張石豐，陳艷樂(lè)，余耀華，楚玉潔

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，鄭州 450000

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)組織類型分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中，NSCLC占所有肺癌類型的80%以上。早期NSCLC患者可無(wú)明顯癥狀，與肺部感染等疾病的癥狀相似，容易被誤診從而延誤治療時(shí)機(jī)[1]。NSCLC的轉(zhuǎn)移以直接擴(kuò)散、血行轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床治療難度將明顯增高，生存率明顯降低[2]。隨著細(xì)胞與生物分子學(xué)研究的發(fā)展，NSCLC發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制與腫瘤治療的新靶點(diǎn)逐漸被關(guān)注。可溶性B7-H4蛋白（soluble B7-H4 protein，sB7-H4）是 B7家族新成員，在卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，具有減弱腫瘤免疫應(yīng)答作用[3]。溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是布羅莫結(jié)構(gòu)蛋白BET家族成員，與多種惡性腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，其與NSCLC的關(guān)系一直是臨床研究的熱點(diǎn)[4]。此外，S100鈣結(jié)合蛋白A4（S100 calcium binding protein A4，S100A4）與多種細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)有關(guān)，與腫瘤關(guān)系的研究也越來(lái)越多[5]。本研究探討sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白在NSCLC中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床NSCLC的治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月至2018年8月鄭州市中心醫(yī)院收治的NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NSCLC；②臨床資料完整且真實(shí)；③接受的治療方案相同。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并血液系統(tǒng)疾??；②合并嚴(yán)重精神疾病或癡呆；③合并其他原發(fā)性惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入98例NSCLC患者，其中男52例，女46例；年齡25～70歲，平均（56.71±8.82）歲。同期選取50例肺良性病變患者，其中男26例，女24例；年齡25～72歲，平均（56.75±8.79）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 免疫組化法檢測(cè)sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白的表達(dá)情況

取98例NSCLC患者的腫瘤組織及50例肺良性病變患者的正常肺組織，石蠟包埋，2 μm切片，烘烤60℃，二甲苯脫蠟，浸泡3次?？乖迯?fù)切片在離子水中浸泡3次，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次。滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育15 min，沖洗。觀察組滴加一抗（G-蛋白偶聯(lián)受體124多克隆抗體，稀釋濃度為1∶100），室溫孵育1 h，沖洗；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠或羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，室溫孵育30 min。對(duì)照組以PBS代替一抗；滴加山羊抗兔二抗（eBioscience）室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，樹(shù)膠封片。

根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定[6]：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜25%計(jì)1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為26%～50%計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞50%計(jì)3分；無(wú)著色計(jì)0分，黃色染色計(jì)1分（弱陽(yáng)性），淺棕色染色計(jì)2分（中等陽(yáng)性），棕褐色染色計(jì)3分（強(qiáng)陽(yáng)性）。將陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度評(píng)分相加，0～3分為無(wú)表達(dá)或低表達(dá)，4～6分為高表達(dá)。

1.3 隨訪方法

所有患者治療結(jié)束后采用門(mén)診復(fù)查或微信、電話方法進(jìn)行為期2年的隨訪，隨訪時(shí)間截至2020年8月30日，記錄兩組患者的預(yù)后情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；NSCLC患者預(yù)后的影響因素采用多因素Logistic回歸分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），評(píng)估sB7-H4、BRD4、S100A4單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表達(dá)情況的比較

腫瘤組織中sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白高表達(dá)率均明顯高于正常肺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 肺癌組織與正常肺組織中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表達(dá)情況的比較

2.2 不同預(yù)后情況NSCLC患者腫瘤組織中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表達(dá)情況的比較

隨訪2年，98例NSCLC患者生存73例，死亡25例。死亡NSCLC患者腫瘤組織中sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白高表達(dá)率均高于生存患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同預(yù)后情況NSCLC患者腫瘤組織中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表達(dá)情況的比較

2.3 NSCLC患者預(yù)后生存影響因素的單因素和多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，NSCLC患者的生存可能與病理類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、分化程度、腫瘤直徑、TNM分期、sB7-H4蛋白表達(dá)情況、BRD4蛋白表達(dá)情況、S100A4蛋白表達(dá)情況有關(guān)（P＜0.05），與年齡可能無(wú)關(guān)（P＞0.05）。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度為低中分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、sB7-H4蛋白高表達(dá)、BRD4蛋白高表達(dá)、S100A4蛋白高表達(dá)均是NSCLC患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.01）。（表3）

