蘇夢緣，伍新葉，朱 曦，王茜瑛，邵 嫄，李克克，梁運祥，李英俊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，武漢 430070；2.河南金百合生物科技股份有限公司，河南 安陽 455000）

微生態(tài)制劑能夠調(diào)節(jié)和維持微生物生態(tài)平衡，在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到較為普遍的應用，可以改善環(huán)境、促進動物生長、改善畜禽水產(chǎn)品品質(zhì)、提高飼料利用率，從而實現(xiàn)預防疾病、綠色健康養(yǎng)殖?；罹鷶?shù)為微生態(tài)制劑質(zhì)量與安全性的重要考察指標，能夠直觀地展示微生態(tài)制劑質(zhì)量，較高的活菌數(shù)可以一定程度反應微生態(tài)制劑的有效活性和保存的穩(wěn)定性。微生態(tài)制劑活菌數(shù)的技術方法復雜多樣，對各種計數(shù)方法進行系統(tǒng)了解和對微生態(tài)制劑生產(chǎn)和應用進行分析均具有重要意義［1］。對平板培養(yǎng)法、直接染色觀察法、流式細胞術檢測法、MTT 計數(shù)法、MPN-PCR 檢測法、實時熒光定量法、ATP 生物發(fā)光法、Bactec 9120 血培養(yǎng)儀法、高通量生長曲線法、濾膜法（濃縮法）、顏色改變單位法（CCU）、LAMP 環(huán)介導等溫擴增法等12 種活菌計數(shù)法進行了系統(tǒng)介紹和優(yōu)缺點分析與總結(jié)，為相關研究和應用提供參考。

1 常見活菌計數(shù)方法及其原理

1.1 平板培養(yǎng)法

平板培養(yǎng)法包括稀釋涂布平板法和稀釋倒平板法，兩者的區(qū)別在于，前者是將稀釋過后的待測樣品涂布于培養(yǎng)基上，后者是將稀釋后的待測樣品與培養(yǎng)基混勻后進行倒板。該方法計數(shù)準確性高，常作為其他計數(shù)方法的參照，在各個領域廣泛應用，同時也在不斷被優(yōu)化和改良。例如，Takano 等［2］在強酸條件下使用瓊脂平板和結(jié)冷膠平板培養(yǎng)嗜酸性細菌，評估了兩種平板在酸性條件下細菌培養(yǎng)時間和菌落分離平板培養(yǎng)方法的極限范圍。平板培養(yǎng)法也存在一定局限性，比如對厭氧微生物進行計數(shù)就需要將平板置于嚴格的厭氧培養(yǎng)環(huán)境；同時，平板培養(yǎng)法依賴于微生物的生長，需要較長的培養(yǎng)時間，難以實現(xiàn)快速檢測。

1.2 直接染色觀察法

直接染色觀察法是通過細胞膜的完整性以及細胞代謝活性等來區(qū)分活菌和死菌。其原理為活菌細胞膜完整且代謝正常，不易與染料結(jié)合，呈現(xiàn)出無色；死菌細胞膜不完整且無代謝活性，易與染料結(jié)合，從而顯出顏色。細胞經(jīng)染色后，利用顯微鏡觀察計數(shù)，便可區(qū)分活菌和死菌。常用的染料有錐蟲藍、臺盼藍、剛果紅、亞甲藍（美藍）等。其中，亞甲藍由于沒有毒性而被廣泛應用。亞甲藍在氧化狀態(tài)時呈現(xiàn)出藍色，還原態(tài)時呈無色。在進行活體染色時，亞甲藍染料可與活細胞代謝物中H+結(jié)合從而被還原，呈無色；死細胞因不進行代謝活動，脫氫酶失去活性，亞甲藍不能被還原，因此死細胞被染色且呈藍色或淡藍色。美藍染色法也存在一些不足，①細胞染色若較淺，會使判斷準確度降低。②染色時間或計數(shù)時間的長短會影響觀察染色效果，對結(jié)果的準確性造成影響。③細胞形態(tài)的異常會對檢測結(jié)果造成影響。

直接染色觀察法操作簡單，成本低，但需要使用顯微鏡觀察，計數(shù)工作量大、耗時長，對操作者有一定的技術要求，檢測準確度不穩(wěn)定，不適合大規(guī)模檢測應用［3］。

1.3 流式細胞術檢測法

流式細胞術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）屬于定量分析技術，核心儀器為流式細胞儀，可以同時對單個細胞的多項參數(shù)進行定量或定性分析。

