劉思含，王瀟，關(guān)艷，劉憶霜，肖春玲，蒙建州

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的具有高致病性的傳染性疾病，是單一性傳染源引起的死亡率最高的疾病[1]。全球約有 20 億人攜帶有Mtb，其中 5% ～ 10% 的人有可能發(fā)展為 TB 患者。直接督導(dǎo)下短程化學(xué)療法（directly observed treatment short course，DOTS）方案的實(shí)施，使 85%結(jié)核病患者的生命得以挽救[1]。新型抗結(jié)核藥物及其組合的應(yīng)用，使得 TB 的感染率和死亡率相對于2000年有了一定程度的降低。但是 TB 的防治形勢依然嚴(yán)峻，2019年全球依然有 1000 萬新增結(jié)核病患者，而死亡患者人數(shù)高達(dá) 120 萬（不包含20 萬結(jié)核病-艾滋病共感染患者）。這主要是因?yàn)門B 治療周期長而導(dǎo)致患者依從性差、Mtb產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，包括單藥耐藥（single drug-resistant，SDR）、多藥耐藥（multidrug-resistant，MDR）及廣泛耐藥菌（extensive drug-resistant，XDR）菌株，近年來甚至出現(xiàn)了完全耐藥菌（total drug-resistant，TDR）菌株[2]。常規(guī)一線、二線抗結(jié)核藥物已經(jīng)不能有效治療由耐藥Mtb引發(fā)的 TB，近年來新上市的德拉瑪尼和貝達(dá)喹啉對多種耐藥菌具有良好的治療效果，但是較大的副作用限制了它們的廣泛應(yīng)用，而且臨床應(yīng)用中也很快發(fā)現(xiàn)了對它們具有耐藥性的突變菌株[3-5]?？上驳氖牵?020年 pretomanid（PA-824）成功上市，為治療由耐藥Mtb尤其是XDRMtb感染引起的 TB 提供了新的選擇[6]。但是全球依然有超過 50 萬株耐藥Mtb不能被有效治療[7]，臨床對新型抗結(jié)核藥物的需求依然迫切。

Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv 基因組的注釋以及功能研究發(fā)現(xiàn)了與菌株生長、增殖以及感染過程相關(guān)的必需基因[8-10]，它們可能是潛在的抗結(jié)核藥物靶標(biāo)。近年來，基于必需基因編碼產(chǎn)物建立分子水平的高通量抑制劑篩選模型，獲得了大量具有抑酶活性的化合物，但它們由于Mtb的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的屏蔽作用以及復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)部代謝環(huán)境而不具有抑菌活性[11-12]。而建立細(xì)胞水平的靶向藥物篩選克服了這一障礙，排除了不能進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到作用靶位的化合物[13]。但是必需基因并不等于是藥物靶標(biāo)，靶向篩選、設(shè)計(jì)抗結(jié)核藥物成功的案例十分罕見[14]。幾乎所有的抗結(jié)核藥物包括新近上市的德拉瑪尼、貝達(dá)喹啉、pretomanid 以及利奈唑胺等的先導(dǎo)物都是在細(xì)胞水平進(jìn)行抑制劑篩型獲得的[7]。因此在前期研究中，以化合物活性為導(dǎo)向、暫不關(guān)注其作用機(jī)制的研究策略將更有可能獲得結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特且具有成藥前景的先導(dǎo)物樣品。

本實(shí)驗(yàn)中我們將采用基于Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv 構(gòu)建的細(xì)胞水平的抑制劑篩選模型，對從上海陶塑生物科技有限公司購買的具有生物活性的化合物樣品進(jìn)行篩選，以期獲得結(jié)構(gòu)新穎的活性樣品。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株MtbH37Rv（ATCC 27294）、臨床多藥耐藥菌株Mtb28 和 1731 由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院）細(xì)菌免疫室保存。其中Mtb28 菌株對異煙肼（INH）、利福平、乙硫異煙胺耐藥，對鏈霉素、乙胺丁醇、阿米卡星、卷須霉素、對氨水楊酸鈉敏感；Mtb1731 菌株對 INH、利福平、鏈霉素、乙硫異煙胺耐藥，對乙胺丁醇、阿米卡星、卷須霉素、對氨水楊酸鈉敏感。

