鐘春英， 肖長生， 齊小瓊， 董桃杏

(湖北第二師范學院化學與生命科學學院， 植物抗癌活性物質提純與應用湖北省重點實驗室， 武漢 430205)

微生物污染是食品腐敗變質的主要原因，一方面會造成巨大的經(jīng)濟損失，另一方面，某些微生物產(chǎn)生的毒素會對人體健康產(chǎn)生威脅.為防止微生物的污染，在食品生產(chǎn)加工的過程中，通常會加入防腐劑.目前，我國食品工業(yè)中所用的防腐劑以化學防腐劑為主，如亞硝酸鹽、山梨酸、苯甲酸及其鹽類等.然而，過量使用化學防腐劑存在食物中毒、致癌等安全問題[1]，因此，尋找天然的生物抑菌活性物質取代化學防腐劑引起了廣泛的關注[2-3].

微生物分布范圍廣，代謝產(chǎn)物結構新穎，活性多樣，是天然抑菌活性物質的重要來源[4].目前，被批準可作為食品防腐劑使用的微生物來源的抑菌活性物質有乳酸鏈球菌素(nisin)、乳酸片球菌素(pediocin)和carnocyclin A[5-6]，在我國，真正被廣泛應用的只有乳酸鏈球菌素[7].但乳酸鏈球菌素本身也有缺陷，它在中性和堿性條件下溶解度低且不穩(wěn)定，僅對革蘭氏陽性菌有抑菌活性，對革蘭氏陰性菌、霉菌抑制效果不理想[8-10]，因此，發(fā)掘理化性質好、廣譜的抑菌活性物質以滿足食品工業(yè)防腐的需求成為研究的熱點.

目前，國內外學者就篩選廣譜抑菌活性物質做了大量的研究，并從不同環(huán)境中分離到一些具有廣譜抑菌作用的微生物.如劉一平等[11]從北冰洋海域沉積物中篩選到一株枯草芽孢桿菌，該菌對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌均有一定的抑制作用；Yi等[12]從陜西楊凌當?shù)丶彝プ葬劃{水菜汁中分離到一株能產(chǎn)生細菌素的棒狀乳桿菌XN8，其對具有多重耐藥性的阪崎腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等具有抑制作用；Simmi等[13]從土壤中分離的綠膿桿菌JU-Ch-1對細菌和真菌都表現(xiàn)出抑制活性.然而，目前這些產(chǎn)抑菌活性物質微生物的篩選通常是將樣品稀釋涂平板獲得大量的單菌落，再檢測純化的單菌落對指示菌是否有抑制作用；或者采用雙層平板法，即下層培養(yǎng)基混有指示菌，稀釋的樣品懸液混入上層培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后挑取能對指示菌產(chǎn)生抑菌圈的菌落檢測其抑菌譜[14].這些方法具有工作量大，效率低，難以得到具有廣譜抑菌活性的菌株等缺點.

本實驗以高濃度的土壤菌懸液涂布平板，篩選能產(chǎn)生透明抑菌圈的菌株，利用土壤中微生物種類多、數(shù)量大的特點，快速獲得45株對其他多種雜菌產(chǎn)生抑制作用的菌株，并對其中一株活性優(yōu)良的菌株HS-15進行分類鑒定，探究培養(yǎng)時間對抑菌活性的影響，檢測抑菌活性物質的抑菌譜及理化性質.本研究豐富了產(chǎn)抑菌活性物質微生物的菌種資源庫，為天然食品防腐劑的開發(fā)提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤樣品 采自湖北隨州大洪山人跡稀少的密林，地理坐標為31°31′14″ N，112°57′30″ E，以便獲得新型菌株.

1.1.2 指示菌 金黃色葡萄球菌CCTCC AB91093、枯草芽孢桿菌CCTCC AB90008、蘇云金芽孢桿菌CCTCC AB92004、大腸桿菌CCTCC AB93154、銅綠假單胞菌CCTCC AB2016055、變形桿菌CCTCC AB91103，黑曲霉CCTCC AF91006，黃曲霉CCTCC AF93035，三孢布拉霉菌CCTCC AF96002均購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由本實驗室保存.

