羅先富，劉文強，潘孝武，董 錚，劉三雄，劉利成，陽標仁，盛新年，李小湘

（湖南省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所/農(nóng)業(yè)部長江中下游秈稻遺傳育種重點實驗室，長沙 410125）

0 引言

水稻是世界上主要的糧食作物之一，株高是影響水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀。根據(jù)高度不同，一般將水稻分為高稈、半矮稈和矮稈。20世紀50年代，被譽為第一次“綠色革命”的半矮稈基因sd1的成功應用使水稻單產(chǎn)提高了20% ～30%。隨后在水稻單產(chǎn)實現(xiàn)第二次飛躍的三系雜交稻育種中，雜交稻的親本也多采用半矮化材料。當前，株型的改良是提高水稻產(chǎn)量的一條重要途徑，而株高是水稻株型改良的重要因子。此外，目前生產(chǎn)上應用的半矮稈品種基本都攜帶隱性基因sd1，單一基因的廣泛應用存在遺傳多樣性喪失的潛在風險。因此，開展株高基因的定位和克隆，應用分子標記輔助選擇培育適宜高度的水稻品種，具有十分重要的意義。

水稻株高的遺傳主要由微效多基因控制的數(shù)量性狀及主基因控制的質(zhì)量性狀。經(jīng)典遺傳學將控制株高的基因作為一個整體進行研究。林鴻宣等[1]發(fā)現(xiàn)粳稻‘雪禾矮早’攜帶有與sd-1不等位的隱性矮稈基因sd-s(t)。顧銘洪等[2]從‘桂陽矮1號’中發(fā)現(xiàn)了與sd-1不等位的隱性矮稈基因sd-g。隨著分子生物學的發(fā)展，許多研究者利用分子標記鑒定了一系列的控制株高基因，目前已有70多個矮稈和半矮稈基因被定位(www.gramene.org)。羅炬等[3]利用重組自交系群體在水稻6條染色體上定位到控制株高的QTL，其中qPH2和qPH3在不同環(huán)境下均能檢測到，并進一步精細定位qPH3在204 Kb區(qū)間。趙明芳等[4]利用構建的水稻染色體片段代換系群體共定位到3個株高相關QTL，分布在第4和第6染色體上。

近些年，矮稈和半矮稈相關基因相繼被克隆。2002年，3個研究小組分別圖位克隆了半矮稈“綠色革命基因”sd1，該基因編碼由389個氨基酸組成的GA20氧化酶，參與赤霉素的生物合成。SD1突變導致突變體植株內(nèi)源赤霉素含量降低，植株基部節(jié)間變短[5-7]。矮稈基因d1由于堿基缺失突變喪失了編碼GTP結合蛋白功能，從而導致赤霉素信號傳導受阻，水稻發(fā)生矮化[8]。另一個矮稈基因d61的突變導致油菜素內(nèi)酯及其受體的合成受阻，造成水稻矮化[9]。D11編碼BR生物合成過程的一種P450關鍵酶，它的突變導致油菜素內(nèi)酯合成受阻，上部第二節(jié)間不伸長，植株矮化[10]。D27編碼一個由278個氨基酸組成的含鐵蛋白，d27突變體中第4外顯子發(fā)生4 bp缺失，造成株高矮化，分蘗數(shù)增多[11]。DLT編碼一個由617氨基酸組成的植物特有的GRAS家族蛋白，DLT參與BR信號傳導，同時還參與BR合成的反饋抑制。DLT突變導致水稻矮化，分蘗變少[12]。水稻矮稈突變體brd1與OsBR6ox共分離，OsBR6ox編碼BR-6氧化酶。突變體brd1莖稈嚴重矮化，株高10 ～30 cm[13]。SLR1編碼產(chǎn)物是GA信號傳導的中間調(diào)節(jié)因子，屬于GRAS基因超家族，SLR1調(diào)控水稻的分蘗和株高[14]。GID1包含2個外顯子，編碼一條由354氨基酸組成的多肽。gid1突變體株高嚴重矮化、不育[15]。GID2編碼一個SCF E3復合體的一個F-box亞基，介導水稻中GA的信號傳導。gid2突變體嚴重矮化、葉片變寬、不育[16]。

