源于紅花和紫草兩種藥材，并實(shí)驗(yàn)測(cè)定了PAMs對(duì)M13噬菌體病毒的抑制作用。前期本實(shí)驗(yàn)室對(duì)PAMs的研究顯示，其可有效調(diào)控TNF-α和NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)IL-6、IL-8等炎癥因子，具有顯著的消炎抗菌效果[3]。研究報(bào)道，TNF-α、IL-6、IL-8等可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)，導(dǎo)致患者肺部炎癥的加劇[6]。PAMs在COVID-19防治中可能具有激活免疫、抗菌消炎以及抗病毒的作用。同時(shí)PAMs的多重功效，對(duì)合并有基礎(chǔ)病的患者，可以起到綜合防治的輔助作用。

Mpro在病毒的蛋白酶切過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，抑制Mpro可以有效阻斷病毒的復(fù)制[7]。ACE2是嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒(SARS-CoV)以及SARS-CoV-2的人宿主細(xì)胞受體，SARS-CoV-2通過(guò)其表達(dá)的S刺突糖蛋白與人體ACE2結(jié)合，從而導(dǎo)致病毒侵入人體[8]。研究顯示通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的S刺突糖蛋白與ACE2的親和力是SARS病毒的10～20倍，推測(cè)其可能是SARS-CoV-2高傳染率的真兇[9]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析可知，槲皮素、芹菜素、熊果酸、木犀草素、山奈酚、楊梅素、黃芩素、油酸以及水楊酸可能為PAMs抗冠狀病毒及肺炎的關(guān)鍵活性成分。在隨后的KEGG富集分析過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)除TNF、IL-17等炎癥相關(guān)信號(hào)通路被顯著富集外，不少與病毒感染的信號(hào)通路也被顯著富集，如人巨細(xì)胞病毒、甲型流感、皰疹病毒感染信號(hào)通路。PAMs可通過(guò)調(diào)節(jié)這些病毒感染引起的自身免疫反應(yīng)而降低機(jī)體炎癥反應(yīng)。

本研究也通過(guò)構(gòu)建信號(hào)通路-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探究了PAMs與COVID-19可能作用的核心靶點(diǎn)。按照節(jié)點(diǎn)自由度排序，RELA、NF-κB1、MAKP1、TNF、IL-6、MAPK14、STAT1、CASP8、JAK1、FOS、CASP3、IFN-β1、TGF-β1節(jié)點(diǎn)度數(shù)均>10，被認(rèn)為是PAMs的核心靶點(diǎn)。RELA屬于NF-κB家族成員，TNF、IL-6、COX-2等都可以激活NF-κB信號(hào)通路，從而在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用[10]。PAMs有望通過(guò)作用于這些核心靶基因，抑制炎癥和激活免疫相關(guān)通路，從而在COVID-19的防治中發(fā)揮作用。

將PAMs核心成分以及目前臨床推薦的化學(xué)藥物分別與Mpro、ACE2、S刺突糖蛋白進(jìn)行AutoDock vina分子對(duì)接。結(jié)果表明，槲皮素、黃芩素和木犀草素與Mpro、ACE2以及S刺突糖蛋白均有較好的結(jié)合能力，其結(jié)合能絕對(duì)值略高于洛匹那韋、瑞德西韋和阿奇霉素，遠(yuǎn)低于利巴韋林和硫酸羥基氯喹。研究報(bào)道，黃芩苷及其苷元黃芩素體內(nèi)給藥一般可以減輕組織炎癥性損傷，下調(diào)模型動(dòng)物血漿促炎細(xì)胞因子水平(TNF-α、IL-1、IL-6等)，并可以調(diào)節(jié)某些免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[11]。木犀草素不僅能夠抑制巨噬細(xì)胞磷酸化，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，還能夠抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6、TNF-α，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)[12-13]。此外，槲皮素和木犀草素還可以抑制SARS病毒S刺突糖蛋白的活性，阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，直接清除病毒[14]。

綜上所述，本研究從分子水平揭示了PAMs多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為PAMs潛在抗新型冠狀病毒潛在應(yīng)用提供了前期理論數(shù)據(jù)支持。PAMs復(fù)方中紅花、紫草的關(guān)鍵功效成分槲皮素、黃芩素以及木犀草素可能是PAMs抗病毒的主要藥效成分，可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、降低炎癥反應(yīng)等多通路和多靶點(diǎn)作用于COVID-19。本研究存在一定的不足，一方面，考慮到PAMs主要是通過(guò)外用給藥途徑，研究中僅通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)中類藥性(DL≥0.18)一個(gè)條件進(jìn)行了篩選；另一方面，鑒于SARS-CoV-2屬于新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒，在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，我們僅能收集到冠狀病毒和肺炎的交集基因，將其作為SARS-CoV-2的可能作用靶點(diǎn)，存在一定的局限；同時(shí)，我們僅采用了AutoDock vina一種分子對(duì)接軟件分析，其結(jié)果準(zhǔn)確度尚需通過(guò)其他分子對(duì)接軟件及在更高次數(shù)與步數(shù)等參數(shù)條件設(shè)置下進(jìn)行驗(yàn)證；再者，鑒于我們實(shí)驗(yàn)室條件的限制，我們僅以M13噬菌體這種簡(jiǎn)單、易操作和安全的細(xì)菌病毒作為靶標(biāo)，開展PAMs的抗病毒抑制測(cè)定，其與冠狀病毒、SARS-CoV-2無(wú)論從病毒進(jìn)化與分類、還是宿主，均存在很大的差異，其噬菌體模型有著很大的局限，后期還需要通過(guò)抗SARS-CoV-2以及臨床試驗(yàn)及應(yīng)用等進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與支持。