姜釗 ，張衛(wèi)花 *

( 1. 西藏民族大學(xué) 藏藥檢測(cè)技術(shù)教育部工程研究中心，陜西 咸陽 712082；2. 西藏民族大學(xué) 西藏高原相關(guān)疾病分子遺傳機(jī)制與干預(yù)研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712082)

1 引言

海洋環(huán)境復(fù)雜多樣，理化性質(zhì)獨(dú)特，孕育了豐富的海洋微生物，從海洋表層到海底幾千米的地方都有其生命活動(dòng)。海洋微生物不僅能進(jìn)行光合作用，也能通過同化海洋環(huán)境中的各種營養(yǎng)物質(zhì)為大型生物提供營養(yǎng)；同時(shí)，也能以分解者的角色為海洋植物提供無機(jī)營養(yǎng)，維持整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)的良性可持續(xù)的循環(huán)[1]。然而，隨著海洋資源的過渡開采，人類正面臨著諸如資源短缺、環(huán)境污染和人類健康危機(jī)等日益嚴(yán)重的生存與發(fā)展危機(jī)。在這種大背景下，海洋微生物的重要性不僅僅體現(xiàn)在元素循環(huán)、物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動(dòng)方面，也在生物的演化研究、CO2的減排、節(jié)能以及資源的可持續(xù)發(fā)展與利用等方面發(fā)揮積極作用[2]。

2010年由麥切·索基恩負(fù)責(zé)的全球海洋生物普查計(jì)劃順利完成，該計(jì)劃分析了超過1 200個(gè)區(qū)域的海洋樣本，最終估計(jì)海洋微生物種類達(dá)到10億種左右，微生物的總重量相當(dāng)于2 400億頭非洲象，這些微生物無論是從多樣性還是豐富度方面都達(dá)到了令人吃驚的程度[3]。但是，海洋微生物的純培養(yǎng)數(shù)量依然較少，科學(xué)家們開展了包括太平洋、印度洋、南海、Woodlark海盆、日本海、秘魯邊緣、卡斯卡底古陸邊緣海域、鄂霍次克海、地中海等一系列海洋環(huán)境微生物的純培養(yǎng)及多樣性分析工作[4-11]，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，被描述的海洋來源微生物物種只占全球全部已描述微生物的9.7%，每年增加速率僅為0.93%，大多數(shù)海洋微生物還沒有實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)室的純培養(yǎng)[12]。環(huán)境樣品中可培養(yǎng)微生物的多樣性及出菌率與菌種分離時(shí)所用的樣品預(yù)處理方法、選擇培養(yǎng)基的種類以及培養(yǎng)條件等息息相關(guān)。比如，樣品稀釋法可減少優(yōu)勢(shì)微生物的競(jìng)爭(zhēng)，利于寡營養(yǎng)微生物的分離[13]；稀有碳氮源的添加，可獲得更多稀有放線菌和細(xì)菌類群[14]；新鮮濕樣經(jīng)過自然風(fēng)干稀釋后，進(jìn)行瞬時(shí)濕熱處理，適合放線菌類群的分離培養(yǎng)[15-16]。因此，不同分離方法的探索、培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)，在海洋微生物純培養(yǎng)分離中顯得格外重要。

為調(diào)查印度洋深海沉積物放線菌資源的豐富性，同時(shí)探索放線菌分離條件，本研究以采自印度洋深海沉積物樣品為研究對(duì)象，利用多種分離培養(yǎng)基，采用濕熱處理法，在前期響應(yīng)面法優(yōu)化的樣品處理?xiàng)l件基礎(chǔ)上，對(duì)采自印度洋深海沉積物樣品中放線菌進(jìn)行純培養(yǎng)分離，爭(zhēng)取最大程度分離得到純培養(yǎng)放線菌及其他類群，以期為后期放線菌代謝產(chǎn)物分離及相關(guān)研究提供材料。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品來源

本實(shí)驗(yàn)樣品于2013年采自印度洋，為深海沉積物樣品，采用抓斗、箱式取樣方法獲得，沉積表層約5 cm深度作為取樣區(qū)域，共取樣12份，-20℃保存，取樣點(diǎn)的經(jīng)緯度及深度信息見表1，圖1。

圖1 取樣點(diǎn)地理分布Fig. 1 The geographical distribution of sampling sites

表1 印度洋沉積物采樣點(diǎn)信息Table 1 Information of sampling sites from Indian Ocean sediment