表3 NSCLC患者預(yù)后生存影響因素的單因素和多因素分析

2.4 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線顯示，sB7-H4+BRD4+S100A4聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)NSCLC患者死亡的AUC為0.890（95%CI：0.751～1.000），高于三者單獨(dú)檢測(cè)的0.809、0.850、0.764。（表4、圖1）

表4 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖1 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后死亡的ROC曲線

3 討論

肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤相關(guān)死亡原因，中國(guó)每年新發(fā)肺癌約75萬(wàn)例[7]。超過(guò)80%的肺癌類型為NSCLC，其中30%為鱗狀細(xì)胞癌，約50%的患者確診時(shí)就已經(jīng)處于晚期[8]。免疫治療是近年來(lái)肺癌治療領(lǐng)域的新突破，使NSCLC的治療方法明顯進(jìn)步，但部分患者的治療效果仍不理想，預(yù)后較差。因此，早診斷、有效治療對(duì)NSCLC患者的預(yù)后至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC的發(fā)生發(fā)展是多種基因、細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果，因此，開(kāi)發(fā)NSCLC早期診斷的標(biāo)志物及分子治療新靶點(diǎn)成為臨床治療的新方向[9]。

sB7-H4屬于免疫球蛋白超家族成員，其通過(guò)抑制CD4+T細(xì)胞的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期，刺激白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）對(duì)T細(xì)胞發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[10]。目前，sB7-H4已經(jīng)被證明具有抗腫瘤作用，但主要集中于sB7-H4作為腫瘤抑制基因抑制卵巢癌進(jìn)展方面，關(guān)于其對(duì)NSCLC的研究報(bào)道甚少[11]。本研究結(jié)果顯示，sB7-H4在NSCLC患者中高表達(dá)，且其高表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示sB7-H4蛋白對(duì)NSCLC患者的預(yù)后有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值。

BRD4由4個(gè)α螺旋及2個(gè)螺旋莖環(huán)構(gòu)成，屬于布羅莫結(jié)構(gòu)蛋白BET家族成員。BRD4通過(guò)布羅莫結(jié)構(gòu)域與核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的RelA亞基結(jié)合，共同刺激NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，對(duì)感染的免疫反應(yīng)有重要作用[12]。既往文獻(xiàn)認(rèn)為，BRD4高表達(dá)可抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵犯脈管形成癌栓，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，使疾病進(jìn)展更快[13]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者的BRD4蛋白高表達(dá)率明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），且BRD4高表達(dá)患者的預(yù)后更差，與既往報(bào)道結(jié)果相一致。表明BRD4表達(dá)與NSCLC患者的預(yù)后密切相關(guān)，可作為評(píng)估患者預(yù)后的有效指標(biāo)及新的治療靶點(diǎn)。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度為低中分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、sB7-H4蛋白高表達(dá)、BRD4蛋白高表達(dá)均是NSCLC患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。分析其原因可能為：BRD4能夠上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及微血管密度，并可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡控制程序，而突變型BRD4則會(huì)減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和增殖，增強(qiáng)腫瘤的侵襲行為，因此，BRD4高表達(dá)可能導(dǎo)致高TNM分期及轉(zhuǎn)移[14]。

S100A4蛋白是鈣結(jié)合蛋白家族成員，一方面可激活纖溶酶原，誘導(dǎo)血管生成；另一方面可使腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞間質(zhì)發(fā)生互換，促進(jìn)腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)中，檢測(cè)到了S100A4的存在，其與致癌基因發(fā)揮了協(xié)同促腫瘤作用[15]。同時(shí)，S100A4蛋白在乳腺癌細(xì)胞間質(zhì)中的表達(dá)高于正常乳腺組織[16]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者的S100A4蛋白高表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，且其高表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有力證明了S100A4蛋白與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系，可作為預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)。本研究ROC曲線顯示，sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NSCLC患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值最佳，表明聯(lián)合檢測(cè)可作為預(yù)測(cè)患者死亡的有效手段。

綜上所述，sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白在NSCLC患者中高表達(dá)，且高表達(dá)是影響NSCLC患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，三指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)患者的預(yù)后評(píng)估有重要價(jià)值。