劉慕妝，任 紅，孫 哲，黃芷珊，鐘先鋒，黃桂東*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；3.廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；4.佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；5.佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231）

黃酒是中國(guó)傳統(tǒng)釀造酒[1]，以稻米、黍米、玉米、小米、小麥等為主要原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成[2]。其含有較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、低聚糖和微量元素等[3]，被譽(yù)為“液體蛋糕”。黃酒營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，但同時(shí)也會(huì)存在一些潛在有害物質(zhì)，生物胺就是其中之一。生物胺是堿性的含氮化合物[4]，在食品尤其是發(fā)酵食品中廣泛存在，它是荷爾蒙、核苷酸、蛋白質(zhì)等生理活性物質(zhì)的前體[5]。適量攝入可以促進(jìn)人體生長(zhǎng)代謝、提高免疫力、控制血壓水平和清除自由基等[6-7]，過量攝入則會(huì)引起人體多種不良反應(yīng)，如皮疹、瘙癢、惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛、頭痛和高血壓等[8]。

黃酒中含有多種生物胺，最為常見的是色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將生物胺分為脂肪胺（腐胺、尸胺、亞精胺、精胺等）、芳香胺（苯乙胺、酪胺等）和雜環(huán)胺（色胺、組胺等）；根據(jù)其組成成分又可以分為兩類：?jiǎn)伟泛投喟贰伟分饕欣野?、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等，多胺主要包括精胺和亞精胺等。

生物胺隨黃酒攝入人體后，可在胺類氧化酶的作用下氧化為醛、羧酸等活性較低的氧化產(chǎn)物[9]，而酒精會(huì)在一定程度上抑制胺類氧化酶的活性[10]，從而增加了生物胺在人體的積累，使得生物胺的潛在危害增加。因此，控制黃酒中生物胺的含量，已成為提高黃酒生物安全性的重要關(guān)注點(diǎn)之一。本文綜述了黃酒生物胺的合成、代謝途徑及含量水平，分析了影響生物胺形成的因素、控制措施，總結(jié)了黃酒生物胺含量的檢測(cè)方法，以期為控制黃酒生物胺含量，規(guī)范生產(chǎn)管理，保障安全生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

1 黃酒中的生物胺合成、代謝途徑及含量水平

1.1 生物胺的合成機(jī)制

氨基酸發(fā)生脫羧反應(yīng)生成相應(yīng)的生物胺，是發(fā)酵食品中生物胺主要的合成途徑，該反應(yīng)需要在微生物分泌的特異性氨基酸脫羧酶的作用下發(fā)生[11-12]。生物胺的合成機(jī)制如圖1所示，游離氨基酸首先通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從微生物細(xì)胞外運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)，然后在特異性氨基酸脫羧酶催化作用下進(jìn)行脫羧反應(yīng)，生成相應(yīng)的生物胺，最后生物胺再次通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送到微生物細(xì)胞外。除需要有前體物質(zhì)氨基酸和含氨基酸脫羧酶的微生物外，生物胺的合成還需要具有適宜微生物生長(zhǎng)以及維持氨基酸脫羧酶活性的環(huán)境條件[13]。

圖1 微生物中生物胺的合成途徑Fig.1 Synthetic pathway of biogenic amines in microorganisms

黃酒生產(chǎn)過程中易形成生物胺，這是由于[14]：①其生產(chǎn)選用蛋白質(zhì)含量豐富的谷物為原料，在黃酒生產(chǎn)過程會(huì)產(chǎn)生一定量氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、精氨酸等），為生物胺的形成提供了前體物質(zhì)；②傳統(tǒng)黃酒生產(chǎn)多采用開放式的半固態(tài)發(fā)酵，多種微生物參與了黃酒發(fā)酵過程，其中含有乳酸菌等生物胺產(chǎn)生菌；③黃酒的發(fā)酵溫度和pH條件適宜微生物的生長(zhǎng)繁殖和維持氨基酸脫羧酶活性（氨基酸脫羧酶的最適溫度及pH：20～37 ℃、4.04～4.33[15]）。

