陳興幫，陳 熹，吳 國*，肖丕顯，李 熠，楊秀林，何 兵

(1 四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川遂寧 629000；2 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101)

核能和國防工業(yè)促發(fā)了鈾(U)礦的開采，導(dǎo)致大量尾礦釋放到土壤和水環(huán)境中，造成嚴(yán)重的核污染[1]。鈾尾礦中還含有低劑量的鎘(Cd)、鉛(Pb)、錳(Mn)等多種伴生金屬，其中Cd被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署列為全球性危害化學(xué)物質(zhì)之首[2]。U、Cd容易通過食物鏈進(jìn)入人體，引發(fā)腎臟中毒和骨痛病等，嚴(yán)重威脅人類健康，因此修復(fù)鈾尾礦污染環(huán)境勢在必行[3]。相較于物理和化學(xué)等手段，植物修復(fù)技術(shù)具有成本低、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，U、Cd是植物的非必需元素，過量積累會(huì)抑制植物生長，使植物修復(fù)效率降低[4-5]。

研究表明，U、Cd脅迫會(huì)通過破壞植物根系微觀結(jié)構(gòu)[6-8]、干擾礦質(zhì)元素代謝(Fe和Mn等)[9-11]、打破細(xì)胞的氧化還原水平等[12-13]對(duì)植株造成嚴(yán)重毒害。在光合作用方面，U脅迫對(duì)不同植物的影響不盡相同。例如，在U脅迫下，蠶豆(Viciafaba)和黑麥草(Loliumperenne)的凈光合速率(Pn)顯著降低[14-15]，黃秋葵(Abelmoschusesculentus)的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)結(jié)構(gòu)和功能受損，最大光量子產(chǎn)額(Fv/Fm)顯著降低[16]；而大葉菠菜(Spinaciaoleracea)和紅圓葉莧(Iresineherbstii)的Pn有所升高，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的實(shí)際光量子產(chǎn)額(ΦPSⅡ)等熒光參數(shù)呈上升趨勢，光合作用能力加強(qiáng)[17-18]。目前，Cd脅迫對(duì)植物光合作用的影響機(jī)理已經(jīng)比較清楚，主要通過抑制葉綠體的增殖[19]、阻礙光合電子傳遞[20]、與Ca2+競爭而抑制光激活[21]以及破壞葉綠體結(jié)構(gòu)[22]等抑制光合作用。

迄今，相關(guān)研究大多限于U或Cd單一脅迫，關(guān)于二者共存時(shí)的生物學(xué)效應(yīng)研究較少。Vandenhove[23]和姚天月[24]等研究表明，U、Cd對(duì)擬南芥的鮮重以及水芹(Oenanthejavanica)株高和根長等的抑制表現(xiàn)為協(xié)同作用；而李仕友等研究表明U、Cd對(duì)萬年青(Rohdeajaponica)抗氧化酶的抑制表現(xiàn)為拮抗作用[25]。Lai等[4-5]發(fā)現(xiàn)，甘薯(Ipomoeabatatas)主要通過改善能量代謝和增加初級(jí)代謝產(chǎn)物以響應(yīng)U和U+Cd脅迫，主要以抗氧化系統(tǒng)的改變響應(yīng)Cd脅迫；不同品種的甘薯對(duì)U、Cd的響應(yīng)機(jī)制也不同。因此，U、Cd復(fù)合污染在不同植物中的生物學(xué)效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

十字花科植物對(duì)重金屬的耐受性普遍較強(qiáng)[26]，且蘿卜對(duì)U的耐受性強(qiáng)于甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.capitata)等十字花科其他植物[27]。白蘿卜(Raphanussativus)是十字花科蘿卜屬的植物，生長快、易收獲。朱業(yè)安等[28]用白蘿卜修復(fù)U污染土壤，使土壤殘留U濃度從140～560 mg·kg-1降低為57.9～198.4 mg·kg-1，去除率達(dá)到57.7%～72.2%；Li等[29]對(duì)比不同蘿卜品種后發(fā)現(xiàn)，白蘿卜的Cd富集能力更強(qiáng)?？梢?，用白蘿卜修復(fù)鈾尾礦污染的應(yīng)用潛力較大，但目前對(duì)U、Cd伴生條件下蘿卜生長和光合特性的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究以白蘿卜為試材，在溶液培養(yǎng)條件下探究U、Cd單一和復(fù)合處理時(shí)其在蘿卜幼苗中的富集特征及對(duì)蘿卜幼苗生長和光合特性的影響，為鈾尾礦污染環(huán)境的生態(tài)修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及植物培養(yǎng)

