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大熊貓尿液成分的代謝組學(xué)研究

2022-04-19 02:23謝婷霞李才武鄧雯文何永果吳代福張和民鄒立扣
生物學(xué)雜志 2022年2期
關(guān)鍵詞:代謝物大熊貓尿液

謝婷霞, 李才武, 鄧雯文, 晉 蕾, 何永果, 吳代福, 張和民, 黃 炎, 鄒立扣

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院, 成都611130; 2. 大熊貓國家公園珍稀動物保護(hù)生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗室(中國大熊貓保護(hù)研究中心), 都江堰611830)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)具有獨(dú)特的食性和消化道結(jié)構(gòu)[1]。目前,鑒于大熊貓食性單一、腸道疾病致死率較高,其生理代謝及其相關(guān)領(lǐng)域的研究便成為大熊貓保護(hù)生物學(xué)研究的焦點(diǎn)[2-6]。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,通過整體分析代謝圖譜并結(jié)合模式分析揭示生物體在不同狀態(tài)下代謝產(chǎn)物的變化,常用作尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式。尿液是機(jī)體代謝終末產(chǎn)物,取樣便捷、無創(chuàng)傷,是代謝組學(xué)研究的理想來源。周本宏等[7]采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS 對地榆鞣質(zhì)在尿液中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒別,進(jìn)而研究其代謝過程;張琳等[8]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在腎細(xì)胞癌患者和健康人尿液中篩選出14種差異代謝物,并推測這些代謝產(chǎn)物可能是腎細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物。然而,目前對大熊貓機(jī)體代謝的相關(guān)性研究較少,劉玉良等[9]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對6只大熊貓尿液中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測,共推定出38種物質(zhì),但對不同性別和年齡的大熊貓并未分別研究。大熊貓個體之間可通過尿液中不同化學(xué)成分的氣味判別對方的身份、性別和年齡,在不同性別和不同發(fā)育階段的大熊貓尿液中可能存在標(biāo)志性代謝物,運(yùn)用恰當(dāng)則可能達(dá)到預(yù)防疾病、增進(jìn)健康等有利效果,但是在大熊貓尿液中哪些物質(zhì)能夠編碼這些信息依然是一個空白。本文利用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜UPLC-Q-TOF/MS技術(shù),研究大熊貓尿液代謝產(chǎn)物隨年齡和性別的不同而產(chǎn)生的變化,找出不同性別和不同年齡狀態(tài)下大熊貓尿液可能存在的標(biāo)志性代謝物,以期為了解大熊貓機(jī)體代謝情況及疾病預(yù)防等方面提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年在中國大熊貓保護(hù)研究中心采集20個尿液樣品(表1),采集方式是在圈養(yǎng)大熊貓個體排泄10 min內(nèi),使用無菌注射器立即采集新鮮干凈的尿液5~10 mL于無菌離心管中,取樣過程中盡量避免污染,尿液不進(jìn)行任何化學(xué)處理,立即用封口膜密封,干冰儲存,24 h內(nèi)送回實(shí)驗室,尿液緩慢解凍和離心去除尿液中干擾性物質(zhì)[10]。劃分1~5齡為亞成年組,5~20齡為成年組,>20齡為老年組。

表1 尿液樣品基本信息

1.2 液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatograph mass spectrometry, LC-MS)測定

LC-MS分析的儀器平臺為Waters公司的超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜UPLC- Q-TOF/MS。色譜條件:色譜柱為BEH C18柱(100 mm×2.1;Z1*2;Y1*2 mm i.d., 1.7 μm;Waters, Milford, USA);流動相A為水(含0.1%甲酸),流動相B為乙腈(含0.1%甲酸);梯度洗脫程序為0~1 min,1% B;1~5.5 min,1%~20% B;5.5~6 min,20%~30% B;6~8.5 min,30%~35% B;8.5~10.5 min,35%~70% B;10.5~11 min,70%~100% B;11.0~13.0 min,100% B;13.0~13.1 min,100%~1% B;13.1~15.0 min,1% B。流速為0.40 mL/min,進(jìn)樣量為3 μL,柱溫為45 ℃。質(zhì)譜條件:樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負(fù)離子掃描模式,電噴霧毛細(xì)管電壓,進(jìn)樣電壓和碰撞電壓分別為1.0 kV、40 V 和6 eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為120 ℃和500 ℃,載氣流量:900 L/h,質(zhì)譜掃描范圍:50~1 000 m/z,掃描時間和間隔時間分別為0.1 s和0.02 s。質(zhì)控樣本(QC)由不同組樣本提取物混合制備而成,用與分析樣本相同的方法處理和檢測,在儀器分析的過程中,每8個分析樣本中插入一個QC樣本,以考察整個分析過程的重復(fù)性。