1.2 黃酒生物胺的代謝途徑

黃酒生物胺的代謝途徑如圖2所示，當(dāng)少量生物胺隨黃酒攝入人體后，可在腸道的胺氧化酶（如單胺氧化酶、二胺氧化酶和多胺氧化酶）的作用下被代謝成醛、羧酸等生理活性較低的產(chǎn)物[16]。然而，當(dāng)生物胺含量過高或胺氧化酶活性受到抑制或干擾時(shí)，生物胺無(wú)法被充分代謝，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為對(duì)人類健康造成嚴(yán)重問題的有毒代謝物[16]。研究發(fā)現(xiàn)，易感體質(zhì)、胃腸道疾病以及藥物和酒精的攝入都會(huì)抑制胺氧化酶活性，即使是少量的生物胺也不能有效代謝[17]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)酒精度為12%vol時(shí)，91%的胺類氧化酶活性會(huì)受到抑制[18]，這會(huì)增強(qiáng)人體對(duì)生物胺的易感性。因此，對(duì)于酒類中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)比一般食品更加嚴(yán)格。

圖2 生物胺在腸道中的代謝途徑Fig.2 Metabolism pathway of biogenic amines in intestinal tract

1.3 黃酒中生物胺含量水平

食品中生物胺的毒性已被廣泛研究，普遍認(rèn)為，當(dāng)生物胺含量過高時(shí)會(huì)引起瘙癢、皮疹，引起惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛，引起頭痛、高血壓等癥狀[8]。色胺、苯乙胺會(huì)引起呼吸增加、血壓升高、頭痛等癥狀[19]；酪胺會(huì)擴(kuò)張瞳孔、擴(kuò)張臉板組織、引起流淚和唾液分泌等癥狀[20]；組胺會(huì)引起胃腸反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)惡心、嘔吐、腹瀉和腹部絞痛等癥狀[21-22]；尸胺、腐胺、亞精胺、精胺可與亞硝酸鹽發(fā)生反應(yīng)，形成致癌的亞硝基胺，也可作為食品腐敗的指標(biāo)[23]。據(jù)報(bào)道[24]，單次攝入100 mg的酪胺會(huì)引發(fā)偏頭痛；單次攝入3 mg 的苯乙胺會(huì)引起偏頭痛；單次攝入8～40 mg組胺會(huì)導(dǎo)致輕微中毒，單次攝入40 mg 以上組胺會(huì)引發(fā)中等中毒癥狀，單次攝入超過100 mg組胺則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重中毒，引發(fā)頭暈、昏厥、口腔灼燒感、無(wú)法吞咽和瘙癢等癥狀。

當(dāng)前，國(guó)際上針對(duì)食品生物胺還沒有統(tǒng)一的限量標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)規(guī)定水產(chǎn)品中組胺含量不得超過50 mg/kg[25]；歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100 mg/kg，酪胺含量不得超過100～800 mg/kg[26]；我國(guó)在食品生物胺限量方面的國(guó)標(biāo)GB 2733—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》也僅涉及水產(chǎn)品中的組胺，規(guī)定鮐魚、鲹魚等高組胺魚類中的組胺含量≤400 mg/kg，其他魚類中的組胺含量≤200 mg/kg[27]。國(guó)外和國(guó)內(nèi)對(duì)黃酒中生物胺的限量都還未有明確規(guī)定。一些國(guó)家規(guī)定了葡萄酒中組胺的含量[28]：澳大利亞和瑞士規(guī)定≤10 mg/L，法國(guó)規(guī)定≤8 mg/L，荷蘭規(guī)定≤3.5 mg/L，而德國(guó)更加嚴(yán)格，規(guī)定≤2 mg/L。

表1 不同國(guó)家或地區(qū)生物胺的限量Table 1 Limited quantity of biogenic amines in different countries or regions