蘿卜種子購于成都市種子市場，硝酸鈾酰[UO2(NO3)2·6H2O]、氯化鎘(CdCl2·5H2O)和其他試劑均為分析純，購于成都市萇鉦化玻儀器有限公司。隨機(jī)選擇飽滿種子，用70%酒精消毒，蒸餾水沖洗3次，浸種24 h后轉(zhuǎn)移至墊有1層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，并放入發(fā)芽箱中28 ℃萌發(fā)。種子根長約0.5 cm時(shí)轉(zhuǎn)移至定植籃(直徑5 cm)，并置于含改良Hoagland營養(yǎng)液(pH 5.5，無磷)的組培瓶中培養(yǎng)，每3 d換1次營養(yǎng)液。UO22+易與磷酸鹽結(jié)合而沉淀，生物有效性降低，因此將營養(yǎng)液配方中的磷酸鹽稀釋為0.1 mmol·L-1，每天定時(shí)葉面施肥，避免植株缺磷[10]。培養(yǎng)室溫度20～25 ℃，光照強(qiáng)度60～65 μmol·m-2·s- 1。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

據(jù)景稱心等[2]調(diào)查結(jié)果，某鈾尾礦庫周圍0～50 cm深度土壤中U含量約6.63～92.2 mg·kg-1，Cd含量約0.23～6.63 mg·kg-1。折算為摩爾濃度可知，鈾尾礦中Cd濃度僅為U濃度的10%～20%。此外，無磷(或低磷)條件下，重金屬的生物有效性顯著增大，U濃度為25～50 μmol·L-1時(shí)植物生長受到顯著抑制[4,6,12]。蘿卜對(duì)鈾的耐受濃度較高，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇U濃度為50 μmol·L-1，Cd濃度為10 μmol·L-1，設(shè)置單一U、單一Cd和U+Cd復(fù)合處理3個(gè)處理組，以無磷Hoagland營養(yǎng)液為空白對(duì)照(CK)。待蘿卜幼苗第二片真葉變綠(約3周)，用處理液培養(yǎng)2周，每3 d換1次處理液，保持每天噴施磷酸鹽。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 U、Cd元素含量和富集系數(shù)、轉(zhuǎn)移系數(shù)U、Cd脅迫處理結(jié)束后，用20 mmol·L-1的Na2-EDTA浸泡根部30 min，去除根系表面吸附的元素。將幼苗分為根部和地上部，采用濕法消解法消解后，用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測定幼苗根部和地上部U、Cd含量。

蘿卜對(duì)U、Cd的生物富集系數(shù)(BCF)和轉(zhuǎn)移系數(shù)(TF)計(jì)算公式分別為：

BCF=C整株/C溶液，TF=C地上/C根

其中，C整株、C地上和C根分別表示蘿卜幼苗整株、地上部和根部U、Cd含量，C溶液表示溶液中添加的U、Cd濃度。

1.3.2 生物量和根系活力將采集的蘿卜幼苗用超純水(ddH2O)沖洗3次后分為地下部和地上部，在120 ℃殺青15 min，轉(zhuǎn)至80 ℃下烘至恒重，測定生物量并計(jì)算根冠比。剪取約0.5 cm根尖，用二乙酸熒光素(FDA)和碘化丙啶(PI)雙重染色法[12]染色，置于熒光顯微鏡下觀察根系活力，活細(xì)胞被FDA染色后在488 nm激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，死細(xì)胞被PI染色后在543 nm激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光。

1.3.3 葉綠素和可溶性糖含量采用暗室震蕩提取法[30]測定葉綠素含量：稱取約0.5 g葉片，加入10 mL混合浸提液(丙酮∶乙醇= 1∶1，V/V)，暗室震蕩浸提約12 h，至葉片全部變?yōu)榘咨珵橹?，分別在663、645、470 nm下測定光吸收值。參照Zhang等[14]的方法測定可溶性糖含量：稱取0.25 g葉片，加入15 mL ddH2O研磨至勻漿，沸水浴提取30 min，冷卻后定容至250 mL，濾紙過濾后得到樣品提取液。將0.5 mL樣品提取液與1 mL苯酚(1%)和5 mL濃硫酸混合，靜置10 min后30 ℃下反應(yīng)20 min，測定480 nm處的光吸收值，并根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算可溶性糖含量。