1.3 數(shù)據(jù)分析和處理

原始數(shù)據(jù)用代謝組學(xué)處理軟件 progenesis QI (Waters Corporation,Milford, USA) 進(jìn)行搜庫鑒定。將以上數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入SIMCA軟件(版本14.1)進(jìn)行偏最小二乘方-判別分析(PLS-DA)和正交過濾偏最小二乘方-判別分析(OPLS-DA)。在分析前對數(shù)據(jù)進(jìn)行默認(rèn)的平均中心化(Mean-centered)和UV(Unit variance)格式化處理,再自動計算最優(yōu)主成分?jǐn)?shù)和建立最優(yōu)模型。結(jié)合OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(Variable importance in the projection,變量投影重要性)大于1和單維統(tǒng)計分析的P值小于0.05相結(jié)合的方法篩選差異性代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 多維統(tǒng)計分析

為區(qū)分各組差異,采用監(jiān)督性的多維統(tǒng)計方法PLS-DA進(jìn)行模型分析,其中不同性別模式下模型的評價指標(biāo)為R2X[1]=0.246,R2X[2]=0.108[圖1(a)];不同年齡模式下模型的評價指標(biāo)為亞成年組與成年組R2X[1]=0.195,R2X[2]=0.184[圖1(b)];亞成年組與老年組R2X[1]=0.245,R2X[2]=0.218[圖1(c)];成年組與老年組R2X[1]=0.17,R2X[2]=0.101[圖1(d)]。結(jié)果顯示,所建立的模型有效,可用于后續(xù)組間差異成分的尋找與分析,并且不同組間有明顯的分開。同時構(gòu)建OPLS-DA數(shù)據(jù)模型,結(jié)果顯示[圖2(a)]不同性別的樣本能夠有效區(qū)分,不同年齡階段的樣本也能有效區(qū)分[圖2(b)~(d)]。

(a)▲代表雌性個體,▼代表雄性個體;(b)◆代表亞成年組(1~5齡),▼代表成年組(5~20齡);(c)◆ 代表亞成年組(1~5齡),▲代表老年組(>20齡);(d)▼代表成年組(5~20齡),▲代表老年組(>20齡)。

2.2 篩選差異代謝物

在雌雄性別組間共篩選出12種具有顯著差異的代謝物,芹菜素在雌性尿液中相對含量顯著高于雄性(圖3),其余11種代謝物在雌性尿液中顯著低于雄性尿液。在亞成年組與成年組間篩選出25種具有顯著差異的代謝物,僅核黃素和精氨酸在亞成年個體尿液中相對含量顯著高于成年個體(圖4);亞成年與老年組間、成年組與老年組間,分別共鑒定得10種、3種顯著差異代謝物,其相對含量均在老年個體尿液中更高(圖5和圖6)。其中圖3、圖5和圖6以各代謝物相對含量為縱坐標(biāo),而圖4由于各代謝物相對含量差異較大,為使在同一張圖中表示,將各代謝物相對含量×log 10作為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖。所有的顯著性差異均由差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)差得出。

(a)▲代表雌性個體,▼代表雄性個體;(b)◆代表亞成年組(1~5齡),▼代表成年組(5~20齡); (c)◆代表亞成年組(1~5齡),▲代表老年組(>20齡);(d)▼代表成年組(5~20齡),▲代表老年組(>20齡)。圖2 不同組間比較的OPLS-DA得分圖Figure 2 OPLS-DA score chart for comparison between different groups

a,b代表顯著差異 (P<0.05)。圖3 差異代謝物在雌雄性別組間的相對含量Figure 3 The relative expression of metabolites between male and female groups

25種差異代謝物均在亞成年與成年組間含量呈顯著性差異(P<0.05),未用不同字母表示。圖4 差異代謝物在亞成年與成年組間的相對含量Figure 4 The relative expression of metabolites between sub-adult and adult groups

a,b代表顯著差異 (P<0.05)。圖5 差異代謝物在亞成年與老年組間的相對表達(dá)量Figure 5 The relative expression of metabolites between sub-adult and geratic group

a,b代表顯著差異 (P<0.05)。圖6 差異代謝物在成年與老年組間的相對表達(dá)量Figure 6 The relative expression of metabolites differences between adult and geratic groups

在KEGG數(shù)據(jù)庫中查找相應(yīng)代謝通路,各組間具有顯著差異的代謝物所對應(yīng)的代謝通路主要集中在氨基酸代謝通路、次生代謝物的生物合成通路及黃酮、黃酮醇和類黃酮的生物合成通路(表2)。