2.1.2 分離培養(yǎng)基

依照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取14種分離培養(yǎng)基（表2）進(jìn)行培養(yǎng)分離，每種培養(yǎng)基添加2.12%海鹽（海彩海水晶，上海海彩生物科技有限公司）以模擬海水環(huán)境，同時(shí)添加50 mg/L制霉菌素和25 mg/L萘啶酮酸，以抑制真菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，從而獲得更多放線菌類群。

表2 14種分離培養(yǎng)基Table 2 14 kinds of culture media

2.2 菌株分離、純化及保藏

為獲得更多海洋放線菌類群，根據(jù)前期優(yōu)化獲得樣品的最優(yōu)處理?xiàng)l件，采用濕熱處理方法進(jìn)行分離：（1）沉積物樣品于無菌培養(yǎng)皿風(fēng)干1.7 d；（2）稱取2 g樣品至18 mL無菌水中混勻，水浴鍋濕熱處理（濕熱處理溫度為55℃，濕熱處理時(shí)間為1.3 min）；（3）置于28℃搖床搖勻20 min，分別取100 μL樣品稀釋液涂布于14種分離培養(yǎng)基（均加2.12%海鹽，同時(shí)添加50 mg/L制霉菌素和25 mg/L萘啶酮酸），每組3個(gè)重復(fù)，并置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 d；（4）挑取每個(gè)平板不同形態(tài)菌落于TSA及IPS2培養(yǎng)基中劃線、純化、編號(hào)，記錄分離來源及分離培養(yǎng)基信息；（5）純化培養(yǎng)后收集每株菌菌體并利用牛奶管保藏。

2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序

利用酶解法提取收集的各菌株DNA[17]，采用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物[18]進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PA：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′； PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系：10×Buffer（Mg2+2.5 mmol）5 μL、正向引物 PA（0.25 μmol）1 μL、反向引物 PB（0.25 μmol）1 μL、dNTP 1 μL、DNA 1 μL、Taq DNA聚合酶0.3 U，用ddH2O定容至50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min（循環(huán)30次）；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用λ-EcoT14 Idigest DNA Marker為對(duì)照，產(chǎn)物檢測(cè)回收后送昆明泊尚生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，先測(cè)一個(gè)反應(yīng)1～800 bp（V1-V4）判斷種屬相似性，若低于98.5 %再進(jìn)行反向測(cè)序。

2.4 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過觀察返回的16S rRNA基因序列峰圖，選取測(cè)序結(jié)果好的序列，雙向測(cè)序則利用Seqman進(jìn)行拼接，得到1 500 bp左右全長(zhǎng)序列。利用EzBioCloud BLAST（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）[19]進(jìn)行序列相似性分析；選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列作為參比對(duì)象，采用Clustal X軟件[20]進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果利用MEGA 7.0[21]軟件分析，基于鄰近法（NJ）[22]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

3 結(jié)果與討論

3.1 菌株的分離結(jié)果

分離平板培養(yǎng)30 d后，根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色等特征，挑取分離平板上的單菌落進(jìn)行純化、去重，總共從12個(gè)分離樣品中純化得到343株放線菌和細(xì)菌純培養(yǎng)物，并對(duì)其16S rRNA基因進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，鑒定為4個(gè)門：放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；分屬5個(gè)綱：放線菌綱（Actinobacteria）、噬纖 維 菌 綱（Cytophagia）、芽 孢 桿 菌 綱（Bacilli）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）；13個(gè)目：棒桿菌目（Corynebacteriales）、微球菌目（Micrococcales）、丙酸桿菌亞目（Propionibacteriales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、鏈霉菌目（Streptomycetales）、鏈孢囊菌目（Streptosporangiales）、嗜纖維菌目（Cytophagales）、芽孢桿菌目（Bacillales）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、紅 細(xì) 菌 目（Rhodobacterales）、假 單 胞 菌 目（Pseudomonadales）和海洋螺菌目（Oceanospirillales）下的26個(gè)科39個(gè)屬121個(gè)種，如表3所示?？梢钥闯觯悍蛛x菌株中放線菌門占比最高，占13個(gè)科，20個(gè)屬，71個(gè)種（占比58.7%），這可能是因?yàn)闃悠诽幚砗团囵B(yǎng)條件更利于放線菌的選擇性培養(yǎng)；其次為變形菌門和厚壁菌門（分離種數(shù)分別占21.5%和17.4%）；擬桿菌門最少。各屬中分布的菌種數(shù)見表4，其中鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、考克氏菌屬（Kocuria）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、迪茨氏菌屬（Dietzia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、微桿菌屬（Microbacterium）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）為所采印度洋深海沉積物樣品中的優(yōu)勢(shì)微生物類群，其中鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬分布最多。同時(shí)分離得到了部分?jǐn)?shù)量較少類群，如：食烷菌屬（Alcanivorax）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、葉桿菌屬（Phyllobacterium）、鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）、紫桿菌屬（Porphyrobacter）、芽球菌屬（Blastococcus）、劉志恒菌屬（Zhihengliuella）、檸檬球菌屬（Citricoccus）、拉氏桿菌屬（Rathayibacter）、威廉姆斯菌屬（Williamsia）等。將分離到的放線菌、細(xì)菌及近緣物種建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2和圖3。