利用FCM 對活菌進行計數(shù)的原理是，用特異性熒光信號對細胞進行標記，用流式細胞儀測定標記細胞，統(tǒng)計活菌個數(shù)。傳統(tǒng)的基于熒光信號的流式細胞術也存在局限，其檢測的目標參數(shù)較為單一，數(shù)據(jù)處理過程較為復雜。在進行多次技術改進后，已開發(fā)出了更多適用于細胞計數(shù)的流式細胞術，如定量流式細胞術、多色流式細胞術、磷酸化流式細胞術、流式微球分析技術、質(zhì)譜流式細胞術、成像流式細胞術和體內(nèi)流式細胞術等［4］。

該檢測法的優(yōu)點在于檢測參數(shù)多，無需細胞培養(yǎng)過程，檢測速度快，最高可達每秒上萬個細胞，檢測結(jié)果精度高，準確性好等；缺點在于檢測儀器昂貴，檢測費用高，不同待檢菌株在靈敏度上存在差異，對于復雜樣品，需要進行預處理才能用于檢測。

FCM 在醫(yī)學診斷中具有較大的開發(fā)價值，可用于檢驗白血病患者的外周血白血病細胞［5］、研究外周血淋巴細胞DNA 受到鉛損傷的情況等［6］。

1.4 MTT 計數(shù)法

MTT 是一種噻唑鹽，化學名為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽。MTT 計數(shù)法是Mosmann［7］提出的。MTT 水溶液為黃綠色，容易穿過細胞膜，與活細胞線粒體中的琥鉑酸脫氫酶進行反應，被還原成藍紫色不溶于水的甲瓚［8］。死細胞沒有代謝，脫氫酶無活性，沒有還原反應，MTT 顏色不發(fā)生變化。測定溶液的吸光度（OD555nm）或利用有機溶劑如二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚再測定吸光度，則可測出活細胞數(shù)［9］。

MTT 法有快速、準確、工作量小、能區(qū)分活死細胞等優(yōu)點，使用范圍較廣，多用于動物細胞活菌計數(shù)、細胞毒理試驗、微生物活菌計數(shù)等。但當活菌數(shù)較低或較高時，MTT 的反應產(chǎn)物會過低或過高，導致所測吸光度超出檢測范圍。因此MTT 檢測法不適用于濃度太低或太高的細菌液［10］。

1.5 MPN-PCR 檢測法

MPN-PCR 檢測法又稱最大可能數(shù)法，與稀釋平板檢測法有一定的聯(lián)系，但卻是間接與泊松分布相關的一種計數(shù)方法［11］。該方法一般是將待測樣品進行10 倍梯度稀釋，每個梯度設3 個平行，在適當條件培養(yǎng)后使用PCR 擴增計數(shù)進行測定。若樣品中含有目標菌，則依據(jù)觀察到的PCR 陽性管數(shù)，檢索MPN 表，得出樣品中目標菌的MPN 值，得出待測菌的數(shù)量，也叫九管法［12］。

1915 年Mc Crady 利用MPN 最大可能數(shù)法估算細菌濃度［13］。該方法適用于測定在混雜的微生物群中雖不占優(yōu)勢，卻具有特殊功能的類群。例如檢測特殊的土壤微生物群、牛奶或食品中特殊微生物類群（如大腸桿菌）數(shù)量，還可進行污水檢測［14］。

1.6 實時熒光定量法

實時熒光定量法（Quantitative real-time PCR）的原理是基于標準PCR 技術，在擴增反應中加入熒光基團，使用能夠進行熱循環(huán)和熒光信號篩查的儀器，在每次循環(huán)后，對熒光信號進行檢測，進而得到靶核酸的含量，熒光信號和擴增片段的數(shù)量成正比。該種方法具有特異性高、靈敏度高、檢測周期短、能夠檢測活的但不可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)下的細胞、自動化程度高等優(yōu)點。缺點在于無法對死菌和活菌DNA 進行區(qū)分。

在檢測嗜肺軍團菌時，由于該菌能夠“隱藏”于變形蟲體內(nèi)，且生長速度緩慢，不適合使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)計數(shù)法進行計數(shù)，因此qPCR 檢測技術被認為是一種嗜肺軍團菌潛在風險量化方法［15，16］。此外，qPCR 技術還被用來度量不同紫外光照射后DNA 的損傷程度［17］。

