周保丹，李 君，高 飛，喬卿均，董 輝

1.河南省南陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河南南陽 473000；2.南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南南陽 473000

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。目前，膠質(zhì)瘤的病因并不十分明確，但可能與遺傳因素、環(huán)境因素、電離輻射、病毒感染等有關(guān)[1]。膠質(zhì)瘤約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤的80%，基本上無法治愈[2-3]。膠質(zhì)瘤有很強的侵襲性和破壞性，復(fù)發(fā)率高，治療方法有限[4]。膠質(zhì)瘤患者的治療模式包括手術(shù)后聯(lián)合放療和化療，盡管給予了積極治療，但生存率還是很低，嚴(yán)重威脅了患者的生命[5]。蛋白酶抑制劑可以抑制蛋白酶的活性，目前主要用于治療艾滋病，它可以與病毒蛋白酶催化基因結(jié)合抑制酶活性，從而導(dǎo)致蛋白前體不能裂解及形成成熟病毒。蛋白酶抑制劑也可以治療惡性腫瘤，它可以阻斷癌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶分解蛋白的功效，讓癌細(xì)胞內(nèi)的蛋白不斷積累，最后會引起惡性細(xì)胞死亡，尤其對于多發(fā)性骨髓瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤效果較好。BNS-345541和MG-132是兩種不同的蛋白酶抑制劑，本研究主要探討蛋白酶抑制劑BMS-345541和MG-132對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及活力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞15株(SHG-44，中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞生物研究所提供，批號：20190509)，將15株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分成3組，分別為對照組、BMS-345541組和MG-132組，每組5株。

1.2儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱(Bio-Rad公司，型號：BPN-150CH(UV)；顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠，型號：LJ-TS01)；Trizol試劑(美國Thermo公司，批號：20180421)；BMS-345541抑制劑(美國SD公司，批號：SH30022)；MG-132抑制劑(美國SD公司，批號：SH30256)；胎牛血清(Gibco公司)。

1.3方法

1.3.1SHG-44細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將SHG-44細(xì)胞放入培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中加入胎牛血清、青霉素和鏈霉素，最后將培養(yǎng)液放置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中。將對照組細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；BMS-345541組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入BMS-345541進(jìn)行傳代培養(yǎng)；MG-132組在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MG-132進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2測量細(xì)胞數(shù)量 取一定量的細(xì)胞懸浮液，將蓋玻片安放在計數(shù)室上面，搖勻細(xì)胞懸浮液，轉(zhuǎn)至高倍鏡后，適當(dāng)調(diào)節(jié)光度，使細(xì)胞和計數(shù)室線條均清晰，然后將計數(shù)室一角的中格移至視野中，通常以計5個中格的細(xì)胞值來代表計數(shù)室中的細(xì)胞數(shù)量。計數(shù)時為了避免重復(fù)或遺漏，分布在各線上的細(xì)胞，一律以接觸方格底線和右側(cè)線上的細(xì)胞作為本格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。

1.3.3MTT比色法檢測各組細(xì)胞活力 吸取各組SHG-44細(xì)胞懸液(對數(shù)生長期，每孔1×105細(xì)胞)分別加入96孔板，BMS-345541組加入蛋白酶抑制劑BMS-345541，MG-132組加入蛋白酶抑制劑MG-132，然后每孔加入10 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，加入二甲基亞砜(DMSO)充分振蕩，溶解生成結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處的吸光度值(A值)，最后計算SHG-44細(xì)胞的活力。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色法，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，再重懸成單細(xì)胞懸液，加入Annexin V-FITC、PI試劑及Binding Buffer，輕輕混勻，在室溫下避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5熒光定量PCR法檢測GRP78 mRNA的相對表達(dá)量 將各組加入Trizol試劑提取總RNA,分光光度計檢測GRP78 mRNA水平及純度，A260/A280均在1.8～2.1。最后計算GRP78 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.6蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)水平 取樣品蛋白質(zhì)30 μg用十二烷基磺酸鈉 (SDS)-聚丙烯酰胺 (PAGE) 電泳分離，將蛋白條帶用半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，再用5%的小牛血清清蛋白封閉。最后置于圖像分析系統(tǒng)行掃描及分析，計算蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.13組細(xì)胞數(shù)量比較 對照組、BMS-345541組、MG-132組細(xì)胞數(shù)量分別為(730 000±154)、(257 000±256)、(210 000±333)個，BMS-345541組和MG-132組的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組，且MG-132組的細(xì)胞數(shù)量明顯少于BMS-345541組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.23組細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率比較 BMS-345541組和MG-132組細(xì)胞活力明顯低于對照組，細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，MG-132組的細(xì)胞活力高于BMS-345541組，細(xì)胞凋亡率低于BMS-345541組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率比較