目前，已有許多學(xué)者對(duì)黃酒中的生物胺進(jìn)行了分析測(cè)定。張敬等[32]對(duì)我國(guó)市面上32個(gè)葡萄酒樣品、32個(gè)啤酒樣品、12個(gè)黃酒樣品中的生物胺含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，黃酒中總生物胺平均含量達(dá)78.3 mg/L，遠(yuǎn)高于啤酒和葡萄酒中的總生物胺平均值。LU Y M等[33]對(duì)我國(guó)14個(gè)來自不同產(chǎn)區(qū)的黃酒樣品中生物胺含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，樣品中總生物胺的平均含量為107 mg/L。ZHONG J J等[34]對(duì)39個(gè)來自不同廠家的黃酒樣品中生物胺含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，樣品中總生物胺的平均含量可達(dá)115 mg/L，絕大多數(shù)黃酒中的組胺含量低于澳大利亞和瑞士標(biāo)準(zhǔn)（10mg/L），而94.84%的樣品中組胺含量超過德國(guó)設(shè)定的在葡萄酒中的最大推薦限值（2 mg/L）。綜上所述，黃酒中的生物胺含量仍需進(jìn)一步的關(guān)注。

2 影響黃酒中生物胺形成的因素

影響黃酒中生物胺形成的主要因素為微生物、氨基酸種類及含量、pH和溫度、生產(chǎn)工藝、貯藏條件等，如圖3所示。

圖3 影響生物胺形成的因素Fig.3 Influencing factors of biogenic amine formation

2.1 釀造過程中微生物對(duì)黃酒生物胺形成的影響

乳酸菌是黃酒釀造過程中影響生物胺形成的重要因素，它大部分來源于麥曲和酒母，也有少部分來源于環(huán)境以及生產(chǎn)時(shí)所用的器具設(shè)備[15]。研究表明，乳酸菌是黃酒中生物胺的主要產(chǎn)生菌之一，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）等[35-36]。張無(wú)疾等[37]分析了黃酒前酵生產(chǎn)過程中主要微生物對(duì)生物胺形成的影響，結(jié)果表明，乳酸菌總數(shù)與生物胺含量呈正相關(guān)，說明乳酸菌是黃酒前酵過程中影響生物胺形成的重要微生物。

黃酒中的組胺通常被認(rèn)為是由乳酸菌產(chǎn)生，其他細(xì)菌產(chǎn)生很少或尚未引起相關(guān)重視。ZHANG J等[38]研究結(jié)果表明，黃酒曲中的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）是中國(guó)黃酒中組胺形成的重要原因。因此，在發(fā)酵早期抑制腸桿菌科（Enterobacteriaceae）生長(zhǎng)，是防止中國(guó)黃酒中組胺過量形成的途徑之一。

2.2 氨基酸種類及含量對(duì)黃酒生物胺形成的影響

生物胺形成的前體物質(zhì)是氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、精氨酸等），其含量對(duì)生物胺的形成有一定影響。許祿[39]分析黃酒不同釀造時(shí)期氨基酸總量和生物胺總量，發(fā)現(xiàn)前酵期間氨基酸總量與生物胺總量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。黃酒中氨基酸主要來源是米飯和麥曲中所含蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶分解后產(chǎn)生以及酵母等微生物自溶后內(nèi)容物釋放產(chǎn)生。蛋白質(zhì)水解得到前體氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、精氨酸等）含量增加，生物胺形成隨之增加[15]。因此，可通過控制蛋白酶水解，達(dá)到控制前體氨基酸含量，進(jìn)而達(dá)到控制黃酒中生物胺含量的目的。

2.3 黃酒生產(chǎn)及貯藏過程中的pH和溫度對(duì)黃酒生物胺形成的影響

黃酒生產(chǎn)過程中的環(huán)境因素會(huì)對(duì)生物胺的生成會(huì)造成一定影響，這是由于它們會(huì)影響微生物生長(zhǎng)以及氨基酸脫羧酶活性，其中影響較大的兩個(gè)因素是pH和溫度。

pH是影響生物胺形成的關(guān)鍵因素之一。pH對(duì)生物胺的形成有兩方面的影響，一方面，酸性會(huì)刺激乳酸菌產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生堿性的生物胺保護(hù)自身生長(zhǎng)繁殖[40-41]；另一方面，酸性也會(huì)導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)繁殖及氨基酸脫酸酶的活性受到抑制，影響氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺的脫羧反應(yīng)，生物胺的形成受到抑制[42]。生物胺的最終含量是由二者平衡決定。