疊氮溴化丙錠（PMA）是一種光敏性DNA 結(jié)合染料，自身熒光弱，具有高親和力，在結(jié)合核酸后，熒光信號會大幅度增強。在進行DNA 提取前，將待測樣品與PMA 混勻，PMA 會有選擇性地與膜損傷細胞中的雙鏈DNA 作用，嵌入其中。在464 nm 的可見光的作用下，PMA 分子中的疊氮基團分解，產(chǎn)生具有高活性的氮烯類化合物，和DNA 分子共價交聯(lián)產(chǎn)生沉淀，抑制qPCR 過程中膜損傷細胞DNA 的擴增。溶液中殘留的過量染料與水分子可在光照的條件下產(chǎn)生反應，生成羥胺化合物，使過量染料失去交聯(lián)活性，對后繼活細胞DNA 的擴增不存在影響。

PMA 的選擇滲透性和qPCR 的特異性相結(jié)合，能夠大幅度提高檢測速度和靈敏性［18］。龐貝妮等［19］依據(jù)PMA/EMA-qPCR 活菌檢測機理，對試驗的曝光時間和染料濃度等因素進行優(yōu)化，確認EMA-qPCR檢測方法適合作為沙門氏菌活的一種初篩方法。在食品工業(yè)中，PMA/EMA-qPCR 和qPCR 等方法均有較廣泛的應用，在確定最佳PMA 濃度的情況下，用PMA-qPCR 檢測保加利亞乳桿菌sp1.1［20］、乳品中酵母菌［21］、牛奶中的蠟樣芽孢桿菌［22］等，EMA-qPCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌［23］、丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種［24］、水樣中彎曲桿菌［25］等，能夠更好地對活細胞進行區(qū)分和計數(shù)。

影響PMA-qPCR 檢測效率的因素有微生物細胞膜結(jié)構(gòu)差異、微生物待擴基因的選擇、PMA 濃度、暗反應時間和光反應條件。

1.7 ATP 生物發(fā)光法

三磷酸腺苷（ATP）是所有生命活動的能量載體，ATP 的含量在活菌中會保持在一定范圍內(nèi)，若細菌死亡，則ATP 會被胞內(nèi)酶在短時間內(nèi)快速分解，所以可用ATP 的含量反映樣品中的活菌數(shù)。

ATP 生物發(fā)光法的原理是熒光素酶在Mg2+催化下使熒光素與ATP 反應形成熒光素-AMP 復合物，并產(chǎn)生焦磷酸（PPi）。當復合物被O2氧化后，會形成激發(fā)態(tài)復合物，并產(chǎn)生CO2，當激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)化成基態(tài)時會釋放能量而發(fā)光。在一定范圍內(nèi)，發(fā)光強度與ATP 濃度呈線性關系，從而檢測活菌的數(shù)量［26］。

ATP 生物發(fā)光法簡便、快速、重現(xiàn)性好、可檢測出不可培養(yǎng)的微生物，但是要求樣品細菌濃度至少滿足1 000 CFU/mL，需要富集樣品菌落總數(shù)達到有效檢測范圍才能準確檢測，檢測靈敏性有待加強［27-29］。傳統(tǒng)的ATP 生物發(fā)光法測定的是總ATP，對活菌數(shù)檢測會造成誤差，鹽濃度也會影響檢測結(jié)果［30］。將ATP 生物發(fā)光法與免疫磁分離技術（IMS）相結(jié)合，可以濃縮分離樣品對微生物進行特異性識別，提高檢測靈敏性。該方法由Lee 等［31］應用到水中大腸桿菌含量的檢測。Cheng 等［32］研究了生物免疫納米磁微粒（BMNPs）技術與ATP 生物發(fā)光法的結(jié)合，該方法可檢測更多微生物，并降低檢測限。Hammes 等［33］對ATP 生物發(fā)光法進行了優(yōu)化，大幅降低其檢測限（可達0.000 1 nmol/L），并將活菌ATP和胞外ATP 進行了區(qū)分。

1.8 Bactec 9120 血培養(yǎng)儀法

Bactec 9120 血培養(yǎng)系統(tǒng)進行活菌計數(shù)的原理為，微生物細胞在培養(yǎng)瓶中代謝產(chǎn)生的CO2會激活瓶底中的感應物質(zhì)而產(chǎn)生熒光，熒光信號的強度和CO2的生成量成正比，將該熒光信號經(jīng)過一定的計算，就可以對微生物的數(shù)量和生長情況進行判斷。該方法在臨床活菌計數(shù)中具有較大應用價值［34］。

