張馳 ，王勁松 ，楊金龍 , ，張俊波 ，萬榮 , ，梁簫 *

( 1. 上海海洋大學(xué) 國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，上海 201306；2. 上海市水產(chǎn)動(dòng)物良種創(chuàng)制與綠色養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣東 廣州 511458；4. 上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海201306；5. 國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306；6. 國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心舟山分中心，浙江 舟山316014)

1 引言

附著變態(tài)是厚殼貽貝（Mytilus coruscus）等海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲生長發(fā)育過程中必經(jīng)的重要階段，一般受到自然環(huán)境中所存在的化學(xué)因子和動(dòng)物自身的內(nèi)源性因子所調(diào)控[1]。其中，生物被膜（Biofilm，BF）作為重要的化學(xué)誘因被廣泛研究。生物被膜是細(xì)菌在成長過程中為應(yīng)對環(huán)境變化而呈現(xiàn)出的一種不同于游離生長形式的菌體，其為聚集黏附于基質(zhì)表面的被膜狀生物群體[2]。環(huán)二鳥苷單磷酸（cyclic di-GMP或c-di-GMP）是細(xì)菌胞內(nèi)普遍存在的一種重要的第二信使，可以通過結(jié)合多種不同類型的效應(yīng)蛋白來調(diào)控細(xì)菌的諸多生物功能和行為，同時(shí)其胞內(nèi)水平的變化會(huì)影響細(xì)菌生物被膜的形成[3]。在生物被膜形成的復(fù)雜過程中，細(xì)菌需要感知、轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞來自細(xì)胞內(nèi)外的化學(xué)信號，將多糖、蛋白、脂類等物質(zhì)分泌到胞外形成 胞 外 產(chǎn) 物（Extracellular Polymeric Substances, EPS）包裹菌體。

海假交替單胞菌（Pseudoalteromonas marina），一株分離自海洋環(huán)境中所形成的生物被膜上的革蘭氏陰性菌，其自身形成的生物被膜及其分泌的多種具有生物學(xué)活性的胞外產(chǎn)物均能誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[4-8]。例如，Peng等[5]在對P. marinaorf01912基因敲除后發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP水平顯著增加，同時(shí)使生物被膜上可拉酸（Colanic Acid, CA）含量增多，從而促進(jìn)了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)；同年，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)P. marina中fliP基因缺失后，突變菌形成的生物被膜誘導(dǎo)厚殼貽貝附著變態(tài)的能力顯著降低，而從野生菌中提取的鞭毛蛋白可以提高幼蟲的附著變態(tài)率[6]；此外，研究表明，P. marina野生菌提取的鞭毛蛋白能夠促進(jìn)生物被膜上胞外產(chǎn)物的產(chǎn)生[8]；近期研究發(fā)現(xiàn)，P. marina中tesA基因缺失會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)c-di-GMP水平升高，同時(shí)導(dǎo)致生物被膜中脂肪酸含量下降，從而抑制了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[7]。以上研究表明，海假交替單胞菌中某一基因的缺失會(huì)影響細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP水平的變化，改變生物被膜胞外產(chǎn)物的含量，從而間接調(diào)控厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。

c-di-GMP已被證實(shí)的胞內(nèi)效應(yīng)蛋白或受體包括PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、退化的GGDEF、EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白、AAA ATPase結(jié)構(gòu)域蛋白以及RNA核糖開關(guān)等[9-10]。PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白作為典型的cdi-GMP結(jié)合蛋白近年來被廣泛研究，兩者結(jié)合可調(diào)控細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性[11-12]、毒性[13]以及纖維素、藻酸鹽[14-15]等胞外多糖的合成和生物被膜形成[16]。但值得注意的是，并不是所有的PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白都具有與c-di-GMP結(jié)合的能力，有些PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白通過與具有GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，參與到c-di-GMP調(diào)控某些生物因子如IV型菌毛（Type IV pili,T4P）的生物合成信號通路中[17]。

本研究通過P. marina基因組數(shù)據(jù)[18]篩選出同時(shí)被注釋為“PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白基因”和“IV型菌毛生物合成基因”的pilZ基因，并利用同源重組的方法構(gòu)建了P. marinapilZ基因的缺失菌。通過比較野生菌與pilZ基因缺失菌的菌落表型、運(yùn)動(dòng)性、形成生物被膜的能力及其生物被膜對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響，為解析P. marina生物被膜的形成機(jī)制、生物被膜與厚殼貽貝附著變態(tài)的互作關(guān)系提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