溫度是影響黃酒生物胺含量的另一關(guān)鍵因素，在發(fā)酵過程中，生物胺形成最適宜的溫度是20～37 ℃，低于5 ℃或高于40 ℃時(shí)，微生物生長(zhǎng)及氨基酸脫羧酶活性均受到一定程度的抑制，生物胺的積累變緩[43]。在貯藏過程中，溫度也會(huì)影響生物胺含量，貯藏溫度越高越利于生物胺的積累。欒同青[44]探究了4 ℃、20 ℃及37 ℃三種貯藏溫度對(duì)黃酒中生物胺含量的影響。結(jié)果表明，在三種溫度下貯藏時(shí)，生物胺含量增加，其中在37 ℃時(shí)，生物胺含量增幅最大，20 ℃次之、4 ℃生物胺含量最小。因次，將溫度控制在適宜范圍，是控制黃酒生物胺含量的重要措施之一。

3 黃酒生物胺的控制措施

3.1 改良相關(guān)菌株

3.1.1 篩選低產(chǎn)生物胺的乳酸菌

乳酸菌是黃酒中產(chǎn)生生物胺的重要微生物，對(duì)其進(jìn)行改良可以控制生物胺的產(chǎn)生。在黃酒生產(chǎn)過程中，選用具有降生物胺或低產(chǎn)（不產(chǎn)）生物胺的乳酸菌來發(fā)酵黃酒可以控制黃酒中生物胺的產(chǎn)生。LIU S P等[45]從某地黃酒發(fā)酵液中篩選出不產(chǎn)生物胺的三株乳酸桿菌，分別是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JN01、希爾氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）JN02、希爾氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）JN013。其中，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JN01接種于發(fā)酵醪時(shí)，生物胺濃度顯著降低24%。XIONG Z Q等[46]從黃酒樣品中分離出不產(chǎn)生物胺的杜蘭腸球菌（Enterococcus durans）AR315，結(jié)果表明，在浸米階段和發(fā)酵階段添加杜蘭腸球菌（Enterococcus durans）AR315，總生物胺水平分別較對(duì)照顯著降低45.1%和27.6%（P＜0.05）。因此，采用不產(chǎn)生物胺的乳酸菌作為發(fā)酵劑是一種顯著減少生物胺形成的有效策略，具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。

3.1.2 篩選能分泌胺類氧化酶的乳酸菌

利用低產(chǎn)或不產(chǎn)生物胺，且對(duì)生物胺具有降解作用的菌株來發(fā)酵黃酒，目前已報(bào)道多種能分泌胺類氧化酶的乳酸菌，如沙克乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等[47]。魏曉璐等[48-53]研究均表明，從黃酒發(fā)酵過程中篩選出的某些植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），可產(chǎn)生胺氧化酶，對(duì)發(fā)酵醪中的生物胺具有降解作用，這些菌可以作為降低發(fā)酵食品中生物胺的備選功能菌，以提高發(fā)酵食品的安全性。

3.1.3 添加能抑制產(chǎn)生物胺菌株生長(zhǎng)的外源功能性微生物

在發(fā)酵系統(tǒng)中，使用外源功能性微生物來調(diào)節(jié)生物胺含量是一種常見的方法。外源功能性微生物對(duì)生物胺生成的相關(guān)菌株有抑制作用，可以起到控制生物胺生成的作用。XIA X L等[54-55]研究表明，植物乳桿菌和木糖葡萄球菌以1∶2的比例添加到黃酒發(fā)酵醪時(shí)，乳酸菌和葡萄球菌屬會(huì)抑制生物胺產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)，達(dá)到抑制生物胺形成的作用。邢旋等[56]從麥曲中篩選分離出不產(chǎn)生物胺的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），這種菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素，細(xì)菌素是一類蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，它們由某些細(xì)菌產(chǎn)生，具有一定的抗菌活性，能抑制多種產(chǎn)生物胺菌的生長(zhǎng)繁殖，能減少黃酒生物胺的形成。郝淑月等[57]從黃酒麥曲中分離篩選Pontibacter beigonshangensis和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）M25。Pontibacter beigonshangensis能夠誘導(dǎo)戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）M25產(chǎn)生細(xì)菌素，對(duì)黃酒中某些產(chǎn)生物胺菌有抑制作用。Pontibacterbeigonshangensis和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）M25自身不產(chǎn)生物胺。Pontibacter beigonshangensis和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）M25制備強(qiáng)化功能曲來釀造黃酒，可使黃酒中的生物胺含量降低29.8%。