表2 不同組間差異代謝物在KEGG數(shù)據(jù)庫相應(yīng)代謝通路

3 討論

大熊貓視力和聽力較弱,主要利用化學(xué)通訊系統(tǒng)進(jìn)行定位、配偶、覓食等社會活動[11-12]。尿液作為化學(xué)通訊系統(tǒng)中較重要的信號物質(zhì),其化學(xué)組成及物質(zhì)含量可能反映動物生理狀況[13-14]。胡錦矗等[15]研究發(fā)現(xiàn)大熊貓主要利用來自其尿液和肛周腺分泌物的氣味進(jìn)行個體間的相互交流,同時這些氣味還能夠編碼有關(guān)個體身份、性別、年齡以及性活躍能力等信息。雄性大熊貓的尿液包含與親緣關(guān)系有關(guān)的信息,雌性大熊貓發(fā)情期尿中雌激素含量變化和發(fā)情行為相關(guān)聯(lián)[16-18]。本實(shí)驗采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對大熊貓尿液代謝成分進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)芹菜素是唯一在雌性尿液中相對含量顯著高于雄性的物質(zhì),這可能是由于芹菜素作為一種常見的黃酮類化合物,主要通過下丘腦-垂體-性腺軸影響內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié),具有雌激素樣作用[19]。田原等[20]研究發(fā)現(xiàn)芹菜素通過影響雌激素受體而使下丘腦的促性腺激素釋放激素(GnRH)和腺垂體的卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)分泌增加,從而促進(jìn)雌性生殖過程。在不同性別尿液組成差異比較分析中,相對含量最高的物質(zhì)為1-甲基鳥苷和犬尿喹啉酸。1-甲基鳥苷是尿液中含量較高的修飾核苷之一[21],尿中1-甲基鳥苷的測定對癌癥的早期診斷和治療有極大臨床價值[22];犬尿喹啉酸作由L型犬尿氨酸代謝生成經(jīng)尿液排出,犬尿喹啉酸參與中樞性血壓調(diào)節(jié),犬尿喹啉酸代謝可能與高血壓的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[23-24]。隨著大熊貓圈養(yǎng)水平的提高,大熊貓壽命延長的同時,老年病亦增加[25],通過檢測大熊貓這類標(biāo)志性尿液代謝物的變化,可能作為疾病的早期無損傷診斷新方法,同時通過識別與疾病相關(guān)的特殊代謝產(chǎn)物和代謝途徑,也可為探索機(jī)制提供新思路。

隨著大熊貓年齡的增長,其肛周腺分泌物和尿液中的脂肪酸含量逐漸增加[26]。核黃素和精氨酸在亞成年尿液中的相對含量高于成年,因核黃素不易在體內(nèi)蓄積,通常以外界食物來補(bǔ)充,體內(nèi)排出核黃素的量可能受機(jī)體需要和蛋白質(zhì)流失程度的影響[27]。大熊貓從亞成年向成年發(fā)育階段,尿液代謝物主要對應(yīng)在氨基酸代謝通路上,氨基酸在動物體內(nèi)發(fā)揮著調(diào)節(jié)生理生化功能、促進(jìn)生長等作用[28]。精氨酸能促進(jìn)動物生長,強(qiáng)化機(jī)體抗氧化功能并提高胚胎存活率[29-31]。鄭萍等[32]研究發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠促進(jìn)動物胰島素、IGF-I、IGF-I R和IGFBP3的分泌進(jìn)而上調(diào)生長相關(guān)因子的基因表達(dá)從而促進(jìn)動物的生長。萬孟春等[33]研究發(fā)現(xiàn)精氨酸是維持新生哺乳動物最佳生長的必需氨基酸。在老年個體尿液中黃豆苷元和橙皮苷的相對含量均顯著高于成年個體,黃豆苷元存在于天然葛根和大豆等植物之中,與人體分泌的雌激素在結(jié)構(gòu)上比較相似,具有治療高血壓和高血脂的藥理作用[34]。橙皮苷也廣泛存在于豆科植物中,具有抗炎、抗氧化和保護(hù)心血管等作用[35]。研究表明在飼料中添加黃豆苷元或橙皮苷后對養(yǎng)殖動物具有促生長作用[36-38]。另外,腦啡肽和鄰苯二甲酸在老年個體尿液中的相對含量均顯著高于成年個體。腦啡肽無論是在嚙齒動物還是人類中都已被證明是有效的生長激素釋放劑[39-42]。

在不同性別和年齡組間大熊貓尿液代謝物存在差異,恰當(dāng)運(yùn)用標(biāo)志性代謝產(chǎn)物對預(yù)防疾病、增進(jìn)健康等起積極作用。探索這些代謝物質(zhì)的作用和代謝通路有助進(jìn)一步研究大熊貓尿液代謝生化的變化原因。接下來需進(jìn)一步對這些代謝產(chǎn)物及其代謝通路進(jìn)行深入研究,建立不同年齡、不同性別大熊貓尿液代謝物檢測的參考值范圍,掌握大熊貓尿液代謝物的差異原因和影響因素,對今后大熊貓尿液檢測的標(biāo)準(zhǔn)化有重要意義。

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