李迎鶴，劉 東，于 杰，趙平南，張瀟元，蘇俊濤，韓 松*

(1.東北林業(yè)大學 林學院，哈爾濱 150040; 2.中國昆侖工程有限公司吉林分公司，吉林 吉林 132000)

石油工業(yè)在迅猛發(fā)展的同時，其背后也潛藏著一系列不容小覷的環(huán)境污染問題，成為緊隨農藥污染之后的又一大環(huán)境危害，尤以石油污染土壤為甚.據(jù)統(tǒng)計，大慶油田平均作業(yè)一口井，產生的落地原油可達1.0 t，回收利用后有約22%的落地原油會對土壤造成嚴重污染[1].石油污染物進入土壤后會導致土壤pH降低[2]，土壤理化性質遭到嚴重破壞[3]，進而影響作物生長[4]，甚至會富集到動物和人體之上，產生致癌、致畸、致突變的“三致”作用[5].鑒于此，探尋一種經(jīng)濟、高效、無次生污染物的微生物修復技術迫在眉睫.

石油污染土壤的修復技術主要包括物理修復法、化學修復法以及生物修復法，而微生物修復法則在生物修復領域中舉足輕重.與其他手段相比，微生物修復法具有降解率高、成本低、無二次污染產生等優(yōu)點[6].烷烴作為石油的主要組分，占石油含量的50%～95%[7].在烷烴污染物中，短、中鏈烷烴易被降解；而長鏈烷烴通常情況下比較穩(wěn)定，以固態(tài)形式存在，不易被生物降解，因此對土壤污染更為嚴重[8]，正十六烷正是長鏈烷烴中的一大代表性物質，對環(huán)境的持久性危害更強[9]，因此利用微生物修復技術進行降解更為理想.目前從石油污染土壤中篩選出正十六烷降解菌主要有無色桿菌屬(Achromobactersp)[10]、假單胞菌屬(Pseudomonassp)[11]、不動桿菌屬(Acinetobactersp)[12]等.

本文以正十六烷為研究對象，通過調控外界環(huán)境壓力，從大慶石油污染土壤中分離、馴化、篩選出一株以正十六烷為唯一碳源的高效降解菌株.在對菌株進行鑒定的基礎上，研究不同培養(yǎng)條件與正十六烷降解率之間的動態(tài)關系，為石油烴污染土壤的修復提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

大慶油田附近的石油污染土壤.

1.2 主要培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO40.5g，CaCl20.02 g，F(xiàn)e2(SO4)30.02 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

正十六烷無機鹽培養(yǎng)基：1 L無機鹽培養(yǎng)基加入10 mL正十六烷.

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g(固體LB培養(yǎng)基加入瓊脂15 g)，蒸餾水定容至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min.

1.3 正十六烷降解菌的富集、馴化與篩選

稱取5 g土壤樣品加入到50 mL無菌水中，于30 ℃，150 r/min的條件下在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；取充分振蕩后的富集液1 mL，加入到含1 mL正十六烷的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，150 r/min的條件下在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，7 d后從上述培養(yǎng)基中移取1 mL發(fā)酵液，加入到另一含1 mL正十六烷的無機鹽液體培養(yǎng)基中，連續(xù)轉接5次，培養(yǎng)條件同上.

取最后一次轉接的發(fā)酵液，梯度稀釋后涂布于LB平板上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后進行劃線分離，將得到的單菌落接入含1 mL正十六烷的無機鹽培養(yǎng)基中，若出現(xiàn)渾濁，則該菌種為正十六烷降解菌.

1.4 菌株的鑒定

將最后篩選出的菌株進行菌株形態(tài)特征觀察，并將菌株送至測序公司進行16Sr DNA基因測序，將得到的序列信息輸入到NCBI系統(tǒng)，進行Blast同源性比對分析，并利用MEGA7軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 正十六烷的萃取及分析方法

取5 mL正己烷加入到培養(yǎng)7 d的100 mL正十六烷無機鹽液體培養(yǎng)基中，轉移液體至125 mL分液漏斗中，反復振蕩，8 000 r/min離心20 min，吸取上層有機相，重復萃取2次，合并萃取液并加入一定量的無水Na2SO4，待干燥后將萃取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除雜，取0.1 mL萃取液轉移至10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度線，充分搖勻，進行氣相色譜測定.

采用GC7900氣相色譜儀測定降解后正十六烷的殘余量.檢測條件：HP-5MS色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測器，載氣為高純氮氣，氫氣流速為30.0 mL/min，空氣流速為300 mL/min，進樣口和檢測器溫度都設定為280 ℃，進樣量為1.0 μL.色譜柱升溫程序如下：初始柱溫為120 ℃，保持1 min，以15 ℃/min的升溫速率上升至280 ℃，保持1 min.