厚殼貽貝眼點(diǎn)期幼蟲均取自浙江省舟山市嵊泗縣（30°73′N，122°44′E），幼蟲在實(shí)驗(yàn)室條件下暫養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。暫養(yǎng)在鹽度為30，經(jīng)孔徑為0.45 μm的濾膜（Whatman）過濾后的自然海水中，每隔2 d更換2/3水體，每日按時(shí)投喂1次湛江等鞭金藻（5×104cells/mL），放置于18℃暗室內(nèi)充氣培養(yǎng)。

文章所用菌株和質(zhì)粒詳見表1。實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)菌菌株為P. marinaECSMB14103（保藏號：MCCC1K03511），其從形成于浙江省舟山市枸杞島海域（30°73′N，122°77′E）0.5～1.0 m水深的自然生物被膜上分離出來。P. marina野生菌和突變菌均在25℃條件下，于Zobell 2216E培養(yǎng)基（5‰蛋白胨、0.01‰檸檬酸鐵、1‰酵母提取物和15‰瓊脂）中進(jìn)行培養(yǎng)，配制Zobell 2216E培養(yǎng)基的試劑均購買于Sigma公司。本文用到的Escherichia coliWM3064和pK18mobsacB-ery由中國科學(xué)院南海海洋研究所王曉雪研究員實(shí)驗(yàn)室課題組饋贈(zèng)，E.coliWM3064菌株于37℃下在含有0.3 mmol/L DAP（2,6-diamino-pimelic acid）（Sigma）的LB（Luria-Bertani）（Sangon）培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在培養(yǎng)含有pK18mobsacB-ery質(zhì)粒的菌株時(shí)，應(yīng)加入終濃度為50 μg/mL的卡那霉素（Sangon）和25 μg/mL的紅霉素（Sangon）以維持抗性。其他情況下的菌株和質(zhì)粒按照先前的研究進(jìn)行培養(yǎng)[19]。

表1 本研究使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒Table 1 The strains and plasmids used in this study

2.2 方法

2.2.1pilZ基因突變菌株的構(gòu)建

參考Zeng等[21]的同源重組方法構(gòu)建ΔpilZ突變菌株。用帶有限制性酶切位點(diǎn)的引物對，通過PCR擴(kuò)增出pilZ基因的上下游片段。然后通過雙酶切和連接，PCR產(chǎn)物連接到空載體pK18mobsacB-ery上，從而構(gòu)建出重組載體。將重組載體導(dǎo)入到E. coliWM3064中，再將導(dǎo)入成功的WM3064菌株和P. marina野生菌株混合，滴加在1/2 SW-LB-DAP平板（正常配制LB固體培養(yǎng)基的情況下，加入1/2的過濾海水并在滅菌后加入0.3 mmol/L的DAP溶液）上進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)。25℃條件下培養(yǎng)2～5 d后，將菌苔按濃度梯度稀釋涂布于含有紅霉素的Zobell 2216E平板上篩選出單菌落，并用LF/SR和SF/LR引物對進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的菌株涂布于20%蔗糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，挑取單菌落用LF/LR和SF/SR引物對進(jìn)行PCR驗(yàn)證。ΔpilZ菌株利用SF/SR、LF/SR、SF/LR和LF/LR引物對進(jìn)行最終驗(yàn)證。文章所用引物詳見表2。

表2 構(gòu)建ΔpilZ菌株所使用的引物及其序列Table 2 Primers used to construct ΔpilZ strain and its sequences

2.2.2 生物被膜培養(yǎng)

