王清華，姚 旭，魏新智，鞠業(yè)濤，閔冬雨

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110033）

鈣激活氯通道（CaCCs）很早就已被人們研究，直到2008年才證明跨膜蛋白16A（transmembrane protein 16A，TMEM16A，也被稱為anoctamin1）是鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)。該通道的特征是：一方面受細(xì)胞膜電壓調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為電流的外向整流特性；另一方面它與細(xì)胞漿的鈣離子濃度相關(guān)，表現(xiàn)為鈣離子濃度依賴性激活。TMEM16A通道受鈣離子結(jié)合位點(diǎn)變構(gòu)調(diào)節(jié)來控制通道的開關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在AP動物和細(xì)胞模型中，TMEM16A蛋白表達(dá)上調(diào)；TMEM16A高表達(dá)促進(jìn)胰腺炎的發(fā)生發(fā)展，提示TMEM16A可能成為治療AP新靶標(biāo)[1]。

芍藥苷是芍藥的主要藥效成分，具有廣泛的抗炎抗免疫作用[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，芍藥苷對AP模型大鼠具有治療作用。然而芍藥苷治療急性胰腺炎的機(jī)制不清。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可抑制AP時(shí)腺泡細(xì)胞內(nèi)的TMEM16A蛋白，據(jù)此本研究以TMEM16A為切入點(diǎn)，研究芍藥苷抑制TMEM16A治療AP的可能作用機(jī)制，為芍藥苷治療AP提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J購于美國ATCC公司。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷（北京索萊寶科技有限公司，批號為SP8030）；雨蛙肽（美國Sigma公司，批號為C9026）；大鼠TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為 E-ELR2856c和 E-EL-R0015c）；TMEM16A抗體（美國abcom公司，批號為ab191040）；山羊抗兔二抗（美國abcom公司，批號為ab205718）； Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司，批號為11668-019）；CCK8細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號為CA1210）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Gibco公司，批號為10270-106）、RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號為12633012）；RIPA裂解液（強(qiáng)）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為P0013B）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型） （上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為P0010S）。

1.3 儀器

Axopatch 2008膜片鉗放大器/Digidata1322A/pClamp9（美國AXON公司）；P-2000 微電極拉制儀（美國Sutter公司）；Bio-Rad Mini-Protean 小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國伯樂）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Epoch酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；Bio-rad chemidoc xr+凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠腺泡細(xì)胞AR42J購買于ATCC公司，采用含10% 胎牛血清及1% 的100 nm青鏈霉素的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，3 d換液1次。

2.2 芍藥苷對細(xì)胞活力的影響

將指數(shù)生長的AR42J以1×104個(gè)/孔接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用不同濃度的芍藥苷（0 μmol·L-1、1 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、50 μmol·L-1）分別處理細(xì)胞，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，24 h后，每孔加入10 μL 的CCK8試劑，避光孵育2 h，在490 nm 波長時(shí)測定各孔的吸光度，觀察不同濃度芍藥苷對細(xì)胞活力的影響。

2.3 細(xì)胞分組及給藥

將對數(shù)生長的AR42J細(xì)胞分為對照組、模型組及芍藥苷治療組，芍藥苷預(yù)處理30 min后，模型組和芍藥苷治療組細(xì)胞用雨蛙肽（10-8mol·L-1）作用24 h。取細(xì)胞上清液用于ELISA檢測，細(xì)胞用PBS清洗后，提取細(xì)胞總蛋白用于Western blot 蛋白檢測。

2.4 ELISA檢測

細(xì)胞上清液于4℃，3000 rpm·min-1離心15 min，取上清液，放置在-80℃冰箱保存，用于TNF-α和IL-6的含量檢測。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，最終在450 nm 波長處測定各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞因子的含量。

2.5 Western blot蛋白印記

細(xì)胞總蛋白用RPIA裂解液提取，BCA法進(jìn)行蛋白定量，采用10% SDS凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后在4℃冰箱中進(jìn)行一抗孵育過夜（TMEM16A一抗稀釋比例為1:2 000，p-NFκB為1:1 000）。二抗于室溫孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行成像分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 膜片鉗記錄TMEM16A鈣激活氯電流

將帶有EGFP的TMEM16A質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下定位轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗方法記錄電流，電極電阻為2～4 M?。細(xì)胞電壓鉗制在0 mV，刺激電壓為100 mV～+100 mV，步階電壓20 mV，刺激時(shí)間為700 ms。在1 μmol·L-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子時(shí)記錄不同電壓和不同時(shí)間點(diǎn)電流值。