1.6 不同條件下菌株對C16降解率的影響

以正十六烷為唯一碳源，考察正十六烷體積分數(shù)(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、菌液接種量(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%)、NaCl質量濃度(1 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L)、降解時間(2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d)對正十六烷降解率的影響.

1.7 菌株細胞表面疏水性能的測定

菌株的疏水性能采用細菌黏著碳氫化合物法Bacterial Adhesion To Hydrocarbons(BATH)測定，將菌株在以正十六烷為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，4 000 r/min離心10 min，收集菌體并調節(jié)OD600nm為1.0左右.在10 mL離心管中加入菌懸液6 mL，再加入0.5 mL正十六烷，空白對照組不加正十六烷，在室溫下劇烈振蕩60 s，靜置60 min，待分層后用槍頭快速伸入下層溶液，緩慢吸取溶液3 mL，在600 nm波長處測定吸光度，設置3個平行試驗和1個空白對照組.菌體細胞表面疏水性能(BATH)按照下式計算：

BATH%=(OD600對照組-OD600實驗組)/OD600對照組×100%

1.8 菌株乳化性能的測定

將培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液離心后去除菌體，在10 mL離心管中加入4 mL正十六烷，再加入4 mL離心后去除菌體的上清液，設置3個平行試驗和1個空白對照組，于超聲波儀中超聲10 min，使正十六烷與上清液充分混合，靜置24 h，觀察正十六烷與上清液的分界面和乳化效果.乳化率(E24%)= 乳化層高度/液體總高度×100%.

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

以正十六烷為唯一碳源，從石油污染土壤中篩選出一株正十六烷降解菌，命名為L1，該菌株在LB平板上的形態(tài)如圖1所示.菌落呈圓形，中間凸起，淡黃色，表面光滑，邊緣整齊.

圖1 菌株在LB平板的菌落形態(tài)

將L1菌株的16S rDNA基因序列通過Blast同源性比對，結果表明，該菌株與AcinetobacterhaemolyticusstrainATCC 17906的相似度最高為99.85%，確定該菌株為溶血不動桿菌(Acinetobacterhaemolyticus)，并且他們在基于16S rDNA的菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹中也呈現(xiàn)明顯的親緣關系，如圖2所示.

圖2 利用鄰近法構建的基于16S rDNA 的菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.2 不同反應條件下菌株對正十六烷降解率的影響

2.2.1 正十六烷初始體積分數(shù)對降解率的影響

在OD600nm為1，pH值為7，菌液接種量1%，NaCl質量濃度5 g/L，35 ℃，150 r/min的條件下，降解7d后不同正十六烷體積分數(shù)對降解率的影響如圖3所示.由圖3可知，當正十六烷體積分數(shù)為0.1%(773.4 mg/L)時，降解率最高，7 d后達到了88.0%.隨著正十六烷體積分數(shù)的升高，降解率卻不斷下降，這是因為正十六烷作為唯一碳源，在適宜濃度范圍內能夠促進菌株的生長，并有較高的降解率；當正十六烷體積分數(shù)較高時，則會產生抑制作用，反而會對菌株產生一定的毒害作用[13]，進而影響降解率.當正十六烷體積分數(shù)達到2.0%(15 468 mg/L)時，降解率仍達25.9%，說明在正十六烷體積分數(shù)較高環(huán)境下，菌株仍具備一定的降解能力，可用于高體積分數(shù)正十六烷的降解體系.在后續(xù)試驗中，選擇正十六烷體積分數(shù)為0.5%(3 867 mg/L)作為底物濃度.

圖3 不同正十六烷體積分數(shù)對降解率的影響

2.2.2 初始pH對正十六烷降解率的影響

在OD600nm為1，正十六烷體積分數(shù)0.5%(3 867 mg/L)，菌液接種量1%，NaCl質量濃度5 g/L，35 ℃，150 r/min的條件下，降解7 d后不同pH值對正十六烷降解率的影響如圖4所示.從圖4中可以看出，該菌株具有廣譜性，在5～9的pH范圍內對正十六烷均有一定的降解作用，在pH值為8時，正十六烷降解率最高，為48.8%.在大多數(shù)的石油降解研究中，正十六烷降解菌的最適pH值為中性.崔倩倩等[14]從石油污染土壤中分離出一株瓊氏不動桿菌屬(Acinetobacterjunii)，在pH為7時，對體積分數(shù)為0.1%的正十六烷降解率可達75%.張潔等[15]從油泥中篩選出兩株正十六烷降解菌，其最適降解pH均為7.而本試驗中的菌株更適宜在偏堿性環(huán)境中生長、嗜鹽度高，對于大慶油田等高鹽地區(qū)的石油污染土壤可起到一定修復作用.