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，用于細菌的培養(yǎng)及保存；

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，用于真菌的培養(yǎng)及對真菌抑菌活性的檢測.

1.1.4 試劑 DNA凝膠回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，2×PCR Mastermix、trans2k DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白胨購于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，其它常規(guī)試劑購自國藥集團.

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品的采集 選取有機質豐富的土壤，為避免環(huán)境因素的影響，去掉表面覆蓋物，挖取深度為5～20 cm處微生物豐富的土壤，置于樣品采集袋備用.選取多處采集點，共采集樣品50份.

1.2.2 活性菌株的初篩 取1 g土壤加入99 mL滅菌水制成懸濁液，搖床震蕩30 min充分混勻，靜置10 min，取100 μL上清液涂布平板，28 ℃培養(yǎng)72 h，以土壤中含有的豐富的微生物為指示菌，挑取能拮抗其它微生物生長并產(chǎn)生抑菌圈的菌落，進行三次平板劃線分離，將純化得到的單菌落轉接到新鮮的固體平板上培養(yǎng)后保存?zhèn)溆?

1.2.3 復篩 以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，參照文獻，用牛津杯法對初篩得到的菌株進行復篩[8].將分離出的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，10 000 r · min-1離心10 min，用0.22 μm微孔濾膜對上清液進行過濾，得到無細胞發(fā)酵液.將指示菌稀釋為107CFU · mL-1，取100 μL該指示菌液均勻涂布在平板上，再將滅菌的牛津杯置于平板，加入200 μL待測無細胞發(fā)酵液于牛津杯，4 ℃靜置擴散5 h，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑.

1.2.4 菌株形態(tài)的鑒定 將菌株接種在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征；挑取少許培養(yǎng)物進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài).

1.2.5 16S rDNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 用細菌基因組試劑盒提取待測菌株的DNA，以其為模板，用細菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)擴增出該DNA片段.PCR 反應體系(25 μL)：27F (10 μmol · L-1) 0.5 μL，1492R (10 μmol · L-1)0.5 μL，DNA 模板 1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，dd H2O 10.5 μL.擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃補平10 min.用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，DNA凝膠回收試劑盒純化目的條帶，純化產(chǎn)物交由上海生工進行測序.

將測序所得的16S rDNA序列在NCBI中的 GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析，根據(jù)比對結果，選取有代表性菌株的16S rDNA序列，利用 Clustal W進行比對，通過MEGA軟件中的NJ(neighbor joining， NJ)法構建系統(tǒng)進化樹.

1.2.6 菌株產(chǎn)抑菌活性物質的發(fā)酵過程 將活化的待測菌株轉接至液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩器，28 ℃、180 r · min-1培養(yǎng)，每隔2 h取一次樣，測菌液波長為600 nm的吸光值，繪制菌株的生長曲線；以金黃色葡萄球菌為指示菌，牛津杯法檢測不同培養(yǎng)時間無菌發(fā)酵液的抑菌活性.

1.2.7 抑菌活性物質的初步鑒定

1) 發(fā)酵液中有機酸堿抑菌作用的排除.測定待測無細胞發(fā)酵液的pH值，與發(fā)酵前培養(yǎng)基的pH作比較，判斷抑菌活性是否由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸或堿引起.

2) 抑菌活性物質分子量的初步確定.取5 mL無細胞發(fā)酵液加入透析袋透析，用PEG進行濃縮，濃縮液中加入PBS調至體積為5 mL，以金黃色葡萄球菌為指示菌，牛津杯法檢測其抑菌活性.

3) 抑菌活性物質的蛋白質酶穩(wěn)定性檢測.分別取15 mg · mL-1的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K 100 μL，加入400 μL無細胞發(fā)酵液中，37 ℃溫育2 h，用無酶處理的無細胞發(fā)酵液為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用牛津杯法測其抑菌活性.

