郅曉宇，劉 鵬，董 娜，張 野，張紅石*

（1.長春中醫(yī)藥大學，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021）

課題組在腹部推拿治療失眠的機制研究中，發(fā)現(xiàn)了臟腑推拿治療失眠存在腦腸互動現(xiàn)象，且與人體腦腸肽調節(jié)密切相關。因此，本研究通過前期實驗篩選，確定了兩種與睡眠密切相關的腦腸肽SP與GAL，通過Western blot檢測二者在下丘腦及小腸中的蛋白表達，驗證腹部推拿治療失眠存在腦腸互動現(xiàn)象。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物與分組

64只SPF級雄性Wistar大鼠，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供[動物許可證號：SCXK（吉）-2020-0002]，7周齡，體質量（200±20）g左右。大鼠隨機分成空白組、模型組、推拿組、藥物組，每組16只。

1.2 實驗材料

戊巴比妥鈉（Merck公司），PCPA（美國Sigma公司），戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司），碳酸氫鈉（成都市科龍化工試劑廠），阿拉伯膠（天津市光復精細化工研究所），RIPA裂解液（碧云天生物技術公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術公司），PBS磷酸鹽緩沖液（北京中杉金橋生物技術有限公司），人參歸脾丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠）。

1.3 實驗儀器

電泳系統(tǒng)（型號：Mini-ProteanTetra，美國Bio-Red公司），轉膜儀（型號：170-4150，美國Bio-Rad公司），成像分析系統(tǒng)（型號：FluorChemQ，美國Proteinample公司），離心機（ESCO MCR-88-8）。

2 方法

實驗方案經(jīng)長春中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查委員會審核通過（No：2021248），具體方法如下。

2.1 PCPA失眠模型大鼠制作

將加入阿拉伯膠的PCPA粉末研磨至泡沫狀，以氯化鈉溶液和碳酸氫鈉溶液配制成100 mg·mL-1混懸液，備用，于注射前震蕩搖勻。模型組、推拿組以及藥物組采用PCPA腹腔注射制作失眠大鼠模型，大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按大鼠體質量400 mg·mL-1計算PCPA使用量。每日上午8:00－10:00時對大鼠進行腹腔注射，每日1次，連續(xù)注射2 d。以30 mg·mL-1戊巴比妥鈉進行腹腔注射對造模后大鼠進行翻正反射實驗，記錄翻正反射消失時間與睡眠持續(xù)時間，如與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P＜0.05），則證明模型復制成功。

2.2 干預方法

1）空白組：不做任何處理。2）模型組：造模成功后正常飼養(yǎng)。3）推拿組：造模成功后行振腹環(huán)揉治療，將每只大鼠套裝于干凈襪子中，以震動按摩器環(huán)揉腹5 min，并以震動按摩器于腹部振動5 min，每日1次，連續(xù)治療5～10 d。4）藥物組：按照人:大鼠=1:30的比例灌服人參歸脾丸（將藥物劑量按照體質量轉化為毫升數(shù)），連續(xù)5～10 d。

2.3 實驗動物取材

治療5 d后每組處死8只大鼠，治療10 d后處死剩余大鼠。使用異氟烷進行氣麻后進行斷頭處理，在冰盤上剝離下丘腦，并迅速放入液氮中；截取小腸5 cm，于預冷過的生理鹽水中清洗后，立即放入-80 ℃冰箱保存。

2.4 Western blot測定

1）取大鼠下丘腦以及小腸組織，稱重后加入預冷的RIPA 裂解緩沖液研磨。2）4℃ 12 000 r·min-1，離心15 min，提取上清液。3）BCA檢測法測蛋白濃度。4）聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)各目的蛋白從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移PVDF膜。5）5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗后過夜。6）將取出的膜在PBS溶液中洗滌5 min，重復3次，隨后將膜放入封閉的盒子中，加入合適濃度的二抗，室溫孵育1 h。7）將β-actin作為內(nèi)參，化學發(fā)光法顯影，觀察拍照。8）采用Image Pro Plus圖像分析軟件測算出SP、GAL蛋白表達條帶的光密度值，進行蛋白表達水平分析。

2.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間多重比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組翻正反射實驗

見表1。

表1 各組造模后翻正反射消失時間及睡眠持續(xù)時間比較（±s，n = 16）min

表1 各組造模后翻正反射消失時間及睡眠持續(xù)時間比較（±s，n = 16）min

注：與空白組比較，# P＜0.05

組別 翻正消失時間 睡眠持續(xù)時間空白組 5.12±0.39 35.01±0.86模型組 10.18±0.84 # 22.15±0.21 #推拿組 10.18±0.76 # 23.22±0.43#藥物組 10.16±0.69 # 23.92±0.11 #

3.2 各組蛋白水平變化

振腹環(huán)揉法干預后，各組蛋白印跡圖（見圖1）；大鼠下丘腦中GAL的蛋白表達量上升（見表2、圖2），小腸中GAL的蛋白表達量下降（見表3、圖3）；下丘腦、小腸中SP的蛋白表達量上升（見表2、表3、圖2、圖3）。