2.7 分子模擬對接

利用分子對接技術(shù)方法，以TMEM16A為受體，采用 MOE （Molecular Operating Environment）2015.1001 軟件包中的 DOCK 模塊分析芍藥苷分子與TMEM16A通道蛋白間的相互作用，及其作用的空間作用模式。找出芍藥苷與TMEM16A通道蛋白作用可能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芍藥苷對細(xì)胞活力影響

應(yīng)用CCK8對芍藥苷處理的AR42J細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。結(jié)果顯示＜20 μmol·L-1的芍藥苷對細(xì)胞生長明顯沒有影響（P＞0.05），當(dāng)濃度為50 μmol·L-1，出現(xiàn)了細(xì)胞活力下降（P＜0.05），因此將20 μmol·L-1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

3.2 芍藥苷減少AP細(xì)胞炎性水腫，減少上清液中的炎癥細(xì)胞因子生產(chǎn)

AR42J細(xì)胞用芍藥苷預(yù)處理30 min 后，再經(jīng)雨蛙肽10-8mol·L-1作用24 h，鏡下可見，對照組AR42J細(xì)胞呈纖維狀或卵圓形生長，聚集狀增殖，細(xì)胞周圍能合成分泌少量胰酶顆粒，模型組經(jīng)雨蛙肽處理后，細(xì)胞出現(xiàn)顯著變圓，體積增大，亮度增加，細(xì)胞團(tuán)周圍可見大量顆粒狀分泌物的炎癥改變；經(jīng)芍藥苷治療后，與雨蛙肽模型組相比較，細(xì)胞水腫形態(tài)顯著減輕，細(xì)胞周圍分泌顆粒減少，提示芍藥苷能減少AR42J炎性水腫，減少細(xì)胞酶原顆粒的分泌，減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)（見圖1）。對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的炎癥因子檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，雨蛙肽模型組作用24 h后，細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，經(jīng)芍藥苷治療后，TNF-α和IL-6的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 芍藥苷可減少腺泡細(xì)胞炎癥時(shí)TNF- α 和IL-6 生成比較（±s ）

表1 芍藥苷可減少腺泡細(xì)胞炎癥時(shí)TNF- α 和IL-6 生成比較（±s ）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 給藥劑量/μmol·L-1 TNF-α/pg·mL-1 IL-6/pg·mL-1對照組 — 72.23±5.46 79.17±6.81模型組 — 97.65±7.64# 103.25±7.62#芍藥苷治療組 20 88.57±5.49△ 91.64±6.46△

圖1 芍藥苷可減輕腺泡細(xì)胞的炎癥反應(yīng)

3.3 芍藥苷對胰腺炎性腺泡細(xì)胞TMEM16A具有抑制作用

AR42J細(xì)胞用芍藥苷預(yù)處理30 min后，再經(jīng)雨蛙肽10-8mol·L-1作用24 h，檢測細(xì)胞蛋白中TMEM16A蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，雨蛙肽誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞炎癥時(shí)，TMEM16A蛋白表達(dá)明顯升高；經(jīng)芍藥苷治療后，與模型組相比，TMEM16A蛋白表達(dá)明顯下降。提示芍藥苷具有抑制TMEM16A蛋白作用（見圖2）。

圖2 芍藥苷能抑制急性胰腺炎細(xì)胞中TMEM16A蛋白表達(dá)

3.4 芍藥苷通過TMEM16A抑制腺泡細(xì)胞內(nèi)NFκB的活化

過表達(dá)TMEM16A質(zhì)粒用lipofectine 2000轉(zhuǎn)染到AR42J細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，用芍藥苷（20 μmol·L-1）處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot 檢測細(xì)胞內(nèi)NFκB的活化程度。結(jié)果顯示，在AR42J細(xì)胞中過表達(dá)TMEM16A后，NFκB磷酸化程度增加；再經(jīng)芍藥苷處理后，抑制了TMEM16A 促NFκB磷酸化程度（見圖3）。