參考Yang等[22]的方法來培養(yǎng)生物被膜。挑取野生菌和ΔpilZ菌單菌落于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h（25℃，200 r/min）。用50 mL無菌離心管收集菌液，離心（3 500 r/min，15 min）、棄上清，保留細(xì)菌沉淀。加入50 mL滅菌過濾海水（Autoclaved Filtered Seawater, AFSW）吹打混勻，離心后棄上清，保留沉淀，上述步驟重復(fù)3次。最終使用AFSW充分混勻細(xì)菌沉淀，并定容至50 mL。吸取100 μL定容后的菌液加入到9 900 μL AFSW中稀釋混勻后吸取1 mL用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，然后使用0.1%吖啶橙對濾膜染色5 min（吖啶橙使用前需用孔徑為0.22 μm濾膜過濾），待濾膜風(fēng)干后制片，使用熒光顯微鏡（Olympus BX51）觀察計(jì)數(shù)，在10×目鏡、100×油鏡下隨機(jī)選取10個(gè)均勻視野進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，每組分別設(shè)置3個(gè)平行，最終通過計(jì)算確定1 mL稀釋菌液的細(xì)菌數(shù)量。根據(jù)所得細(xì)菌密度向裝有無菌載玻片（12.7 mm×38.1 mm）的無菌培養(yǎng)皿（64.0 mm（Φ）×19.0 mm（高））中加入相應(yīng)量菌液，并使用AFSW補(bǔ)加定容至20 mL，一共設(shè)置了1×108cells/mL、3×108cells/mL、5×108cells/mL和1×109cells/mL 4種初始濃度。最后將培養(yǎng)皿放置于18℃條件下培養(yǎng)48 h。

2.2.3 生物被膜上細(xì)菌密度計(jì)數(shù)

取出制備好的生物被膜放入甲醛溶液（5%）中固定24 h后，再用AFSW輕輕潤洗載玻片3次后染色，染色及觀察方法同2.2.2節(jié)，有關(guān)計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[22]。

2.2.4 幼蟲附著變態(tài)鑒定

按上述方法培養(yǎng)好野生菌和ΔpilZ菌的生物被膜，用AFSW輕輕潤洗3次生物被膜，然后將1片附有生物被膜的載玻片和20只活性良好的幼蟲放入盛有20 mL AFSW的無菌玻璃培養(yǎng)皿中。將其置于18℃下避光培養(yǎng)，使用體視顯微鏡在10×目鏡、5×物鏡下觀察幼蟲和附著變態(tài)幼蟲。與幼蟲相比，附著變態(tài)的幼蟲纖毛環(huán)消失、具有鰓和稚貝殼，幼蟲附著變態(tài)的個(gè)數(shù)可間接反映不同單一生物被膜對幼蟲附著變態(tài)影響的差異。無生物被膜的滅菌短玻片（12.7 mm×38.1 mm）作為陰性對照，10-4g/mL的腎上腺素（Epinephrine, EPI）作為陽性對照。不同菌株生物被膜每個(gè)濃度下做9個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.2.5 細(xì)菌菌落形態(tài)

挑取單菌落于2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h（25℃，200 r/min）后，按濃度梯度稀釋涂布于Zobell 2216E固體平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，選取大小均勻的單菌落進(jìn)行表型拍攝。

2.2.6 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性

方法參照Zeng等[21]的描述。挑取野生菌和ΔpilZ菌株單菌落于5 mL的2216E液體培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)置無菌的2216E培養(yǎng)基作為空白對照，置于25℃、200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)至指數(shù)期（OD600約為1.0）。吸取1 μL培養(yǎng)后的菌液垂直懸浮滴加到0.3%瓊脂平板上，在25℃下培養(yǎng)2 d。本試驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

2.2.7 生物被膜膜厚觀察

使用甲醛溶液（5%）將形成好的野生菌和ΔpilZ菌株生物被膜固定24 h，5 μg/mL的碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）用來對生物被膜染色。避光染色15 min后，用AFSW輕輕洗掉生物被膜上多余的染料。每個(gè)載玻片隨機(jī)選擇3個(gè)顯微鏡視野觀察，使用徠卡TCS SP8共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察細(xì)菌分布和生物被膜膜厚。本試驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)獨(dú)立樣片。

2.2.8 生物被膜胞外產(chǎn)物染色

P. marina生物被膜染色方法參考González-Machado等 [23] 和Peng等[5]的方法，具體信息參考表3。使用150 mmol/L氯化鈉溶液潤洗附有生物被膜的載玻片，再避光染色20 min，然后用150 mmol/L氯化鈉溶液輕輕洗去多余染料，處理后的樣片使用共聚焦激光掃描顯微鏡和LAS X軟件采集共聚焦圖像。野生菌和ΔpilZ菌株生物被膜分別制備3個(gè)重復(fù)樣片，每個(gè)樣片隨機(jī)選取3個(gè)均勻視野進(jìn)行拍攝。

