石 喆 任 珊 楊 立 戴文斌

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院病理科，廣西柳州 545001；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院檢驗科，廣西柳州 545001

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在我國，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率位居女性惡性腫瘤的第一位和第六位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。目前乳腺癌的5 年生存率可達(dá)90%，但乳腺癌患者耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等預(yù)后不良的現(xiàn)象仍然十分常見[2]，探討乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點是當(dāng)前研究的重點。研究表明，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染可能在乳腺癌的侵襲中起關(guān)鍵作用[3-4]。Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是最近發(fā)現(xiàn)的模式識別受體家族，是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在宿主防御的第一道防線中發(fā)揮重要作用，但有證據(jù)表明TLR4 激活與癌癥免疫抑制和生長有關(guān)[5]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）已被證實參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及惡性轉(zhuǎn)化，涉及炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制[6]。TLRs 通過誘導(dǎo)NF-κB途徑阻止免疫應(yīng)答的激活或增強炎癥而與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測乳腺浸潤性癌、導(dǎo)管上皮非典型增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）和正常乳腺組織標(biāo)本中HPV16/18E6、TLR4和NF-κB 蛋白的表達(dá)，探討乳腺癌中三者表達(dá)的關(guān)系及其與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院乳腺外科2018 年1 月至2019 年12 月手術(shù)切除浸潤性癌乳腺標(biāo)本50例為癌組、ADH 乳腺標(biāo)本30例為ADH 組、正常乳腺組織30例為正常組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①柳州地區(qū)女性患者；②首次診斷乳腺癌且臨床病理資料完整；③兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師對所有組織病理學(xué)結(jié)果進行審核確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤、懷孕及諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的全身性炎癥性疾??；②有放療、化療、內(nèi)分泌治療及其他生物抗癌治療等抗腫瘤手段治療的既往史或現(xiàn)病史。癌組參照2012 年世界衛(wèi)生組織乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進行病理診斷及分期。組織學(xué)類型：非特殊型34例，特殊型16例（浸潤性小葉癌8例、黏液癌5例、伴髓樣分化癌3例）；組織學(xué)分級：Ⅰ級8例、Ⅱ級29例、Ⅲ級13例；pTNM分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期31例、Ⅲ～Ⅳ期11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。從乳腺纖維腺瘤手術(shù)獲得的30 個瘤旁正常組織標(biāo)本作為正常組，所有正常組均為健康女性，無雌激素治療史、口服避孕藥、宮頸癌和吸煙史。癌組年齡16～80 歲，平均（48.97±11.43）歲。ADH 組年齡21～71 歲，平均（45.83±11.87）歲。正常組年齡21～72 歲，平均（46.86±11.16）歲。三組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有檢測方法均獲得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 所有標(biāo)本用10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)制片，切片厚度4 μm，HE 染色，鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 即用型小鼠單克隆抗體HPV16/18E6（克隆編號C1P5，貨號：GR3225702-14）、TLR4（克隆編號76B357.1，貨號：GR3309592-1）及兔多克隆抗體NF-κB p65（貨號：GR3309481-1）均購于Abcam 公司（Abcam，Cambridge，MA，USA），稀釋濃度均為1∶100。免疫組織化學(xué)染色技術(shù)采用MaxVison法，試劑盒（貨號：Kit-0014）購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。嚴(yán)格按說明書進行操作，用pH 6.0 檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復(fù)。用已知宮頸癌HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 陽性切片做陽性對照，PBS 緩沖液取代一抗做陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

由兩位副高級以上職稱病理醫(yī)師采用雙盲法進行判讀。HPV16/18E6 與NF-κB 蛋白以細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核、TLR4 蛋白以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)呈黃色或棕黃色為陽性染色。TLR4、NF-κB 蛋白染色判讀標(biāo)準(zhǔn)：隨機取400 倍光鏡下5 個視野，每個視野計數(shù)100 個細(xì)胞。①陽性細(xì)胞百分比評分：無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞數(shù)占1%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%～100%為4 分；②著色強弱評分：無著色0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。以兩者的乘積判定結(jié)果，≤3 分為陰性組，＞3 分為陽性組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用Bonferroni 校正；相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)系數(shù)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組HPV16/18E6、TLR4 與NF-κB 蛋白的表達(dá)情況

HPV16/18E6 蛋白棕黃色顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，見圖1；TLR4 蛋白定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，見圖2；NF-κB 蛋白陽性定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，見圖3。三組HPV16/18E6、TLR4 與NF-κB 蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。癌組HPV16/18E6 陽性表達(dá)率高于ADH 組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.017）；癌組TLR4、NF-κB 蛋白陽性表達(dá)率高于ADH 組、正常組，ADH 組陽性表達(dá)率高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.017）。見表1。

表1 三組HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 蛋白陽性表達(dá)率比較[例（%）]