1.3.4 光合特性選擇晴朗天氣，于上午9:00-11:00用便攜式光合測定系統(tǒng)(GFS-3000，德國，WALZ)測定葉片的基本光合參數(shù)：凈光合速率(Pn)、蒸騰系數(shù)(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)。分別在不同光照強(qiáng)度下(0、50、100、200、300、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μmol·m-2·s- 1)測定不同處理的光-光合響應(yīng)曲線，采用直角雙曲線修正模型擬合光響應(yīng)曲線，并計(jì)算出相關(guān)特征參數(shù)[31]。將各組幼苗置于暗室暗處理一晚，次日黎明使用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(FMS-2，英國，漢莎)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)實(shí)際光量子產(chǎn)額(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)和電子傳遞速率(ETR)[32]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 20處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析，LSD法多重比較，用Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜幼苗對(duì)U和Cd的富集特征

在單一U或U+Cd復(fù)合脅迫處理下，蘿卜幼苗U含量均表現(xiàn)為根部遠(yuǎn)高于地上部，與單一U脅迫相比，U+Cd復(fù)合脅迫處理組的U含量和對(duì)U的生物富集系數(shù)(BCF)均明顯升高，而對(duì)U的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(TF)無明顯變化(圖1，Ⅰ)。蘿卜幼苗根部Cd含量也均遠(yuǎn)高于地上部，但與單一Cd脅迫相比，U+Cd復(fù)合脅迫處理組的根部或地上部Cd含量均顯著降低；同時(shí)，蘿卜幼苗對(duì)Cd 的BCF和TF也明顯低于單一Cd脅迫處理(圖1，Ⅱ)。其中，與單一處理相比，復(fù)合處理的蘿卜幼苗根部和地上部U含量分別顯著升高118.6%和155.4%，Cd含量卻分別顯著降低57.5%和91.5%(P<0.05)。結(jié)果表明，蘿卜根部U、Cd含量遠(yuǎn)高于地上部，在單一脅迫處理下其對(duì)Cd的富集能力強(qiáng)于U，而在復(fù)合脅迫處理下，對(duì)U的富集和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，對(duì)Cd富集和轉(zhuǎn)移能力減弱。

相同部位內(nèi)不同大寫和小寫字母表示處理之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)

2.2 U、Cd脅迫對(duì)蘿卜幼苗生長的影響

U、Cd脅迫下蘿卜幼苗生長均受到抑制，地上部和根部生物量、根冠比明顯降低，抑制程度表現(xiàn)為：U+Cd復(fù)合處理>單一U處理>單一Cd處理(圖2，Ⅰ-Ⅲ)。與CK相比，蘿卜幼苗根部生物量、地上部生物量和根冠比在單一U脅迫處理下分別顯著降低41.5%、21.3%和25.5%(P<0.05)，在單一Cd脅迫處理下分別降低16.9%、12.5%和5.0%，在復(fù)合脅迫處理下分別顯著降低76.9%、58.3%和45.5%；與單一脅迫處理相比，復(fù)合處理組幼苗根部和地上部生物量也顯著降低。同時(shí)，F(xiàn)DA-PI染色結(jié)果顯示(圖2，Ⅳ)，與CK相比，處理組蘿卜幼苗根部綠色熒光減弱而紅色熒光增強(qiáng)，表明其根系活力減弱，并表現(xiàn)為CK>單一Cd處理>單一U處理>U+Cd復(fù)合處理。

不同小寫字母表示不同處理間的差異顯著(P<0.05)，下同；圖Ⅳ中50×表示放大50倍的觀察結(jié)果

2.3 U、Cd脅迫對(duì)蘿卜幼苗葉片光合特性的影響

2.3.1 光合色素和可溶性糖含量圖3顯示，蘿卜幼苗葉片葉綠素b含量在U、Cd單一或者復(fù)合脅迫下均與CK無顯著差異(P>0.05)；葉綠素a、類胡蘿卜素和可溶性糖含量在單一Cd脅迫處理下也均與CK無顯著差異，但在單一U脅迫處理下分別比CK顯著降低16.7%、20.9%和17.6%，在U+Cd復(fù)合脅迫處理下分別比CK顯著降低24.6%、31.2%和53.7%。同時(shí)，U+Cd復(fù)合脅迫處理下，葉綠素a和可溶性糖含量顯著低于單一Cd脅迫處理組，而葉綠素b和類胡蘿卜素含量則與U或Cd單一處理相比均無顯著差異。