1.2.8 抑菌活性物質對溫度和酸堿的耐受性 將無細胞發(fā)酵液分別置于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃處理30 min，再靜置至室溫，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用牛津杯法檢測處理后發(fā)酵液的抑菌活性.

將無細胞發(fā)酵液的pH值分別調節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，4 ℃處理2 h，再調回初始pH值，以未處理組為對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用牛津杯法檢測處理后發(fā)酵液的抑菌活性.

1.2.9 抑菌譜的檢測 參照文獻，采用點植法檢測篩選的菌株對細菌的抑制作用[15].取107CFU · mL-1的指示菌100 μL，均勻涂布在牛肉膏蛋白胨平板上，用滅菌牙簽蘸取活化的待測菌，點接在涂布有指示菌的平板上，每個平板上點接3次，接種點之間彼此間隔均勻.37 ℃培養(yǎng)24 h至抑菌圈不再增大，觀察并分別測量抑菌圈和點接的待測菌株外緣直徑，用抑菌圈直徑減去點接的待測菌株外緣直徑表示該菌的抑菌圈大小.

參照文獻，用平板對峙法檢測篩選的菌株對真菌的抑制作用[16].用滅菌打孔器挖取直徑6 mm生長旺盛的真菌菌塊，將其放置于PDA平板中央，在距離菌塊2.5 cm處點接活化后的待測菌株，以不接種待測菌株的平板作為對照，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，觀察待測菌株對真菌生長的抑制作用.

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 實驗中每組數(shù)據(jù)均進行3次重復，結果用平均值±標準偏差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行方差分析，以p<0.05為顯著水平.

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

利用高濃度土壤懸液涂平板法，得到45株產(chǎn)明顯抑菌圈的菌株，根據(jù)菌落及菌體形態(tài)特征觀察，初步鑒定其中39株為細菌，6株為放線菌，圖1展示了部分有抑菌活性的菌株.本實驗采用土壤懸液靜置后的上清液直接涂平板法分離菌種，由于土壤懸液中微生物的種類和數(shù)量較多，涂布后土壤中的多種混合菌體會長滿平板，故產(chǎn)生明顯抑菌圈的菌株具有較高的產(chǎn)廣譜抑菌活性物質的潛力.

圖1 有抑菌活性的部分菌株Fig.1 Several strains with inhibitory activity

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，牛津杯法對上述有明顯抑菌圈的菌株進行復篩，其中38株菌的無細胞發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度的抑菌活性，7株菌僅對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，其中編號為HS-15的菌株抑菌效果較好，以其為對象進行后續(xù)的研究.

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株HS-15的形態(tài)特征 菌株HS-15平板劃線長出來的單菌落形態(tài)特征如圖2A所示：圓形、邊緣不規(guī)整，乳白色、質地潤澤、不透明.24 h培養(yǎng)物革蘭氏染色如圖2B所示：菌體為桿狀，以鏈狀排列，呈深紫色，為革蘭氏陽性菌.部分菌體已出現(xiàn)芽孢，芽孢形狀為橢圓形.

圖2 菌落形態(tài)(A)和細胞形態(tài)(B)Fig.2 Morphology of colony (A) and cell morphology (B)

2.2.2 16S rDNA序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析 以菌株HS-15的總DNA為模板，PCR擴增出16S rDNA的片段，長度約為1 400 bp，將測序結果輸入Genebank進行BLAST比對，獲得相關的相似序列， Clustal W對齊后，利用MEGA 7.0軟件計算序列相似性，構建菌株HS-15的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果如圖3所示.由圖可知，HS-15與Bacillusbingmayongensis的親緣關系最近.結合HS-15的菌落和菌體特征及系統(tǒng)發(fā)育分析結果，初步將其鑒定為兵馬俑芽孢桿菌.