表3 激光共聚焦顯微鏡熒光染料信息Table 3 Laser confocal microscopy fluorescence dye information

2.2.9 胞內(nèi)c-di-GMP定量

將野生型和ΔpilZ突變菌株用2216E液體培養(yǎng)基搖瓶在25℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16～18 h，并用干凈無菌的2216E培養(yǎng)基稀釋至OD600值為0.3。取5 mL稀釋后的菌液于12 000×g下離心5 min，棄去上清，保留沉淀。將沉淀風(fēng)干后，加入100 μL的c-di-GMP提取液（0.1%（V/V）甲酸、40%（V/V）乙腈、40%（V/V）甲醇和19.9%（V/V）水），吹打混勻后在冰上孵育15 min；然后于16 000 ×g下離心5 min。取上清液用于LC-MS/MS定量分析，方法參考文獻(xiàn)[24]。c-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算上清液濃度，該實(shí)驗(yàn)設(shè)置了9個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.2.10 數(shù)據(jù)分析

附著變態(tài)的幼蟲所占的百分比要通過Arcsine轉(zhuǎn)換以提高數(shù)據(jù)正態(tài)性。在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析前，利用JMPTM軟件（10.0.0版）的Shapiro-Wilk’s W檢驗(yàn)來檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性。采用Kruskal-Wallis和Steel-Dwass All Pairs檢驗(yàn)組間差異顯著性。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。p＜0.05作為差異顯著性的臨界值。使用Image J軟件處理共聚焦圖像，計(jì)算生物被膜胞外產(chǎn)物中各個(gè)成分的含量（單位：μm3）。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR鑒定pilZ基因缺失

如圖1A所示，M表示DNA標(biāo)記，自上而下條帶大小分別為4 500 bp、3 000 bp、2 000 bp、1 200 bp、800 bp、500 bp、200 bp。第1、3、5、7號條帶是用野生型菌株的總DNA為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，第2、4、6、8號條帶是用突變菌總DNA為模板擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物。1號和2號條帶所用引物對為pilZ-SF/-SR，3號和4號條帶所用引物對為pilZ-LF/-SR，5號和6號條帶所用引物對為pilZ-SF/-LR，7號和8號條帶所用引物對為pilZ-LF/-LR。野生型菌株的PCR產(chǎn)物對應(yīng)大小分別為1 991 bp（條帶1）、2 155 bp（條帶3）、2 849 bp（條帶5）和3 013 bp（條帶7）；ΔpilZ的PCR產(chǎn)物對應(yīng)大小則分別為1 664 bp（條帶2）、1 828 bp（條帶4）、2 522 bp（條帶6）和2 686 bp（條帶8）。圖1B為P. marina pilZ基因敲除前后的基因簇。

圖1 pilZ基因缺失驗(yàn)證（A）和缺失前后基因簇（B）Fig. 1 The pilZ gene deletion verification (A) and gene cluster(B) before and after knockout

3.2 ΔpilZ生物被膜對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響

對野生型和ΔpilZ菌株生物被膜的幼蟲附著變態(tài)率進(jìn)行分析比較顯示，ΔpilZ生物被膜的幼蟲附著變態(tài)率顯著低于野生菌生物被膜（p＜0.05）（圖2A），抑制了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。其中，初始細(xì)菌密度5×108cells/mL下，ΔpilZ附著變態(tài)率較野生菌下降極為顯著，相比較于野生型菌株33.88%的附著變態(tài)率，ΔpilZ菌株附著變態(tài)率僅為10.56%，附著變態(tài)率下降了68.87%（p＜0.01）。此外，ΔpilZ生物被膜的細(xì)菌密度在不同初始細(xì)菌濃度下，均顯著高于野生菌生物被膜，初始細(xì)菌密度5×108cells/mL下，ΔpilZ生物被膜細(xì)菌密度較野生型增加了35.76%（p＜0.05）（圖2B）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，無論是野生菌還是ΔpilZ菌，生物被膜的細(xì)菌密度與其幼蟲附著變態(tài)率均無顯著關(guān)系（p＞0.05）。

圖2 不同初始細(xì)菌密度下野生菌與ΔpilZ菌生物被膜對幼蟲附著變態(tài)的影響（A）及生物被膜細(xì)菌密度的分析（B）Fig. 2 Effect of wild-type and ΔpilZ biofilms formed with different initial bacterial density on larval settlement and metamorphosis (A) and the analysis of biofilm bacterial density (B)