圖4 不同pH對正十六烷降解率的影響

2.2.3 菌液接種量對正十六烷降解率的影響

在OD600nm為1，正十六烷體積分數(shù)0.5%(3 867 mg/L)，pH值為8，NaCl質量濃度5 g/L，35 ℃，150 r/min的條件下，降解7 d后不同菌液接種量對正十六烷降解率的影響如圖5所示.

圖5 不同菌液接種量對正十六烷降解率的影響

由圖5可知，隨著菌液接種量的增加，其降解率的變化并不明顯，導致這一現(xiàn)象的原因可能是菌株自身降解能力有限，即一定量的菌株對應降解一定量的正十六烷，當達到菌株降解極限后就不再繼續(xù)降解.后續(xù)實驗中選用降解率相對較高的菌液接種量4%作為最適接種量.

2.2.4 NaCl質量濃度對正十六烷降解率的影響

在OD600nm為1，正十六烷體積分數(shù)0.5%(3 867 mg/L)，pH值為8，菌液接種量4%，35 ℃，150 r/min的條件下，降解7 d后不同NaCl質量濃度對正十六烷降解率的影響如圖6所示.由圖6可知，NaCl質量濃度在1～5 g/L時，正十六烷降解率均在50%以上，NaCl質量濃度為5 g/L時，正十六烷降解率最高，為57.9%.適量的NaCl能夠促進菌株對正十六烷的降解，但當NaCl質量濃度較高時，細胞的滲透壓改變[16]，菌株生長受到抑制，進而影響菌株降解率.當NaCl質量濃度提高到20 g/L時， 正十六烷降解率仍達34.9%， 說明該降解菌對于NaCl具有一定的耐受性， 對于大慶鹽堿地的石油污染土壤的生物修復具有一定促進作用.

圖6 不同NaCl質量濃度對正十六烷降解率的影響

2.2.5 正十六烷降解率和菌株生物量隨時間的變化

在最佳降解條件下，不同培養(yǎng)時間對菌株OD600 nm和正十六烷降解率的影響如圖7所示.由圖7可知，菌株生物量與正十六烷的降解率呈正相關，其中菌株的OD600 nm變化不大，2 d時就有較大的OD值，并以較小的幅度穩(wěn)步上升.正十六烷降解率緩步提升，這與菌株的生長速率有關，12 d后降解率可達62.0%.

圖7 正十六烷降解率和菌株生長量隨時間的變化

2.3 菌株細胞表面疏水性和乳化性的測定

利用細菌黏著碳氫化合物法測定菌株細胞表面的疏水性能，經(jīng)計算細胞表面疏水性為77.2%，結果與菌株細胞表面的疏水性呈正相關[17].疏水性越好證明該菌株對正十六烷的吸附性越好，這有利于菌株在烴類物質上生長，促進菌株對正十六烷的降解，提高正十六烷降解率.

經(jīng)計算該菌株的乳化率(E24%)為33.8%.乳化劑是一類表面活性劑，具有親水基和親油基，乳化劑能夠將難溶于水的正十六烷帶入水中，增大水中的菌株與正十六烷的接觸面積，有利于菌株的生長，進而促進菌株對正十六烷的降解，提高降解率.

3 結 語

采用持續(xù)調控正十六烷作為環(huán)境選擇壓力，從采自大慶石油污染土壤樣品中馴化獲得正十六烷降解菌，經(jīng)菌株形態(tài)特征觀察和16Sr DNA基因測序，鑒定該菌株為溶血不動桿菌(Acinetobacterhaemolyticus).通過單因素試驗得出該菌株的最適降解條件，在pH為8，菌液接種量4%，NaCl質量濃度5 g/L，35 ℃，150 r/min的條件下，12 d后對體積分數(shù)為0.5%(3 867 mg/L)的正十六烷降解率可達62.0%.所獲菌株為嗜鹽性菌株，具有良好的耐鹽堿性，且兼具較為良好的乳化性能和疏水性能，能夠提高正十六烷在水中的溶解度，進一步促進菌株對正十六烷的降解能力，顯著提升降解率；本研究也為高鹽地區(qū)的石油污染土壤修復提供了一定的理論依據(jù).