圖3 菌株HS -15的16s rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain HS-15

2.3 菌株HS-15產(chǎn)抑菌活性物質的發(fā)酵過程

測定不同培養(yǎng)時間菌株HS-15的A600，以金黃色葡萄球菌為指示劑，牛津杯法檢測不同培養(yǎng)時間HS-15無菌發(fā)酵液的抑菌活性，并測量抑菌圈的大小，菌株HS-15產(chǎn)抑菌活性物質的發(fā)酵過程如圖所示.由圖4可知，菌株HS-15培養(yǎng)4 h進入對數(shù)生長期，菌體快速生長，至14 h進入穩(wěn)定生長期.在對數(shù)生長期，隨著菌體的大量繁殖，產(chǎn)生的抑菌活性物質逐漸增多，菌體生長8 h的無細胞發(fā)酵液可以檢測到對金黃色葡萄球菌的抑菌活性.隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中抑菌活性物質的濃度逐漸增加，培養(yǎng)20 h時菌株HS-15無細胞發(fā)酵液的抑菌活性最強，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為18.2 mm，隨后，抑菌活性在最高水平維持一段時間；28 h之后，抑菌圈的直徑開始減小，推測在此階段，穩(wěn)定生長期的部分菌體細胞裂解，釋放的蛋白酶將部分抑菌活性物質降解，故發(fā)酵液中抑菌物質的量減少，抑菌活性開始降低.

圖4 菌株HS-15的生長及抑菌物質生成曲線Fig.4 Growth curves of HS-15 strain and production of antimicrobial substances

2.4 抑菌活性物質的初步鑒定

菌株HS-15培養(yǎng)20 h后，發(fā)酵液pH為7.0，與發(fā)酵前培養(yǎng)基pH(7.2～7.4)沒有明顯的區(qū)別，故可排除抑菌活性是由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸或堿引起的.

20 h的無細胞發(fā)酵上清液經(jīng)透析袋、蛋白酶處理后，對金黃色葡萄球菌的抑菌活性如表1所示.由表1可知，經(jīng)透析袋處理后，抑菌活性沒有變化，表明抑菌活性物質不能通過透析袋.

表1 不同處理對發(fā)酵液抑菌活性的影響

用木瓜蛋白酶2 h處理后，無細胞發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性有所降低，抑菌圈直徑由17.8 mm降低至12.5 mm，但仍有一定的抑菌活性，表明木瓜蛋白酶能部分降解抑菌活性物質；而胰蛋白酶和蛋白酶K處理后，幾乎沒有抑菌圈形成，表明抑菌活性物質能被胰蛋白酶和蛋白酶K完全降解.

綜合以上實驗結果，將抑菌活性物質初步鑒定為蛋白質類物質.

2.5 抑菌活性物質的穩(wěn)定性

2.5.1 抑菌活性物質對溫度的耐受性 將無細胞發(fā)酵上清液用不同的溫度分別處理30 min，檢測處理后發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結果如圖5所示.低溫處理對活性物質的抑菌活性沒有影響.當溫度超過60 ℃時，隨著溫度的升高，抑菌活性有所下降.當處理溫度為80 ℃時，抑菌圈直徑大小由17.3 mm降為13.5 mm；處理溫度為100 ℃時，抑菌圈降至12.3 mm，仍保持部分抑菌活性，表明菌株HS-15產(chǎn)生的抑菌物質具有一定的熱穩(wěn)定性.

圖5 溫度對活性物質抑菌活性的影響Fig.5 The effect of temperature on antimicrobia activity of the active compound

2.5.2 抑菌活性物質對酸堿的耐受性 將無細胞發(fā)酵上清液的pH值調節(jié)到3.0～11.0的不同值，處理2 h后，再調回起始pH值，測定處理液對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結果如圖6所示.當pH為5～9時，無細胞發(fā)酵液的抑菌活性變化不大；經(jīng)過pH為3.0的偏酸溶液和pH為11.0的偏堿溶液處理，抑菌活性有所下降，抑菌圈直徑由對照樣品的17.6 mm分別降至為11.6 mm、12.5 mm，但仍然有明顯的抑菌活性，表明抑菌活性物質對酸堿有一定的耐受性.

