尤國莉，秦春峰，阮 云，沈劍波，朱笑林，周國雄

（1 建湖縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 224700；2 南通市通州區(qū)中醫(yī)院；3 南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科）

炎癥性腸病主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病，以慢性炎癥為特征。腸黏膜機(jī)械屏障主要由腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成，肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)調(diào)控肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化，介導(dǎo)肌動蛋白收縮，使相鄰腸上皮細(xì)胞間隙增大，腸黏膜通透性增加[1]。腸黏膜屏障功能異常導(dǎo)致腸道致病菌群及有害成分更易入侵腸黏膜，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致慢性炎癥。有研究表明，腸黏膜通透性改變發(fā)生在腸道炎性改變前[2]，腸道炎癥加重時，腸黏膜通透性進(jìn)一步增高。腸黏膜通透性改變與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生有著緊密聯(lián)系[3-4]。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TL)是從中藥雷公藤中提取的活性成分，是雷公藤二萜化合物中免疫抑制作用最強(qiáng)的單體[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，TL 對包括克羅恩病在內(nèi)的多種自身免疫性疾病具有免疫抑制和抗血栓作用[7]，TL 改善克羅恩病與抑制TLRs/NF-κB 信號通路相關(guān)[8]。抑制IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號通路及下調(diào)IL-17 可改善結(jié)腸炎[9]。本研究旨在觀察TL 對UC小鼠腸道炎癥反應(yīng)及腸黏膜通透性的影響，探討TL是否具有治療UC 的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級BALB/c 雄性小鼠80 只，體重20～22 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)于南通大學(xué)實驗動物中心[(SYXK(蘇)2015-0016)]，室內(nèi)溫度20 ℃±2 ℃，濕度50%～60%，照明12/12 h 明暗交替，自由采食和飲水，Co60輻照滅菌飼料(蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司)。本研究經(jīng)過南通大學(xué)實驗動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 模型及分組 80 只小鼠隨機(jī)分成8 組，其中10 只作為空白對照組(NC 組)，自由飲用無菌水，其余70 只飲用5%葡萄糖硫酸鈉(DSS)溶液，建立小鼠UC 模型[10-11]。第3 天將70 只UC 模型小鼠隨機(jī)分成7 組，每組10 只：模型組(M 組)，腹腔注射生理鹽水0.2 mL/d；丙二醇組(PG 組)，腹腔注射20%丙二醇0.2 mL/d；雷公藤內(nèi)酯醇低劑量組(TLL 組)、中劑量組(TLM 組)及高劑量組(TLH 組)分別腹腔注射TL 0.10 mg/kg·d、0.20 mg/kg·d 和0.40 mg/kg·d；地塞米松組(D 組)，腹腔注射地塞米松0.20 mg/kg·d；美沙拉嗪組(MS 組)，美沙拉嗪灌胃，0.60 g/kg·d。第8 天處死小鼠，對小腸黏膜進(jìn)行通透性實驗、超微結(jié)構(gòu)觀察及MLCK、MPO 活性，TNF-α 及IL-10 含量檢測。

1.3 主要試劑 99.78%雷公藤內(nèi)酯醇(成都曼思特生物科技有限公司)，DSS(南京普諾恩生物技術(shù)有限公司)，美沙拉嗪腸溶片(葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司)，注射用地塞米松硫酸鈉(天津藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，異硫氰酸熒光素-葡聚糖(f1uorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-D)(南京普諾恩生物技術(shù)有限公司)。髓過氧化物酶(MPO)、IL-10、TNF-α 及MLCK 檢測試劑盒(DL develop 公司)，大便隱血(FOB)檢測試劑盒[艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司]。

1.4 小鼠一般情況觀察 觀察小鼠體重變化、大便性狀及大便隱血等情況，參照丁氏Cooper 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病活動指數(shù)(DAI)評分(表1)。DAI 評分=(體重下降百分比評分+大便性狀評分+大便隱血評分)/3。