2.2 ADH 組及癌組中HPV16/18E6 與TLR4、NF-κB蛋白的相關(guān)性

ADH 組及癌組中HPV16/18E6 與TLR4、NF-κB蛋白呈正相關(guān)（P <0.01）。見表2。

表2 癌組及ADH 組中HPV16/18E6 與TLR4、NF-κB 蛋白的相關(guān)性（例）

2.3 ADH 組及癌組中TLR4 與NF-κB 蛋白的相關(guān)性

ADH 組及癌組中TLR4 與NF-κB 蛋白呈正相關(guān)（P <0.01）。見表3。

表3 ADH 組及癌組中TLR4 與NF-κB 蛋白的相關(guān)性（例）

2.4 癌組中HPV16/18E6、TLR4 及NF-κB 蛋白陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

HPV16/18E6、TLR4 及NF-κB 蛋白陽性表達(dá)率與組織學(xué)分級、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期有關(guān)（P<0.05），與年齡、組織學(xué)類型無關(guān)（P>0.05）。見表4。

表4 HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 蛋白陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

3 討論

乳腺癌發(fā)病率和死亡率的增加突出了乳腺癌識別與發(fā)展相關(guān)的新致病因素的重要性。研究顯示，病毒感染涉及18%～20%的乳腺癌發(fā)生[7-8]，并證實在乳腺癌組織中有HPV 感染的存在，HPV16、18型是最常見的類型[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，在同一患者中發(fā)生HPV 陽性乳腺癌之前其良性乳腺組織中存在HPV 感染的證據(jù)[11]。HPVE6 和E7 癌蛋白通過結(jié)合和抑制p53 和p110RB 腫瘤抑制基因，破壞細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，在乳腺癌的發(fā)生中有潛在作用[12-13]。但有研究顯示，HPV 感染與乳腺癌的發(fā)生無相關(guān)性[14-15]。本研究結(jié)果顯示，癌組HPV16/18E6 陽性表達(dá)率高于ADH 組和正常組（P <0.017），提示HPV 感染涉及乳腺癌的發(fā)生過程，HPV16/18E6 在乳腺組織中的表達(dá)是檢測活動性感染的可靠標(biāo)志。

持續(xù)性HPV 感染可以由于某些特征（包括產(chǎn)生致癌蛋白）誘導(dǎo)活性氧氮分子產(chǎn)生，促進有絲分裂和產(chǎn)生血管生成因子等引發(fā)慢性炎癥。TLR 作為模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），能夠激活多種病原體相關(guān)分子模式并與其他PRR 家族相互作用發(fā)生一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)。炎癥性免疫反應(yīng)的后果有兩個方面：一方面，它使生物體能夠抵御感染；另一方面，持續(xù)炎癥環(huán)境可以促進腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。逃避免疫腫瘤監(jiān)測是癌癥的一個公認(rèn)特征，在與HPV相關(guān)的腫瘤中，HPV 可導(dǎo)致這種逃逸的發(fā)生[16]。在HPV 感染期間TLRs 過度表達(dá)，誘導(dǎo)NF-κB 途徑阻止免疫應(yīng)答的激活或增強炎癥，啟動HPV16E6/E7 的活性而與惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。TLR4 是唯一能夠激活銜接蛋白髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性和獨立途徑的配體。MyD88 被TLR4激活后，啟動參與促炎、抗病毒和抗菌反應(yīng)的一組特定基因的轉(zhuǎn)錄，促進NF-κB 活化，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17-21]。據(jù)報道[22]，TLR4/NFκB 信號通路的異常刺激涉及許多自身免疫性疾病和慢性炎癥，NF-κB 調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素-1（interleukin，IL-1）、IL-6、細(xì)胞周期蛋白D1、c-MYC 等導(dǎo)致細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、TNF、IL-1 和IL-8 有助于血管生成，從而有利于腫瘤發(fā)生。NF-κB 在腸癌、胰腺導(dǎo)管癌、肝癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞系和患者中觀察到NF-κB 通路中的抑制蛋白激酶ε的擴增和過表達(dá)，進一步強調(diào)了NF-κB 與乳腺癌的關(guān)系[23-24]。本研究結(jié)果顯示，癌組HPV16/18E6 陽性表達(dá)率高于ADH 組和正常組，癌組TLR4、NF-κB 蛋白陽性表達(dá)率高于ADH 組（P <0.017）。癌組及ADH 組中HPV16/18E6 與TLR4、NF-κB 蛋白呈正相關(guān)（P <0.01）；TLR4與NF-κB 蛋白呈正相關(guān)（P<0.01），提示炎癥在HPV16/18E6 陽性乳腺癌誘導(dǎo)中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，HPV16/18E6、TLR4 與NF-κB 蛋白陽性表達(dá)率與組織學(xué)分級、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期有關(guān)（P <0.05）。提示HPV16/18E6、TLR4 與NFκB 蛋白在乳腺癌的發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。

綜上所述，高危型HPV 感染與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，HPV 感染導(dǎo)致TLR4/NF-κB 信號通路的異?？赡芘c乳腺癌患者預(yù)后不良之間有一定的關(guān)聯(lián)，TLR4、NF-κB 可作為新的預(yù)后生物標(biāo)志物應(yīng)用于乳腺癌預(yù)后的評價。將HPV 疫苗、調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB 信號通路以及TLR4 拮抗劑作為乳腺癌的預(yù)防和治療策略，可能在防御癌癥或改善預(yù)后方面具有廣泛應(yīng)用前景。