3.2 改進(jìn)浸米工藝

傳統(tǒng)工藝釀造黃酒過程中，首先進(jìn)行浸米。一方面，浸米階段常在露天敞口環(huán)境下進(jìn)行，這會(huì)使環(huán)境中的部分的微生物進(jìn)入米漿水中，其中包括產(chǎn)生物胺的菌；另一方面，較長(zhǎng)的浸米時(shí)間會(huì)使大米中的糊粉層進(jìn)入米漿水并隨之進(jìn)入發(fā)酵醪，糊粉層中含有的蛋白質(zhì)可在相應(yīng)酶的作用下分解為大量氨基酸。兩方面都促使了生物胺的生成。據(jù)報(bào)道[48，50]，浸米階段是黃酒發(fā)酵醪中生物胺的主要來源，發(fā)酵醪中生物胺含量與浸米水和浸泡大米中生物胺含量均呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)R2分別為0.83和0.92），且浸泡大米對(duì)發(fā)酵醪中總生物胺含量的方差貢獻(xiàn)率為71.15%，表明控制浸米環(huán)節(jié)生物胺的積累是降低黃酒生物胺含量的一個(gè)有效途徑。

在生產(chǎn)過程中可以通過改良浸米工藝來達(dá)到控制生物胺含量的作用，魏曉璐[48]采用不浸米的淋米蒸飯工藝進(jìn)行蒸飯并添加4%的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）擴(kuò)配液進(jìn)行降低黃酒生物胺含量的研究。結(jié)果表明，淋米且添加乳酸菌釀造工藝有效地降低了生物胺含量，增加了酯類物質(zhì)含量，使得黃酒更加綿柔。該工藝可在一定程度上使米漿水的排放量減少，能耗及環(huán)境污染降低，具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

劉彩霞[50]開發(fā)了乳酸菌循環(huán)酸化浸米工藝，將植物乳桿菌以7.5%的比例添加至浸米初始階段，浸米過程中形成了以植物乳桿菌為主導(dǎo)的微生物區(qū)系，使得浸米水中的生物胺含量降低了93.84%。將浸泡大米落料發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)，相較于傳統(tǒng)浸米，循環(huán)浸米釀制黃酒中生物胺含量降至1/12。該工藝具有一定的參考價(jià)值。

3.3 控制氨基酸含量

氨基酸作為合成生物胺的前體物質(zhì)，對(duì)其含量進(jìn)行控制，也可對(duì)生物胺含量起到一定的控制作用。黃酒發(fā)酵過程中氨基酸可由蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生，因此可以通過控制蛋白酶活性來達(dá)到控制氨基酸含量的目的。由PEP4基因編碼的酵母蛋白酶A，是一種天冬氨酸蛋白酶，是酵母菌中重要的蛋白酶[58]，在發(fā)酵后期，可水解蛋白質(zhì)為生物胺的產(chǎn)生提供氨基酸?；谝陨显?，GUO X W等[59]通過敲除黃酒釀造酵母PEP4基因來達(dá)到降生物胺含量的目的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，該敲除菌株的蛋白酶A活性和氨基酸濃度顯著降低，生物胺產(chǎn)量從180.1 mg/L下降到134.2 mg/L，降低了25.5%，其中酪胺、尸胺和組胺質(zhì)量濃度也分別下降了57.5%、24.6%和54.3%。研究結(jié)果為降低黃酒發(fā)酵過程中生物胺的產(chǎn)生提供了新策略。