圖1 各組蛋白印跡圖

圖2 下丘腦中SP、GAL蛋白表達量

圖3 小腸中SP、GAL蛋白表達量

表2 各組下丘腦SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

表2 各組下丘腦SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

注：與模型組第5天比較，# P＜0.05；與模型組第10天比較，△P＜0.05

組別 n SP GAL空白組第5天 16 1.52±0.14# 0.81±0.10 #模型組第5天 16 0.86±0.15 0.44±0.08推拿組第5天 16 1.06±0.24 # 0.58±0.04 #藥物組第5天 16 1.09±0.21 # 0.57±0.10 #空白組第10天 8 1.51±0.21△ 1.06±0.07△模型組第10天 8 1.10±0.20 0.50±0.07推拿組第 10 天 8 1.21±0.15 0.73±0.08 △藥物組第 10 天 8 1.24±0.10 0.71±0.06 △

表3 各組小腸SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

表3 各組小腸SP、GAL蛋白水平變化比較（±s ）pg·mL- 1

注：與模型組第5天比較，# P＜0.05；與模型組第10天比較，△P＜0.05

組別 n SP GAL空白組第5天 16 0.35±0.02# 1.40±0.19 #模型組第5天 16 0.17±0.02 3.86±0.28推拿組第5天 16 0.24±0.01 # 2.33±0.15 #藥物組第5天 16 0.26±0.03 # 2.58±0.23#空白組第10天 8 0.36±0.01 △ 1.44±0.15 △模型組第10天 8 0.27±0.01 3.17±0.27推拿組第10天 8 0.32±0.01 △ 1.69±0.29 △藥物組第10天 8 0.34±0.01 △ 1.72±0.27 △

4 討論

現(xiàn)代神經(jīng)生物學與心理學觀點認為，失眠與大腦的生理功能改變，遺傳因素及情感因素密切相關[1]。隨著神經(jīng)生物學的發(fā)展，很多神經(jīng)肽類物質被發(fā)現(xiàn)參與了睡眠—覺醒調節(jié)[2]，如神經(jīng)肽Y（NPY），SP，膽囊收縮素（CCK）等，它們統(tǒng)稱為腦腸肽。作為既存在于腦中又存在于腸道中的雙重分布肽類[3]，目前已被發(fā)現(xiàn)60余種，大致分為神經(jīng)肽、胃腸肽、胃腸神經(jīng)肽3類[4]。腦腸肽在大腦與胃腸之間起著雙向調節(jié)作用，與睡眠—覺醒的調節(jié)有關[5]，是證明腹部推拿治療失眠存在腦腸互動現(xiàn)象的首選物質。腦腸肽是腦腸軸的橋梁性介質，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)相互作用中起到雙向調節(jié)作用，其整合了腸道和大腦之間的神經(jīng)、激素和免疫信號[6]。因此，微生物—腸道—大腦軸（microbiota-gut-brainaxis，MGBA）的確立[7]，為腹部推拿治療失眠的機制研究開辟了新的研究思路。

SP可以通過神經(jīng)激肽受體發(fā)揮作用，從而改變非快速眼動（NREM）睡眠，因此靶點在其受體的藥物可以被用作睡眠醫(yī)學的新療法[8]。SP是神經(jīng)激肽-1受體（NK-1R）的主要配體，遍布了包括皮層在內(nèi)的整個大腦。NK-1R存在于睡眠活躍的皮質神經(jīng)元上，其活性與慢波睡眠相關[9]。SP在外周主要存在于交感神經(jīng)末梢，其變化水平可以在一定程度上反映中樞的變化[10]。它與胃腸運動密切相關，當胃腸運動受到抑制時，機體會分泌大量的SP來促進胃腸運動[11]。

GAL與睡眠、認知、情感行為等密切相關[12]。其主要存在于延髓腹側表面、孤束核、三叉神經(jīng)尾核等。GAL可與DA、5-HT、NE等腦區(qū)神經(jīng)遞質共存，對神經(jīng)活動具有較強的調節(jié)功能[13]。腹外側視前區(qū)在慢波睡眠的維持和產(chǎn)生中具有重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)存在于腹外側視前區(qū)的甘丙肽能神經(jīng)元通過表達結節(jié)乳頭體核組胺能神經(jīng)元上的GalR1增加慢波睡眠[14]。GAL在消化道中也有分布，對消化道具有調控作用，它可以抑制胃酸的分泌以及抑制進食后的胃部運動，并且對小腸的收縮活動具有抑制作用[15]。

本實驗結果顯示，振腹環(huán)揉法干預后，PCPA失眠大鼠下丘腦及小腸中SP表達量均升高，表明振腹環(huán)揉法提高了兩個部位的SP蛋白活性，促進了SP維持睡眠慢波狀態(tài)的生理作用，促進了胃腸運動。而GAL在下丘腦內(nèi)表達升高，在腸道內(nèi)表達下降，表明腹部推拿對不同部位的GAL表達調控出現(xiàn)了差異性。其可使下丘腦內(nèi)GAL蛋白活性升高，維持睡眠周期內(nèi)腦電波慢波效應，使腸道內(nèi)GAL蛋白活性下降，改善胃腸道的抑制狀態(tài)。振腹環(huán)揉法通過調節(jié)PCPA失眠大鼠SP及GAL的表達，改善失眠大鼠睡眠狀態(tài)及腸道蠕動，這種現(xiàn)象驗證了腹部推拿治療失眠存在腦腸互動現(xiàn)象。