圖3 U和Cd脅迫下蘿卜幼苗葉片光合色素和可溶性糖含量的變化

2.3.2 光合氣體交換參數(shù)由圖4可知，U、Cd單一及復(fù)合處理均對(duì)蘿卜幼苗光合作用造成顯著抑制。各處理組凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)分別比CK顯著降低43.9%～68.6%、27.6%～55.1%和33.8%～59.5%(P<0.05)，而其胞間CO2濃度(Ci)比CK顯著升高17.7%～25.9%。

圖4 U和Cd脅迫下蘿卜葉片光合氣體交換參數(shù)的變化

同時(shí)，U+Cd復(fù)合處理蘿卜幼苗葉片Pn、Tr和Gs均顯著低于U、Cd單一處理，Ci卻顯著高于單一處理。說明U、Cd復(fù)合脅迫對(duì)蘿卜幼苗光合作用的抑制強(qiáng)于單一處理。

2.3.3 光響應(yīng)曲線及其特征參數(shù)隨著光合有效輻射(PAR)的增加，各處理組蘿卜幼苗葉片Pn均逐漸升高至最高值，而后保持平緩變化，且在同一PAR水平下葉片Pn基本表現(xiàn)為CK>單一Cd處理> 單一U處理 >U+Cd復(fù)合處理；在U、Cd單一及復(fù)合脅迫處理下，曲線的最低值、斜率和最高值均低于CK，表明暗呼吸速率(Rd)增大，表觀量子效率(AQY)和最大凈光合速率(Pnmax)降低(圖5，Ⅰ)。進(jìn)一步用直角雙曲線修正模型擬合發(fā)現(xiàn)，各處理組葉片的Rd比CK顯著升高61.9%～353.1%，而其Pnmax和AQY則分別比CK顯著降低46.6%～56.3%和13.9%～38.6%(圖5，Ⅱ-Ⅳ)。以上結(jié)果表明，U、Cd脅迫下蘿卜幼苗葉片呼吸作用加強(qiáng)，光合作用減弱，且復(fù)合處理影響顯著大于單一處理。

圖5 U和Cd脅迫下蘿卜葉片光合-光響應(yīng)曲線及其相關(guān)參數(shù)的變化

2.3.4 葉綠素a熒光參數(shù)圖6顯示，蘿卜幼苗葉片葉綠素a熒光參數(shù)在單一Cd處理下與CK相比無顯著差異(P>0.05)，而在單一U和U+Cd復(fù)合處理下均受到顯著影響(P<0.05)，且復(fù)合脅迫處理受到的影響更大。在單一U脅迫處理下，葉片實(shí)際光量子產(chǎn)額(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和電子傳遞速率(ETR)分別比CK顯著降低19.9%、49.3%和37.0%，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)則升高為CK的2.1倍；在U+Cd復(fù)合脅迫處理下，葉片ΦPSⅡ、qP和ETR分別比CK顯著降低57.1%、42.4%和70.3%，同時(shí)也比單一U脅迫處理顯著降低， NPQ則比CK顯著升高2.4倍，但與單一U脅迫處理無顯著差異。

圖6 U和Cd脅迫下蘿卜幼苗葉片葉綠素a熒光參數(shù)的變化

3 討 論

U在植物中的富集與其伴生金屬及植物種類密切相關(guān)。Lai等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Cd能影響甘薯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)，促進(jìn)甘薯對(duì)U的吸收；而李宇林[33]研究表明，澤瀉(Alismaplantago-aquatica)和魚腥草(Houttuyniacordata)體內(nèi)U含量與外界Cd濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究中，Cd伴生也促進(jìn)了蘿卜對(duì)U的富集、轉(zhuǎn)運(yùn)?？傮w而言，鈾尾礦中伴生的低劑量Cd能增強(qiáng)蘿卜對(duì)U的富集，或可提高蘿卜對(duì)U污染土壤的修復(fù)效率，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)還需考慮生物量受到抑制對(duì)修復(fù)效率的負(fù)效應(yīng)。