2.33組細(xì)胞GRP78 mRNA表達(dá)比較 對照組、BMS-345541組、MG-132組的細(xì)胞GRP78 mRNA表達(dá)水平分別為(2.21±0.08)%、(15.98±1.58)%、(13.55±1.12)%，BMS-345541組和MG-132組的細(xì)胞GRP78 mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.43組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較 BMS-345541組和MG-132組GRP78、JNK1蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2和圖1。

表2 3組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較

圖1 3組細(xì)胞蛋白質(zhì)電泳圖

3 討 論

膠質(zhì)瘤細(xì)胞由正常細(xì)胞突變而來，并表現(xiàn)為生長失控，形成膠質(zhì)瘤后會引起多種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，主要表現(xiàn)為頭痛、癲癇發(fā)作、噴射狀嘔吐、視物模糊、感覺喪失、乏力、口吐白沫、四肢抽搐等癥狀。膠質(zhì)瘤若沒有得到及時診斷和治療，隨病情進(jìn)一步發(fā)展，可能出現(xiàn)顱內(nèi)壓升高、認(rèn)知功能障礙等并發(fā)癥[6]。蛋白酶體系是一種多價復(fù)合酶，具有催化活性，細(xì)胞依賴蛋白酶體系可清除不利于自身的異常蛋白，腫瘤細(xì)胞亦是如此，蛋白酶抑制劑可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其在乳腺癌和前列腺癌中的作用已得到證實。

蛋白酶抑制劑BMS-345541是一種新型抑制劑，以劑量依賴性方式抑制IKK-2和IKK-1。BMS-345541在高達(dá)100 μmol/L的濃度下不能抑制絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸激酶，且未能阻斷茴香霉素刺激的c-Jun磷酸化和脂多糖(LPS)刺激的THP-1細(xì)胞中MAPKAP K2的激活，以及內(nèi)皮生長因子(EGF)刺激的H292細(xì)胞中STAT3的磷酸化。BMS-345541處理導(dǎo)致SK-MEL-5、A375和Hs 294T細(xì)胞中黑色素瘤細(xì)胞增殖的濃度依賴性抑制[7]。TUNEL染色和核濃縮技術(shù)顯示BMS-345541具有細(xì)胞凋亡作用，此藥物具有作為新型抗腫瘤藥物的潛在價值[8]。本研究結(jié)果顯示，BMS-345541組的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量少于對照組，細(xì)胞活力明顯低于對照組，細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明蛋白酶抑制劑BMS-345541對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制作用，可降低其細(xì)胞活力，這與以往的研究具有相同的結(jié)果。

MG-132是一種可透過細(xì)胞的蛋白酶抑制劑，屬于合成肽醛類抑制劑[9]，能夠抑制不同類型蛋白酶的活性，包括絲氨酸蛋白酶、鈣蛋白酶等。MG-132和其他肽醛類抑制劑可以有效抑制蛋白酶體系多個肽酶的蛋白酶活性，并能抑制鈣蛋白酶的活性。它通過26S復(fù)合物降低哺乳動物細(xì)胞和酵母可滲透菌株中泛素-共軛蛋白的降解，而不影響其ATP酶或肽酶活性。蛋白酶體系是細(xì)胞功能不可分割的一部分。MG-132與其他蛋白酶抑制劑一樣，對細(xì)胞和組織是有毒的，使用濃度過高或治療時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞死亡?？扇〉淖龇ㄊ沁x擇稀釋>1 000倍的最適濃度。最適濃度不僅與細(xì)胞類型有關(guān)，也取決于細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，如細(xì)胞飽和度、血清水平、培養(yǎng)基成分。MG-132可用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的機制研究，它可以通過干擾腫瘤細(xì)胞的周期，阻止其無限增殖，尤其可以選擇惡性程度高的腫瘤細(xì)胞首先發(fā)揮毒性作用。MG-132是一種天然的蛋白酶抑制劑，目前的研究已經(jīng)證明MG-132能夠?qū)Ω伟┘?xì)胞發(fā)揮毒性作用[9]。本研究顯示，MG-132組的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)量少于對照組，細(xì)胞活力明顯低于對照組，細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明蛋白酶抑制劑MG-132對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制作用，可降低其細(xì)胞活力。

綜上所述，蛋白酶抑制劑BMS-345541和MG-132可以誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，可增強患者療效。