值得注意的是，氨基酸同時(shí)也賦予黃酒豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降低氨基酸含量的同時(shí)可能會(huì)影響黃酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此，在發(fā)酵過程中，需以高質(zhì)量黃酒生產(chǎn)為前提，平衡氨基酸和生物胺兩者之間的關(guān)系。

4 生物胺的檢測(cè)方法

4.1 高效液相色譜法

目前黃酒生物胺含量分析檢測(cè)的主要手段是高效液相色譜法，它具有分析速度快、檢測(cè)靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確等特點(diǎn)[61]，是我國(guó)食品生物胺含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[62]。由于黃酒成分復(fù)雜，直接檢測(cè)會(huì)造成干擾，需對(duì)黃酒樣品進(jìn)行前處理。黃酒樣品的前處理主要是提取、凈化、衍生。常用的提取試劑有高氯酸[63]、鹽酸[64]、三氯乙酸等[65]。凈化是指清除提取液中不需要或有害的雜質(zhì)，使生物胺得到純化，其方法主要有液-液萃取、液-液微萃取、固相萃取[66]。由于高效液相色譜大多連接紫外或熒光檢測(cè)器，而大部分生物胺沒有熒光或紫外發(fā)色基團(tuán)，因此常需要對(duì)樣品中的生物胺進(jìn)行衍生化處理后才能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。丹磺酰氯是目前生物胺定性和定量分析中最為常用的一種衍生試劑，此外，還有苯甲酰氯、鄰苯二甲醛、異硫氰酸苯酯等[67-69]。

HUANG K J等[69]采用超聲輔助分散液-液微萃取結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)技術(shù)，對(duì)黃酒樣品中章魚胺、酪胺和苯乙胺三種生物胺進(jìn)行了提取和測(cè)定。此方法有效提高了提取效率，并減少了有機(jī)溶劑消耗量。YE W等[70]采用鹽析輔助液-液萃取結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，測(cè)定了酒精飲料中生物胺的含量。傳統(tǒng)液-液萃取的萃取劑為水和乙腈，該方法在水和乙腈的基礎(chǔ)上加入了硫酸銨進(jìn)行鹽析反應(yīng)，降低了萃取劑的浪費(fèi)并且使樣品中的雜質(zhì)得到有效去除，方法回收率可達(dá)94.5%，能夠較準(zhǔn)確的檢測(cè)生物胺含量。ZHANG Y等[71]采用固相萃取結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，測(cè)定了黃酒中的生物胺的含量。使用綠洲MCX濾筒的固相萃取程序?qū)λ猩锇凤@示出卓越的凈化效率，并有效地消除了干擾。所得方法經(jīng)過充分驗(yàn)證，顯示出良好的檢測(cè)限、準(zhǔn)確度和精密度。綜上所述，高效液相色譜法較為準(zhǔn)確、穩(wěn)定，能夠達(dá)到生物胺定性和定量分析的要求。

4.2 薄層色譜法

薄層色譜法是一種微量、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，不需昂貴設(shè)備，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，它兼?zhèn)淞思埳V和柱色譜的優(yōu)點(diǎn)，適合小量樣品的分離[72]。李燕君[72]優(yōu)化并建立了一種薄層層析法，測(cè)定了黃酒中9種生物胺的含量，該方法的檢出限0.125～5.000 μg/mL，定量限5～20 μg/mL，平均加標(biāo)回收率88.4%～114.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.1%～9.8%。能達(dá)到與高效液相色譜相似的效果。生物胺定性、定量分析的薄層色譜方法學(xué)研究，對(duì)于后續(xù)開發(fā)和建立簡(jiǎn)便、快速、高通量的生物胺檢測(cè)方法有一定價(jià)值。

4.3 液質(zhì)聯(lián)用法

高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法不需要衍生化，靈敏度高，檢測(cè)限低，分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[73]，但檢測(cè)成本高。王可利等[74]建立了測(cè)定黃酒中6種生物胺的液質(zhì)聯(lián)用法，提高了大批量樣品檢測(cè)前處理效率，同時(shí)解決了檢測(cè)中出現(xiàn)的假陽(yáng)性問題。在食品安全質(zhì)量控制和研究要求方面，需要高靈敏度的檢測(cè)方法，以檢測(cè)出生物胺的細(xì)微變化。因此，液質(zhì)聯(lián)用法是檢測(cè)低濃度生物胺最合適的方法[75]。