圖2 印度洋沉積物中放線菌16S rRNA基因序列鄰近系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of actinobacterial isolates collected from the Indian Ocean sediment

圖3 印度洋沉積物中細(xì)菌16S rRNA基因序列鄰近系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of bacterial isolates collected from the Indian Ocean sediment

表3 分離菌株整體分布表Table 3 Overall distribution of isolated strains

表4 種分布百分比Table 4 Percentages of species distribution

3.2 不同樣點(diǎn)的菌株分離比較

統(tǒng)計(jì)各樣點(diǎn)菌株分離結(jié)果見圖4，由圖可知HF06、HF13、HF14、HF16、HF17、HF18、HF19采樣點(diǎn)樣品的多樣性較豐富，這7個(gè)采樣點(diǎn)都分離出了大于11個(gè)屬，18個(gè)種的菌株。其中HF17采樣點(diǎn)樣品的多樣性最豐富，可能因?yàn)闃悠返姆蛛x及處理?xiàng)l件更利于其樣品純培養(yǎng)菌株的分離。鏈霉菌屬、微桿菌屬在這12個(gè)樣品中都分離到，為海洋沉積物微生物優(yōu)勢(shì)類群。部分菌株只在極少數(shù)樣品中分離得到，例如：拉氏桿菌屬只在HF02采樣點(diǎn)樣品中分離得到；威廉姆斯菌屬只在HF06采樣點(diǎn)樣品中分離得到；地中海菌屬（Martelella）、葉桿菌屬只在HF10采樣點(diǎn)樣品中分離到；短桿菌屬（Brevibacterium）只在HF13采樣點(diǎn)樣品中分離到；嗜冷桿菌屬只在HF14采樣點(diǎn)樣品中分離得到；劉志恒菌屬只在HF17采樣點(diǎn)樣品中分離得到；芽球菌屬、類諾卡氏菌屬只在HF19采樣點(diǎn)樣品中分離得到；食烷菌屬只在HF10采樣點(diǎn)和HF19采樣點(diǎn)樣品中分離得到；兩面神菌屬（Janibac-ter）、鞘脂單胞菌屬只在HF02采樣點(diǎn)和HF17采樣點(diǎn)樣品中分離到；中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）只在HF10采樣點(diǎn)和HF17采樣點(diǎn)樣品中分離得到，不同采樣點(diǎn)中細(xì)菌分離多樣性差異明顯。

圖4 所有沉積物樣品中不同類群細(xì)菌菌株數(shù)目Fig. 4 Strain numbers of different bacteria groups isolated from all sediment samples

3.3 菌株的多樣性與分離培養(yǎng)基的關(guān)系

在分離的所有菌株中，由于對(duì)不同培養(yǎng)基的營養(yǎng)需求不同，每種培養(yǎng)基分離出的菌株數(shù)量不同，統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基分離菌株數(shù)目見圖5。由圖可知，在14種分離培養(yǎng)基中，M2、M3、M7、M9、M10、M12、M13這7種培養(yǎng)基分離效果較好，分離菌株數(shù)都在15個(gè)種以上，M7培養(yǎng)基分離的菌株數(shù)超過20個(gè)種，M12超過30個(gè)種。顯而易見，培養(yǎng)基M7和M12分離的菌株多樣性最豐富，因此，包含不同營養(yǎng)物的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)對(duì)菌株的分離極為重要。