1.9 高通量生長曲線法

高通量生長曲線法是在實時定量PCR 的擴增曲線原理的基礎上，根據(jù)微生物的指數(shù)生長曲線而建立的［35］。該方法在設置特定濁度后，根據(jù)細菌培養(yǎng)到達該濁度的時長進行活菌計數(shù)。使用微孔板進行培養(yǎng)，設置多個平行，對微生物進行高通量實時監(jiān)測，進行活菌計數(shù)。高通量生長曲線法也適用于輔助檢驗消毒劑的殺菌抑菌作用，相比于MTT 比色法，高通量生長曲線法計數(shù)更加準確，并且其線性范圍更寬［36］。該方法無需特別試劑，不會被特殊試劑的缺乏所限制。缺點在于檢測過程較耗費時間，需要測定吸光度。在具備自動化儀器的情況下，操作會簡化，且測量精度和范圍將進一步優(yōu)化［37］。

1.10 濾膜法（濃縮法）

該方法主要是通過微孔薄膜將待測樣品進行過濾富集，再把薄膜在培養(yǎng)基或浸有培養(yǎng)液的支持物表面上培養(yǎng)，通過菌落數(shù)計算樣品含菌數(shù)，適用于測定空氣、水等體積大而含菌低的樣品中的活菌數(shù)。

1.11 顏色改變單位法（CCU）

顏色改變單位法適用于用比濁法無法計數(shù)的微小微生物。以支原體為例，由于培養(yǎng)液完全澄清透明，無法用溶液濁度來進行菌體計數(shù)，所以采用菌體代謝活力的數(shù)據(jù)變化進行菌體計數(shù)。該方法主要步驟是把樣品進行10 倍梯度稀釋，在適宜溫度下培養(yǎng)，把顏色改變的最末一管作為待測樣品的CCU［38］。該計數(shù)方法的結(jié)果會比實際偏低，可以通過減小稀釋梯度來改善，但會加大工作量。該方法在醫(yī)學研究方面廣泛應用［39-41］，有待進一步對各種支原體的計數(shù)梯度進行研究，擴展其適用范圍。

1.12 LAMP 環(huán)介導等溫擴增法

2000 年，Notomi 等［42］報道了環(huán)介導等溫擴增法，該方法需要根據(jù)目的基因設計一對外引物和一對內(nèi)引物，有時也需要2 個環(huán)引物，總共需要4 或6條引物，在Bst DNA 聚合酶的作用下對目的基因進行擴增，環(huán)引物的增加可以提高檢測效率，但容易出現(xiàn)假陽性，可以與其他技術聯(lián)用進行改善。

LAMP 環(huán)介導等溫擴增法與PCR 相比，不需要熱循環(huán)設備，是一種高效、特異性高的計數(shù)方法，應用范圍廣［43-45］，被應用于食品安全檢測［46］、人類疾病監(jiān) 測［47，48］、動 植 物 疾 病 監(jiān) 測［49］等 方 面。傳 統(tǒng) 的LAMP 環(huán)介導等溫擴增無法區(qū)分死菌和活菌，會造成假陽性。該技術與DNA 熒光染料PMA 聯(lián)合使用［50］，也可利用RNA 的不穩(wěn)定性建立實時熒光RTLAMP 檢測方法［51］來區(qū)分死菌和活菌，避免假陽性。該方法有成本低，特異性高等優(yōu)點，在實際中具有較大的應用潛力。

2 12 種檢測方法的比較

12 種活菌檢測方法的比較見表1。

表1 12 種活菌檢測方法的比較

3 討論

活菌數(shù)作為微生態(tài)制劑的重要指標，反映微生態(tài)制劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性。隨著活菌計數(shù)方法和儀器的開發(fā)與優(yōu)化，活菌計數(shù)越來越準確、高效和快速。在活菌計數(shù)中，平板培養(yǎng)法的應用較為廣泛，通常被用做其他計數(shù)方法的參照。但是，平板計數(shù)法耗費時間長，在指導工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的應用中有所限制，而基于核酸檢測的PMA/EMA-qPCR 檢測法、環(huán)介導等溫擴增等方法由于耗時短、操作簡單等優(yōu)點，具有較大的潛力，值得重點關注和研究。