4.4 離子色譜法

離子色譜法是利用各離子之間對(duì)離子交換樹脂親和力具有差異的原理進(jìn)行分離，可用于分析陰離子、陽(yáng)離子、極性及部分弱極性的有機(jī)化合物。生物胺具有陽(yáng)離子特性，因此，比較適合使用離子色譜法進(jìn)行分離。史亞利[76]用親水性很強(qiáng)的新型陽(yáng)離子交換柱IonPac CS18+CG18柱作為分離柱，電導(dǎo)檢測(cè)器對(duì)黃酒中七種生物胺進(jìn)行了檢測(cè)，該方法檢測(cè)限低，適用于黃酒生物胺的檢測(cè)。與柱前衍生的高效液相色譜法相比，離子色譜法不需要對(duì)樣品中的生物胺進(jìn)行衍生處理，避免了衍生反應(yīng)造成的副產(chǎn)物干擾，縮短了分析時(shí)間，提高了檢測(cè)分析的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。然而，離子色譜法需要使用較為大型、昂貴的離子色譜儀，成本較高，且攜帶不便，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

4.5 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳是一種以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)，是測(cè)定食品中生物胺的較好方法。該技術(shù)快速、高效、試劑消耗低，且遷移時(shí)間低于液相色譜，但與其他檢測(cè)方法相比靈敏度較低[77]。KOVáCS A等[78]采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)葡萄酒等食品中的7 種生物胺，結(jié)果顯示該方法靈敏度高、分離時(shí)間短。CORTACERO R S等[79]建立了毛細(xì)管電泳法測(cè)定啤酒中10 種生物胺含量的檢測(cè)方法，該方法酒類生物胺的檢測(cè)中具有良好的效果，而且操作簡(jiǎn)單，已在啤酒中生物胺的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。

4.6 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是一種準(zhǔn)確、靈敏、具有良好標(biāo)準(zhǔn)化潛力的檢測(cè)方法[80]。免疫識(shí)別原理是將生物胺作為抗原，利用生物識(shí)別元素與抗原結(jié)合后進(jìn)行含量檢測(cè)。常用的生物識(shí)別元素有抗體、核酸適配體、肽、分子印跡聚合物等[81]。袁利鵬等[82]將組胺衍生化，制備出可特異性識(shí)別組胺衍生物的抗體，然后利用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定魚、蝦和貝類中組胺含量。結(jié)果表明，該方法的檢出限為0.1 ng/mL，回收率為98.9%～130.1%。該方法可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

表2 生物胺常用檢測(cè)方法Table 2 Common detection methods of biogenic amines

5 小結(jié)與展望

黃酒作為我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵酒，其市場(chǎng)前景廣闊。生物胺作為其中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)性物質(zhì)，仍有許多問題值得探討：①目前我國(guó)還沒有關(guān)于黃酒中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，需在這方面開展系統(tǒng)研究。通過對(duì)大批量黃酒樣品的檢測(cè)分析，并結(jié)合生物胺毒性閾值等相關(guān)研究，評(píng)估生物胺的可能攝入風(fēng)險(xiǎn)性，建立相關(guān)的法律法規(guī)；②目前對(duì)黃酒中生物胺的形成機(jī)理研究尚未深入，對(duì)生物胺產(chǎn)生菌還未有效了解，需加大該方面的研究，為控制黃酒生物胺含量提供更多思路；③黃酒生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)重視黃酒生產(chǎn)管理，提高質(zhì)量和安全性；④高校及研究機(jī)構(gòu)應(yīng)加大對(duì)黃酒檢測(cè)方法的研究，對(duì)現(xiàn)有的檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)，建立準(zhǔn)確、快速、高通量的生物胺檢測(cè)方法，保障黃酒食用品質(zhì)和安全性。