表1 小鼠DAI 評分表

1.5 小腸黏膜通透性檢測 采用FITC-D 示蹤法，參照文獻(xiàn)方法略加改進(jìn)[12-13]。將距回盲部5 cm 的末段10 cm 回腸兩端用絲線結(jié)扎，向該段腸腔注入新鮮配制的FITC-D 溶液(20 mg/mL)0.5 mL。30 min后取門靜脈血，肝素抗凝，3 000 g 離心10 min，分離血漿，PBS 稀釋后測定熒光強(qiáng)度。激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為528 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算門靜脈血FITC-D 含量。

1.6 小腸黏膜透射電鏡檢查 距回盲部1 cm 處取長度約0.5 cm 回腸段，置于預(yù)冷載玻片上，迅速滴4滴冰戊二醛溶液。切成面積為1 mm2左右小塊，置于2.5%戊二醛溶液中，4 ℃固定6 h。PBS 洗滌3 次后用1%鋨酸固定，4 ℃2 h。梯度酒精脫水，環(huán)氧丙烷透明30 min。在環(huán)氧丙烷和樹脂等量混合液中浸泡2 h，再入純樹脂浸泡2 h。將組織取出后放入含有樹脂的包埋液中，置60 ℃恒溫箱中固化48 h。固化后的組織進(jìn)行超薄切片(70 nm)，檸檬酸鉛染色，水洗干燥后透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.7 小腸黏膜MLCK、MPO 活性及炎癥因子水平檢測 參照試劑盒說明書，采用ELISA 法檢測腸組織中MLCK、MPO 活性，TNF-α 及IL-10 水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用Graphpad Prism 7.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理并作圖。計量資料以±s 表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗，多組間比較采用Oneway ANOVA 檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大便隱血檢測 除NC 組外，其余各組小鼠在飲用5% DSS 溶液后第5 天均出現(xiàn)不同程度的肉眼可見血便，隱血試紙測試陽性。

2.2 各組小鼠DAI 評分比較 NC 組DAI 評分接近0，飲用5%DSS 溶液后各組小鼠DAI 評分隨著時間推移而逐漸增高。造模后第1，第2 天各組小鼠DAI評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。MS 組從第3 天開始DAI 評分較NC 組顯著升高(P＜0.01)。第4 天TLL 組、TLM 組DAI 評分與M 組無顯著差異，而從第4 天開始TLH 組DAI 評分較M 組顯著降低(P＜0.001)，而MS 組DAI 評分顯著高于其他組，該組小鼠死亡率最高。見圖1。

圖1 各組小鼠DAI 評分

2.3 各組小鼠小腸黏膜通透性比較 與NC 組比較，M 組及PG 組小鼠血漿FITC-D 含量明顯增高(P＜0.01)。與M 組比較，TLL、TLM 及TLH 各組小鼠血漿FITC-D 含量均不同程度降低，但僅TLL 組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。MS 組因死亡率較高，無統(tǒng)計價值。

圖2 各組小鼠小腸粘膜通透性檢測

2.4 各組小鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu)觀察 透射電鏡下可見NC 組小鼠回腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈高柱形；表面微絨毛密集，絨毛較粗、長，排列整齊，細(xì)胞間連接緊密，間隙很小(圖3a)。M 組小鼠回腸可見部分上皮明顯受損，微絨毛排列稀疏、萎縮、長短不一，細(xì)胞間連接復(fù)合體縮短、變寬，相鄰上皮細(xì)胞間隙明顯增大(圖3b)。PG組、TLL 組及TLM 組小鼠回腸上皮細(xì)胞損傷程度接近M 組，微絨毛萎縮，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，與M 組比較未發(fā)現(xiàn)有明顯改善(圖3c-e)。TLH 組上皮細(xì)胞形態(tài)接近正常，微絨毛排列較為整齊、密集，細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)清晰，緊密程度較M 組顯著增高(圖3f)。MS 組及D組微絨毛結(jié)構(gòu)有一定程度的改善(圖3g、h)。