盡管一些株高相關的QTL已被精細定位和克隆，但大部分QTL仍處于精度較低的初定位，所檢測到的QTL大多界定在基因組的一個較大區(qū)間，仍需要進一步驗證和縮小區(qū)間。此外，克隆的大多數(shù)株高基因都是屬于矮稈和半矮稈基因，高稈基因的精細定位和克隆少有報道。剩余雜合體指的是從高代群體中篩選到的在目標區(qū)間表現(xiàn)雜合、其他區(qū)間基本純合的單株。它相當于近等基因系材料配對雜交產(chǎn)生的F1材料，自交后獲得的群體在目標區(qū)間呈現(xiàn)分離、其他區(qū)間保持純合。利用剩余雜合體的特點，本研究從‘Katy’/‘湘743’的高代自交群體中篩選出一個高稈的剩余雜合體RHL1030，以RHL1030自交衍生群體為實驗材料，開展株高QTL定位。

1 材料與方法

1.1 群體構建及標記檢測

群體構建如圖1所示，‘Katy’和‘湘743’雜交后代通過單粒傳到F10代，經(jīng)標記檢測，篩選出一個在第1染色體RM11383-RM1198區(qū)間雜合（約12 Mb）、背景基本純合的剩余雜合體RHL1030。收獲其自交種子，經(jīng)目標區(qū)間標記檢測，從RHL1030自交群體RHL1030P中篩選出雜合區(qū)間分別為RM3411-RM11782、RM6703-RM1198的兩個單株RHL1030P-13和RHL1030P-58，所覆蓋的物理圖譜位置分別為31.31-34.17 Mb 和 34.51-37.6 Mb(www.gramene.org)，收獲其自交種子種植，獲得2個F2群體RHL1030P-13P和RHL1030P-58P。經(jīng)SSR標記檢測從RHL1030P-58P群體中篩選4個單株2-5，10-7，13-1和5-4。自交這4個單株，獲得4個對應的F2群體XK2-5、XK10-7、XK13-1和XK5-4。經(jīng)標記檢測，分別從每個群體中篩選母本純合型、父本純合型及雜合型材料各40株。

圖1 群體構建示意圖

本研究應用的標記均為SSR標記，采用盧等[17]的方法提取DNA，PCR擴增產(chǎn)物用6%的非變性聚丙烯酰胺檢測。

1.2 性狀考察

2019年夏在湖南農(nóng)科院水稻研究所長沙實驗基地種植132個單株組成的RHL1030P群體。2019—2020年在海南三亞基地種植RHL1030P-13P群體和RHL1030P-58P群體，分別包含191和151個單株。2020年夏在湖南農(nóng)科院水稻研究所長沙實驗基地種植XK2-5群體192株、XK10-7群體154株、XK13-1群體192株和XK4-3群體192株。株行距20×20 cm，正常田間管理。成熟后，記載群體株高。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用MAPMAKER(EXP3.0b)[18]作圖軟件，構建RHL1030P、RHL1030P-13P和RHL1030P-58P群體的區(qū)域連鎖圖譜，用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化成遺傳距離(cM)。應用 Windows QTL Cartographer 2.5[19]檢測RHL1030P、RHL1030P-13P和RHL1030P-58P群體株高QTL。用SPSS對株高性狀進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 株高QTL定位

應用RHL1030P群體分離區(qū)間的7個SSR標記（RM11383、RM3411、RM297、RM212、RM6703、RM5389和RM1198）進行連鎖分析，構建了第1染色體目標區(qū)間的連鎖圖譜，跨越25.1 cM。該群體QTL分析顯示，檢測到一個株高QTL，LOD值8.8，貢獻率55.56%（圖2）。表現(xiàn)加性效應為主，增效等位基因來自于父本‘湘743’。

圖2 利用RHL1030P群體（上）和RHL1030P-58P群體（下）進行株高QTL分析

為了進一步驗證和分解目標區(qū)間，增加在‘Katy’和‘湘743’間呈現(xiàn)多態(tài)性的SSR標記RM11782。利用該標記從RHL1030P群體中篩選雜合區(qū)間分別為RM3411-RM11782和RM6703-RM1198的兩個單株RHL1030P-13和RHL1030P-58，進一步自交發(fā)展了兩個對應分離群體RHL1030P-13P和RHL1030P-58P。應用這兩個群體分別進行株高QTL分析。結果顯示RHL1030P-13P群體沒有檢測到有顯著差異的QTL。RHL1030P-58P群體檢測到一個顯著差異的QTL，LOD值33.8，貢獻率46.1%，增效等位基因來自于‘湘743’（圖2）。