3.3 pilZ基因缺失對菌體形態(tài)的影響

P. marina野生菌單一菌落表型為規(guī)則的圓形，表面光滑（圖3A），ΔpilZ菌株單個(gè)菌落表型與野生菌相比，未顯示出明顯不同的變化（圖3B）。

圖3 菌落形態(tài)Fig. 3 Colony morphology of bacteria

3.4 ΔpilZ菌運(yùn)動(dòng)性和生物被膜CLSM圖像分析

野生菌在半固體培養(yǎng)基上形成了明顯的趨化圈，但與野生型菌相比，ΔpilZ菌株的運(yùn)動(dòng)性降低（圖4A）。CLSM圖像顯示，ΔpilZ生物被膜上聚集的細(xì)菌比野生菌生物被膜多，二者數(shù)量明顯不同（圖4C，圖4D）。野生菌生物被膜的膜厚為（5.16±0.16）μm，而ΔpilZ菌生 物 被 膜 膜 厚 為（6.2±0.18）μm，較 野 生 菌 增 加 了20.16%，差異性分析顯示，二者之間存在顯著性差異（p＜0.05）（圖4B）。

圖4 野生型菌株和ΔpilZ菌株運(yùn)動(dòng)性（A）、生物被膜（C、D）和膜厚（B）Fig. 4 Motility (A), biofilm (C, D) and biofilm thickness (B)of wild-type and ΔpilZ strains

3.5 ΔpilZ生物被膜胞外產(chǎn)物CLSM圖像分析

共聚焦圖像及生物量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果比較顯示，與野生型菌株相比，ΔpilZ菌株生物被膜胞外產(chǎn)物中β-多糖和蛋白含量變化不同（圖5A）。CLSM圖像處理結(jié)果表明，其中β-多糖含量降低了42.57%，蛋白含量下降了19.34%，而對于α-多糖和脂質(zhì)未觀察到差異（p＞0.05，圖5B）。

圖5 野生型菌株和ΔpilZ菌株生物被膜共聚焦掃描圖像（A）和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（B）Fig. 5 Confocal scanning images (A) and statistical results (B) of biofilm of wild-type and ΔpilZ strains

3.6 細(xì)菌c-di-GMP水平

根據(jù)LC-MS/MS定量分析結(jié)果以及c-di-GMP標(biāo)準(zhǔn)曲線得出，ΔpilZ胞內(nèi)c-di-GMP水平為（20.50±1.09）ng/mL，野生菌胞內(nèi)c-di-GMP水平為（21.10±1.35）ng/mL，突變菌株與野生菌胞內(nèi)c-di-GMP水平無顯著性差異（p＞0.05）（圖6）。

圖6 野生菌和ΔpilZ菌的胞內(nèi)c-di-GMP水平Fig. 6 The c-di-GMP levels of wild-type and ΔpilZ strains

4 結(jié)論與討論

c-di-GMP作為細(xì)菌胞內(nèi)第二信使早已在30多年前被首次報(bào)道過[14]，且被證實(shí)與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)、細(xì)菌聚集、胞外產(chǎn)物的生成和生物被膜形成有關(guān)[25-27]。在絕大多數(shù)細(xì)菌中，胞內(nèi)c-di-GMP水平調(diào)控細(xì)菌由浮游生活向固著生物被膜生活方式的轉(zhuǎn)變[28-30]。Jenal等[3]研究表明，當(dāng)細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP處于較高水平時(shí)會(huì)使細(xì)菌聚集靠攏，進(jìn)而促進(jìn)生物被膜的形成。同時(shí)，胞內(nèi)c-di-GMP的水平與纖維素[31-32]、藻酸鹽[15]、Pel多糖[33]等細(xì)菌胞外多糖的產(chǎn)生也緊密相關(guān)；藻酸鹽和Pel多糖[34-35]等胞外多糖又可影響銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）生物被膜的形成。因此，細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP水平不僅可以直接影響生物被膜的形成，還可以通過調(diào)控胞外多糖的含量來影響生物被膜形成。在海假交替單胞菌以往的研究中，當(dāng)菌體多糖合成相關(guān)基因orf01912、脂肪酸合成基因tesA和纖維素合成基因BcsQ缺失后，細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP水平發(fā)生變化，影響生物被膜胞外產(chǎn)物的含量，進(jìn)而影響厚 殼 貽 貝 幼 蟲 的 附 著 變 態(tài)[5,7,36]。其 中，胞 外 多 糖 合 成相關(guān)基因01912表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)域中含有可與c-di-GMP結(jié)合的AAA ATPase結(jié)構(gòu)域，當(dāng)c-di-GMP的靶基因01912缺失后，菌體胞內(nèi)c-di-GMP水平升高[5]，表明菌體某些結(jié)合蛋白基因的缺失會(huì)影響到胞內(nèi)cdi-GMP水平的改變，從而引起生物被膜胞外產(chǎn)物的變化。在本研究中，pilZ基因缺失后形成的生物被膜胞外β-多糖和蛋白的含量、誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的能力均顯著降低（p＜0.05）。然而，野生菌與ΔpilZ菌株胞內(nèi)c-di-GMP水平的定量結(jié)果顯示，兩株菌胞內(nèi)c-di-GMP水平并無顯著性變化（p＞0.05），與此前的研究呈現(xiàn)出相反的結(jié)果。通過對pilZ基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)其具有PilZ結(jié)構(gòu)域，表明該表達(dá)產(chǎn)物是c-di-GMP結(jié)合蛋白。然而當(dāng)P. marina pilZ基因缺失后并未像此前的研究結(jié)果那樣可以通過影響菌體胞內(nèi)c-di-GMP的水平來改變胞外產(chǎn)物的含量，從而影響厚殼貽貝附著變態(tài)。因此，推測該基因可能通過其他途徑調(diào)控生物被膜形成及厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)。