圖5 不同培養(yǎng)基中分離的細(xì)菌菌株類群及數(shù)目Fig. 5 Strain numbers of different bacteria groups isolated from different culture media

3.4 潛在的新分類單元

目前普遍認(rèn)為16S rRNA 基因序列相似性小于95%，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成的穩(wěn)定獨(dú)立分支又具有特征性堿基，可以大體作為屬的界限；16S rRNA基因序列相似性小于98%且DNA雜交同源性小于70%為“種”的界限[23-24]。因此，將16S rRNA序列相似性低于98%的菌株確定為潛在新分類單元，本研究共發(fā)現(xiàn)12個(gè)潛在分類單元（表5）。主要分布在食烷菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、成對(duì)桿菌屬（Dyadobacter）、芽殖桿菌屬（Gemmobacter）、球菌屬（Macrococcus）、中慢生根瘤菌屬、葉桿菌屬、動(dòng)性球菌屬（Planococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）9個(gè)屬。其中，菌株YIM M12122、YIM M12139和YIM M12140與最相近的菌株16S rRNA基因相似性均低于95%，是潛在的新屬。由此可見，印度洋深海沉積物中存在著大量的未被發(fā)現(xiàn)的微生物類群，是巨大的資源寶庫。

表5 潛在新物種的16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果Table 5 Comparison of 16S rRNA gene sequences of potential new species

4 結(jié)論

采自印度洋的12個(gè)樣點(diǎn)中共分離得到343株放線菌和細(xì)菌純培養(yǎng)物，共分布在39個(gè)屬121個(gè)種。其中，放線菌門占58.7%，變形菌門占21.5%，厚壁菌門占17.4%，擬桿菌門占2.4%。對(duì)比以往海洋微生物分離結(jié)果（圖6）：Goodfellow和Fiedler[25]的研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的放線菌共有49個(gè)屬，包括12個(gè)新屬，這12個(gè)新的分類單元全部是2000年后才從海洋環(huán)境中首次發(fā)現(xiàn)和描述的；徐盈[26]從南海沉積物環(huán)境中分離得到40個(gè)科64個(gè)屬，其中18個(gè)屬與Goodfellow和Fiedler分離相同。在本研究中分離得到的39個(gè)屬中分別有12個(gè)屬和19個(gè)屬與文獻(xiàn)[25-26]分離的細(xì)菌屬相同，共有8個(gè)屬在3次分離中均得到，而本研究中檸檬球菌屬等16個(gè)屬在以上研究中并未分離得到。其中，人們很容易從海洋分離得到的優(yōu)勢(shì)類群如小單胞菌屬、紅球菌屬、鏈霉菌屬及迪茨氏菌屬[27]的后3個(gè)在本研究中大量分離得到，為本次分離得到的優(yōu)勢(shì)類群。而專屬海洋菌鹽細(xì)菌屬（Salinibacterium）和鹽水孢菌屬（Salinispora）[14]未被分離到，說明了在純培養(yǎng)條件的局限下得到的微生物種類仍然有限。在本次分離中，得到部分?jǐn)?shù)量較少的類群，如食烷菌屬、嗜冷桿菌屬、葉桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、紫桿菌屬、芽球菌屬、劉志恒菌屬、檸檬球菌屬、拉氏桿菌屬、威廉姆斯菌屬等，可能設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基和樣品處理?xiàng)l件不利于上述類群的生長(zhǎng)。不同的培養(yǎng)基分離差異比較中發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基分離得到的物種數(shù)差異較大，也證明了不同的針對(duì)性培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及樣品處理方法的探索是得到更多可培養(yǎng)細(xì)菌的前提和保障。本研究共發(fā)現(xiàn)12個(gè)潛在分類單元，其中菌株YIM M12122、YIM M12139和YIM M12140與最相近的菌株16S rRNA基因相似性均低于95%，是潛在的新屬。研究表明，不同的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基的選擇直接影響到樣品中純培養(yǎng)微生物獲得的幾率和數(shù)量，后期可利用免培養(yǎng)的測(cè)序數(shù)據(jù)討論樣品所含微生物的多樣性，并結(jié)合其他分子生物學(xué)手段更好地設(shè)計(jì)和改造純培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基，以加大純培養(yǎng)微生物的獲得率。