圖6 pH對活性物質抑菌活性的影響Fig.6 The effect of pH on antimicrobia activity of the active compound

2.6 菌株HS-15抑菌活性物質的抑菌譜

采用點植法和平板對峙法分別檢測菌株HS-15對細菌和真菌的抑菌活性，測量HS-15菌落和抑菌圈外緣的直徑，用抑菌圈外緣的直徑減去HS-15菌落外緣的直徑表示HS-15菌落抑菌圈的大小.用抑菌圈的大小指征抑菌活性的強弱，當抑菌圈直徑>9.0 mm時，表示抑菌能力較強[11].結果如表2所示，HS-15對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌，大腸桿菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌等革蘭氏陰性菌，黑曲霉、黃曲霉、三孢布拉霉菌等真菌都有明顯的抑制作用，表明菌株HS-15具有廣譜抑菌活性.其中，對革蘭氏陽性菌和真菌的抑制作用強于革蘭氏陰性菌.

表2 菌株HS-15的抑菌譜

3 討論

芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，因其在生長的后期能形成芽孢，具有抗逆性強，易保藏等特點，且絕大多數(shù)具有良好的安全性，是作為生防菌或微生物生態(tài)制劑的理想菌種[17-18].目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬中的許多菌種，如枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等均能產(chǎn)生抑菌活性物質，且這些抑菌活性物質普遍具有抑菌譜廣、耐酸堿、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點[19-22]，這些都為開發(fā)天然防腐劑提供了良好的條件，具有良好的應用前景.兵馬俑芽孢桿菌是2014年我國福建省農科院劉波團隊首次從秦始皇兵馬俑土壤中分離出來的芽孢桿菌屬新種[23]，而對兵馬俑芽孢桿菌的功能目前還沒有相關報道，本研究首次發(fā)現(xiàn)兵馬俑芽孢桿菌能產(chǎn)生抑菌活性物質，豐富了抗菌微生物資源庫，有望發(fā)掘新型抑菌活性物質.

本研究從土壤中分離到一株具有抑菌活性的兵馬俑芽孢桿菌HS-15，抑菌譜檢測表明，該菌對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和霉菌都有較強的抑制作用，表明其具有廣譜抑菌活性.經(jīng)透析帶處理，抑菌活性不變，但胰蛋白酶和蛋白酶K處理后，抑菌活性完全喪失，推測抑菌物質可能為蛋白質.HS-15的抑菌物質對胰蛋白酶敏感，有利于其經(jīng)食物進入人體后，被體內的蛋白酶降解，不會給機體帶來危害.同時，本實驗表明，該抑菌物質對木瓜蛋白酶有一定的抗性，可能與不同蛋白酶降解位點不同有關，抑菌物質氨基酸組成的特異性導致其對不同蛋白酶敏感性不同.據(jù)報道，芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌蛋白物質主要分為兩類：一是由核糖體合成途徑合成的具有抗菌活性的蛋白類抑菌物質，具有分子量小、耐熱性好、兩親性等特點，包括具有抗菌活性的大分子蛋白、翻譯后修飾小肽和非修飾小肽三種.另一類是通過非核糖體合成途徑合成的多肽或脂肽，通過多肽合成酶系催化形成肽鍵并延伸肽鏈[24-25].此外，芽孢桿菌抑菌物質還有細胞壁降解酶類、其它抗菌蛋白及揮發(fā)性抗菌活性物質[14].菌株HS-15產(chǎn)生的抑菌物質具體屬于哪一類活性物質還不清楚，后期將對抑菌成分進行分離提純，分析其組成結構、作用機理及使用安全性，為天然防腐劑的開發(fā)應用提供基礎和依據(jù).