pilZ基因最初發(fā)現(xiàn)是作為IV型菌毛生物合成和抽搐運(yùn)動(dòng)所必需的調(diào)控基因[18]。Welker等[37]研究表明，T4P運(yùn)動(dòng)馬達(dá)的活性可調(diào)節(jié)細(xì)菌微菌落的局部結(jié)構(gòu)和黏度，微菌落作為生物被膜的前體結(jié)構(gòu)直接影響生物被膜的成熟與否。在腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）中，T4P的收縮可以增強(qiáng)菌落的流動(dòng)性，從而有利于生物被膜的擴(kuò)散、成熟[38]。在銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）和黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）中，抽搐運(yùn)動(dòng)作為菌體的另一種特殊運(yùn)動(dòng)方式影響生物被膜形成[39-41]。在本研究中，相較于野生菌，pilZ基因缺失后菌體運(yùn)動(dòng)能力下降，生物被膜上細(xì)菌密度、膜厚明顯增加（p＜0.05），這可能是因?yàn)閜ilZ基因缺失影響T4P的抽搐運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌附著在載玻片上時(shí)運(yùn)動(dòng)性減弱，使細(xì)菌更容易聚集在一起形成生物被膜。

同時(shí)，在對黃色黏球菌的研究中發(fā)現(xiàn)[42]，菌體S運(yùn)動(dòng)過程中，細(xì)菌胞外多糖可以調(diào)節(jié)T4P的反應(yīng)，且二者之間存在相互作用，T4P的缺失會(huì)影響到胞外多糖的含量。而多糖作為生物被膜胞外產(chǎn)物的主要成分[2]，可誘導(dǎo)海洋無脊椎動(dòng)物幼蟲的附著變態(tài)。如纖維素的過量產(chǎn)生、莢膜多糖的減少均可以抑制厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[21,43]；可拉酸含量增加，會(huì)促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[5]。本研究中，與野生型菌株相比，ΔpilZ菌株所形成的生物被膜顯著抑制了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)；通過共聚焦圖像分析結(jié)果可以看出，ΔpilZ菌株較野生型菌株而言，胞外產(chǎn)物中β-多糖和胞外蛋白含量顯著下降，相關(guān)性分析結(jié)果表明，幼蟲附著變態(tài)率與二者顯著相關(guān)（p＜0.05）。由此可見，pilZ基因缺失后菌體可能因無法正常組裝T4P而引起菌體運(yùn)動(dòng)性下降、生物被膜上的胞外多糖含量及蛋白減少，進(jìn)而抑制了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。另外，pilZ基因缺失后菌體表面的T4P變化以及該基因的表達(dá)產(chǎn)物與c-di-GMP之間的相互作用仍需進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究利用同源重組方法構(gòu)建P. marina pilZ基因缺失菌，菌體pilZ基因的缺失會(huì)影響T4P的正常組裝和抽搐運(yùn)動(dòng)，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性減弱，形成的生物被膜膜厚增加、細(xì)菌密度增加，胞外產(chǎn)物中β-多糖和蛋白含量減少，進(jìn)而降低了對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的誘導(dǎo)能力。本研究為進(jìn)一步了解海洋細(xì)菌生物被膜形成的分子機(jī)制及其對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的誘導(dǎo)機(jī)制提供了理論依據(jù)。