U、Cd均為植物的非必需元素，容易對(duì)植物造成毒害，主要表現(xiàn)為生物量減少、根系活力下降[6,12]及光合能力減弱等[14,16]。本研究顯示，各脅迫處理組均顯著抑制蘿卜幼苗生物量和根系活力，根系活力的降低不利于植株對(duì)水分和礦質(zhì)元素等的吸收。而且U+Cd復(fù)合處理對(duì)蘿卜生長的影響強(qiáng)于單一處理，這與賴金龍等[4]的研究結(jié)果一致。主要原因是復(fù)合處理下U含量的增幅大于Cd含量的降幅，植株體內(nèi)的金屬總含量增加，同時(shí)U和Cd對(duì)植株的毒理機(jī)制不同，共存時(shí)造成雙重毒害[34-35]。

葉綠素是進(jìn)行光合作用的重要色素，其含量可反映光合作用的效能。本研究中在單一U脅迫和U+Cd復(fù)合脅迫下蘿卜幼苗葉片葉綠素a和類胡蘿卜素含量顯著降低，這將明顯影響到葉片的光能利用效率，與前人對(duì)水芹[24]和蠶豆[36]的研究結(jié)果相似。同時(shí)，本研究中U、Cd脅迫處理蘿卜葉片Pn、Tr和Gs均顯著降低，光合作用受到顯著抑制，可溶性糖積累顯著減少，這與前人報(bào)道的U對(duì)黑麥草和黃秋葵光合作用的影響相似[14,16]。影響植物Pn的因素眾多，若Ci伴隨氣孔的關(guān)閉而降低，則Pn的限制因素為氣孔因素，否則為光能吸收、能量轉(zhuǎn)化和電子傳遞等非氣孔因素[37]。本研究結(jié)果顯示，蘿卜幼苗葉片Gs降低的同時(shí)Ci呈升高趨勢，表明U、Cd脅迫下蘿卜Pn的主要限制因素均為非氣孔因素[38]。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可進(jìn)一步反映葉片PSⅡ受損程度。在受到逆境脅迫時(shí)，植物葉片氣孔關(guān)閉會(huì)導(dǎo)致CO2供應(yīng)不足，植物通過加強(qiáng)交替氧化酶呼吸途徑耗散過剩光能，從而保護(hù)光合器官[39]。在本研究中U脅迫處理后，蘿卜葉片光化學(xué)淬滅減弱而非光化學(xué)淬滅加強(qiáng)，說明蘿卜幼苗通過調(diào)整光能分配(增強(qiáng)熱耗散)以保護(hù)光合系統(tǒng)，這與Rd升高的結(jié)果相吻合。同時(shí)，本研究中U脅迫處理組蘿卜葉片ΦPSⅡ和AQY顯著下降，表明葉綠素a含量的降低影響了葉片的光能利用效率。熱耗散的增加和光能利用效率的降低最終導(dǎo)致PSⅡ的電子傳遞速率下降，用于暗反應(yīng)的能量減少，這可能是U脅迫引起蘿卜光合作用減弱的主要原因，與賈文甫等[16]對(duì)黃秋葵的研究結(jié)果相似。另外，本研究中單一Cd脅迫處理對(duì)蘿卜葉片葉綠素?zé)晒鉄o顯著影響，說明該濃度Cd處理下PSⅡ受損程度較小，推測主要原因是分布于葉綠體中的Cd含量未超出PSⅡ的耐受限度[40]。

綜上所述，在單一和復(fù)合脅迫下，U、Cd均主要分布在蘿卜根部，對(duì)幼苗生長和根系活力造成顯著抑制。Cd伴生時(shí)蘿卜對(duì)U的吸收增強(qiáng)，而對(duì)Cd的吸收減弱，植株受到的毒害更大。因此，對(duì)蘿卜的毒害作用表現(xiàn)為U+Cd復(fù)合處理>單一U處理>單一Cd處理。U、Cd脅迫下蘿卜光合作用的主要限制因素均為非氣孔因素；在U脅迫下，蘿卜通過增強(qiáng)熱耗散來保護(hù)光合結(jié)構(gòu)，但葉綠素a含量減少，葉片的光能利用效率降低，最終導(dǎo)致光合作用受阻；Cd對(duì)PSⅡ的影響較小，但Cd伴生加劇了U對(duì)光合作用的抑制?？傊琔是影響蘿卜幼苗生長和光合作用的主要因素，Cd的伴生會(huì)提高植物對(duì)U的吸收效率，但植株受到的毒害更大。