2.2 以染色體片段代換系效應差異為基礎的QTL定位

為了進一步分解RM6703-RM1198區(qū)間，篩選并添加了一個多態(tài)性SSR標記RM8085，利用該標記從RHL1030P-58P群體中篩選到RM6703-RM8085區(qū)間雜合的3個單株2-5、10-7、13-1及RM5389-RM1198區(qū)間雜合的單株5-4。從這4個單株自交一代的群體中分別篩選分離區(qū)間為母本純合型、父本純合型及雜合型的單株各40株，組成4套3種不同基因型材料。通過對每一套不同基因型材料表型性狀進行顯著性分析，判斷雜合區(qū)間是否存在顯著QTL效應。

方差分析結果表明，雜合區(qū)間RM6703-RM8085分離的3個群體（XK2-5、XK10-7、XK13-1）的3種不同基因型間存在顯著性差異，表明該區(qū)間存在控制株高QTL。3個群體 XK2-5、XK10-7、XK13-1檢測到的QTL增效等位基因均來自于父本‘湘743’，且以加性效應為主，貢獻率分別為63.1%、69.2%和74.1%。雜合區(qū)間RM5398-RM1198分離的XK5-4群體3種不同基因型間沒有顯著性差異。結果表明株高QTL位于RM6703-RM8085區(qū)間分離的群體。

表1 2個區(qū)間在同質(zhì)遺傳背景下對株高性狀的作用

3 討論與結論

QTL分析在水稻重要農(nóng)藝性狀上已經(jīng)有較多報道。但在初級定位群體中，由于遺傳背景復雜，很難將QTL定位到一個精準的區(qū)間。針對初定位QTL區(qū)間，利用分子標記選擇重組染色體片段代換系，在同質(zhì)遺傳背景下分析其性狀表型差異，將目標QTL界定于更狹小的區(qū)間，是復雜性狀QTL精細定位的常用方法。本研究在前期發(fā)現(xiàn)剩余雜合體衍生群體(RHL1030P)有株高分離的情況下進行株高QTL分析，結果在RM11383-RM1198區(qū)間鑒定到一個控制株高QTL。進而從該群體篩選不同重組單株進一步發(fā)展群體，在RM6703-RM1198區(qū)間依然能夠檢測到該QTL，加性效應與初定位結果一致，且進一步縮小了目標區(qū)間。同理，在RM6703-RM1198區(qū)間分離群體中篩選不同重組單株自交，通過方差分析將控制株高QTL界定在RM11782-RM5389區(qū)間。通過gramene網(wǎng)站查詢發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)間并沒有控制株高基因的報道，表明本研究定位的株高相關QTL是一個新位點。

QTL定位的精細程度部分取決于多態(tài)性標記的數(shù)量。本研究證實RM6703-RM8085(34.51M ～34.86 Mb)區(qū)間分離群體包含株高QTL。由于考慮到標記兩側的重組區(qū)域，目標QTL實際界定于RM11782-RM5389區(qū)間，覆蓋的物理圖譜位置為34.17M ～35.73Mb。相較于RM6703-RM8085(34.51M ～34.86 Mb)區(qū)分離區(qū)間，株高QTL區(qū)間仍然較大。筆者篩選了RM8085-RM5389區(qū)間所有的SSR標記和In/Del標記，擬開展更精細的定位，遺憾的是沒有篩選到多態(tài)性標記。下一步擬開發(fā)其他標記如Caps標記等進一步更精細定位株高QTL。

QTL定位受環(huán)境影響很大，相同的群體在不同的環(huán)境可能檢測到不同QTL。本研究初定位群體RHL1030P種植在長沙，驗證群體RHL1030P-58P群體種植在海南，均能檢測到目標株高QTL，且貢獻率較高，表明該QTL是一個穩(wěn)定表達的主效位點。此外，在篩選剩余雜合體時，是從自交F10代開始，理論上基因組背景絕大部分純合。因此，沒有考慮目標區(qū)間外的基因組背景。XK2-5、XK10-7、XK13-1群體是在前期F10基礎上繼續(xù)自交兩代后形成，但這3個群體在株高上仍表現(xiàn)明顯的差異。這些結果表明盡管剩余雜合體是高代自交系，但遺傳背景可能仍然存在分離。值得一提的是在XK2-5、XK10-7、XK13-1群體中，除了株高分離外，抽穗期也明顯發(fā)生了分離，表明該雜合區(qū)間存在控制抽穗期相關基因。前期有報道Ghd7控制株高的同時也影響抽穗期[20]，本研究定位的株高QTL是有兩個控制不同性狀的基因連鎖亦或是一因多效還需對區(qū)間進一步分解。

本研究利用剩余雜合體自交衍生的群體定位到一個新的控制株高QTL，表明從高代群體中挑選剩余雜合體進行QTL精細定位是可行的。另一方面，鑒定的株高QTL為改良水稻株型提供更多選擇。