圖3 芍藥苷通過TMEM16A抑制NFκB磷酸化

3.5 芍藥苷對TMEM16A通道電流的抑制作用

將帶有EGFP的過表達(dá)TMEM16A質(zhì)粒用lipofectine 2000 轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下定位轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行電流記錄。1 μmol·L-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子時(shí)記錄不同電壓和不同時(shí)間點(diǎn)電流值。結(jié)果顯示，100 mV電壓下記錄的不同時(shí)間TMEM16A電流值進(jìn)行均一化處理，Inormalized=It/Imax（It 為不同時(shí)間點(diǎn)的電流值，Imax為記錄最大電流值）。芍藥苷處理后，TMEM16A電流明顯被抑制，抑制率約為55%（見圖4 A）。給藥前不同電壓不同時(shí)間點(diǎn)所記錄的電流圖，與之相比，給芍藥苷（20 μmol·L-1）后再次記錄，在相同電壓的TMEM16A電流值明顯減?。ㄒ妶D4 B）。

圖4 芍藥苷對TMEM16A電流的抑制作用

3.6 芍藥苷分子與TMEM16A蛋白的分子模擬對接

利用 MOE（Molecular Operating Environment）2015.1001 軟件包中的 DOCK 模塊，以 TMEM16A（PDB ID：6BGI）為受體，與芍藥苷進(jìn)行分子模擬對接（見圖5）。結(jié)果顯示，芍藥苷分子能與TMEM16A蛋白通過不同的化學(xué)鍵進(jìn)行緊密結(jié)合。根據(jù)構(gòu)象分析和分子對接模擬技術(shù)，初步篩選出芍藥苷與TMEM16A蛋白結(jié)合的三個(gè)重要氨基酸殘基為Arg373、Leu627和Asp812。

圖5 芍藥苷與TMEM16A分子模擬對接

4 討論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鈣激活氯通道TMEM16A具有廣泛的生理功能，如TMEM16A參與唾液腺、胰腺、呼吸道及腸道上皮細(xì)胞的氯離子分泌，調(diào)節(jié)心肌等興奮性細(xì)胞的動作電位形成和血管平滑肌細(xì)胞的收縮功能[4]等。關(guān)于TMEM16A參與疾病的病理生理功能的研究亦成為研究熱點(diǎn)，TMEM16A異常會導(dǎo)致哮喘、高血壓、胃腸道運(yùn)動障礙和癌癥等多種疾病[5]。深入研究其病理生理功能，可能成為很多疾病病理機(jī)制研究的重要靶標(biāo)蛋白，也可能成為治療疾病的潛在靶標(biāo)分子。

在炎性疾病中研究發(fā)現(xiàn)，TMEM16A作為陰離子通道，參與了很多炎癥的發(fā)病過程：1）中慢性鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）患者中TMEM16A通過EGF-PI3K-TMEM16A信號通路上調(diào)MUC5AC表達(dá)參與該病的病變進(jìn)展[6]；2）在心肌細(xì)胞中特異性抑制TMEM16A可抑制NLRP3炎性小體炎癥信號的激活，從而保護(hù)小鼠心肌缺血再灌注損傷[7]；3）哮喘及其他過敏性炎癥中，TMEM16A可導(dǎo)致黏液高分泌和支氣管收縮，特異性抑制TMEM16A減少粘液的產(chǎn)生和分泌，以及支氣管收縮，同時(shí)可減輕炎癥介質(zhì)的釋放[8]。AP是常見的胰腺病變，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TMEM16A參與了急性胰腺炎的病理進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)腺泡細(xì)胞中TMEM16A在嘌呤能刺激下，從胞質(zhì)重新定位到腔膜，產(chǎn)生分泌電位[9]；其過程受到鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)，參與胰腺管腔內(nèi)酸性化，此過程可能參與急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展[10]。

芍藥苷具有廣泛的抗炎抗免疫作用，通過多種機(jī)制參與炎癥的發(fā)生發(fā)展：如芍藥苷通過抑制NLRP3炎癥小體激活，改善LPS誘導(dǎo)的炎癥和神經(jīng)性疼痛[11]；芍藥苷可部分通過腸道微生物群—上皮細(xì)胞自噬軸來緩解結(jié)腸炎[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷能夠抑制急性胰腺炎腺泡細(xì)胞上TMEM16A通道蛋白，抑制NFκB磷酸化程度，減少炎癥因子的生產(chǎn)作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)芍藥苷可抑制TMEM16A鈣激活氯電流作用，通過分子模擬對接方式發(fā)現(xiàn)芍藥苷與TMEM16A蛋白具有直接結(jié)合位點(diǎn)，其中TMEM16A蛋白的Arg373，Leu627和Asp812是其結(jié)合的三個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基。下一步將通過位點(diǎn)定向突變方法，對關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)一步研究。