圖3 透射電鏡檢測腸超微結(jié)構(gòu)（6 000×）

2.5 各組小鼠腸組織中MLCK、MPO 活性，TNF-α及IL-10 含量比較 與NC 組相比，M 組腸組織中MLCK 活性顯著升高(P＜0.001)；與M 組小鼠相比，經(jīng)TL、D、MS 治療后MLCK 活性顯著降低(P＜0.001)(圖4A)。與NC 組相比，M 組MPO 活性升高，經(jīng)TL、D、MS 治療后，MPO 活性降低，但與M 組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖4B)。與NC 組相比，M組腸組織中TNF-α 含量升高，經(jīng)TL、D、MS 治療后降低，但與M 組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖4D)。與NC 組相比，M 組腸組織中IL-10 含量降低，僅TLH 治療后IL-10 含量有所升高，但與M組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖5C)。

圖4 腸組織中MLCK、MPO 活性，TNF-α 及IL-10 檢測

3 討 論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜中TNF-α、IFN-γ、IL-6 等炎性細(xì)胞因子表達(dá)增高，這些細(xì)胞因子通過不同途徑改變腸上皮通透性，破壞腸上皮細(xì)胞屏障功能[14]。DSS 誘導(dǎo)的動物模型是目前應(yīng)用最廣泛的UC 模型，其癥狀、病變部位、病理形態(tài)學(xué)與人類UC 的發(fā)生發(fā)展過程極為相似。本研究中小鼠飲用5%DSS 溶液后第5 天出現(xiàn)明顯便血，DAI 評分隨時間推移顯著增加，經(jīng)不同劑量TL 治療后均有不同程度改善，其中TLH 組效果最為顯著。FITC-D 檢測發(fā)現(xiàn)，M 組腸黏膜通透性顯著升高，TL各治療組腸黏膜通透性明顯降低，MS 組因小鼠死亡率較高，差異性比較無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗中電鏡觀察到MS 組未死亡小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有所改善，但該藥的毒副作用可能是導(dǎo)致小鼠死亡率較高的原因。透射電鏡觀察顯示，DSS 造模后小鼠腸上皮結(jié)構(gòu)明顯受損，微絨毛排列稀疏、萎縮、長短不一，細(xì)胞間連接復(fù)合體縮短、變寬，相鄰腸上皮細(xì)胞間隙明顯增大。經(jīng)高劑量TL 治療后，腸上皮絨毛排列及相鄰細(xì)胞間隙均有顯著改善，提示TL 可能通過改善腸上皮結(jié)構(gòu)而降低通透性。

TNF-α 是重要的促炎因子，通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡而破壞上皮屏障，并促進(jìn)腸上皮細(xì)胞釋放炎癥趨化因子，招募和活化中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，激活腸道適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[15]。IL-10 主要功能是抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子釋放，有研究表明IL-10 基因敲除小鼠在無特定致病菌的條件下可發(fā)生與人UC 形態(tài)學(xué)上相似的結(jié)腸炎，并伴有炎癥因子的增加。本研究結(jié)果顯示，M 組小鼠腸組織中TNF-α 含量顯著增高，IL-10 含量明顯降低。低劑量TL 和地塞米松治療對TNF-α 含量幾乎無影響，美沙拉嗪組TNF-α含量有一定下降，TLM 組、TLH 組TNF-α 含量較M組明顯降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

MPO 主要存在于中性粒細(xì)胞中，局部組織中MPO 含量反映中性粒細(xì)胞的浸潤程度，可評價腸道炎癥的嚴(yán)重程度。本研究中M 組小鼠腸組織中MPO活性顯著增高，經(jīng)TL、D、MS 治療后MPO 活性降低，尤其中劑量和高劑量TL 的作用明顯優(yōu)于D 組和MS 組，表明TL 在抑制腸黏膜炎癥反應(yīng)、保護(hù)腸黏膜屏障中具有十分重要的作用。MLCK 是腸黏膜通透性最主要的鈣調(diào)素激酶，MLCK 激活后可催化MLC磷酸化，介導(dǎo)肌動蛋白收縮，引起細(xì)胞骨架重排，破壞細(xì)胞緊密連接，導(dǎo)致細(xì)胞間隙增大。本研究M 組腸組織中MLCK 活性顯著升高，經(jīng)TL、D、MS 治療后明顯降低(P＜0.001)。透射電鏡觀察到的超微結(jié)構(gòu)結(jié)果與各組腸組織中MLCK 活性變化一致。