1.1.2 化合物樣品 化合物庫 L4000（含有7285 個化合物）購自上海陶塑生物科技有限公司，初始濃度為 10 mmol/L，采用 DMSO 稀釋至終濃度為 1 mmol/L；INH 購自美國 Sigma 公司，采用DMSO 溶解配成 1 mmol/L 的溶液，4 ℃ 保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)Mtb的培養(yǎng)基 7H9、7H10及其添加劑 OADC（油酸、白蛋白、右旋糖和過氧化氫酶）購自美國 BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 種子液培養(yǎng) 將保存于 -80 ℃ 的MtbH37Rv 和多藥耐藥菌株Mtb28 和 1731 接種于7H10 固體培養(yǎng)基（含 10% OADC），37 ℃ 培養(yǎng)直至長出單菌落；挑取單菌落接種于 5 ml 7H9 液體培養(yǎng)基（含 10% OADC 和 0.05% Tween80），37 ℃ 靜置培養(yǎng) 10 ～ 14 d。本研究中Mtb標(biāo)準(zhǔn)及臨床耐藥菌株的培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)都在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院完成。

1.2.2 抑制劑高通量篩選模型建立 為了節(jié)約化合物樣品的用量，我們需要對前期基于MtbH37Rv構(gòu)建的細(xì)胞水平的抑制劑篩選模型進(jìn)行修正[15]。以1 μl INH 溶液（終濃度 10 μmol/L）為陽性對照，1 μl DMSO 溶劑為陰性對照，并加入100 μl 含有對數(shù)期MtbH37Rv 的 7H9 培養(yǎng)液（終濃度A600≈0.1），以不含溶劑的正常生長組監(jiān)控溶劑對菌株生長的影響，同時以 7H9 培養(yǎng)基為空白對照，每組3 個平行。將 96 孔板密封后置于培養(yǎng)箱，37 ℃ 靜置培養(yǎng)并采用酶標(biāo)儀每隔一天測定菌株的A600（共測 6 次），計(jì)算 Z' 值以評估模型的可靠性。

1.2.3 抑制劑高通量篩選 在 96 孔板建立如表1 所示的篩選體系，對樣品庫 L4000 進(jìn)行篩選，初篩濃度為 10 μmol/L。

表1 Mtb H37Rv 細(xì)胞水平抑制劑高通量篩選體系Table 1 The assay system of high through-put screening model for searching anti-Mtb inhibitors via Mtb H37Rv

含有培養(yǎng)液的 96 孔板用保鮮膜封閉，于 37 ℃靜置培養(yǎng) 9 d 后觀察化合物對菌株的抑制情況。在本研究中，我們將在 10 μmol/L 濃度下能完全抑制菌株生長的化合物定義為陽性。

1.2.4 抑制劑抗結(jié)核活性測定 采用二倍稀釋法測定 1.2.2 中獲得的抑制劑對MtbH37Rv 及臨床多藥耐藥菌株 28 和 1731 的最低抑制濃度（minimum inhibitory concentrations，MIC）。在96 孔板中第一排加入化合物樣品，最高測試濃度為 10 μmol/L，最低測試濃度為 0.08 μmol/L（8 個梯度，每個樣品 3 個平行）。溶劑 DMSO 為陰性對照，INH 為陽性對照。

1.2.5 抑制劑成藥性預(yù)測 利用免費(fèi)網(wǎng)絡(luò)工具Swiss-ADME（http://www.swissadme.ch/）對 1.2.3中獲得陽性化合物的藥代動力學(xué)、類藥性質(zhì)以及化學(xué)可合成性進(jìn)行預(yù)測。同時利用 Molsoft L.L.C.（http://molsoft.com/mprop/）的 Drug-Likeness prediction and molecular property prediction 模塊對通過 Swiss-ADME 預(yù)測的化合物進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 高通量篩選模型構(gòu)建及評估

本研究中，我們將測試體系由之前的 200 μl降低至 100 μl，因此我們首先測定了實(shí)驗(yàn)菌株MtbH37Rv 在此條件下的生長情況。結(jié)果如圖1 所示，10 μmol/L INH 能完全抑制Mtb的生長，而 1%DMSO 對菌株的生長沒有影響，其生長情況與正常生長組一致。根據(jù)不同時間點(diǎn)陽性對照組、陰性對照組的A600吸收值計(jì)算模型的 Z' 值，第 6、8 及10 天相應(yīng)的 Z' 值為 0.382、0.723 和 0.819。Z' ＞0.5 的體系才能滿足高通量篩選的要求[16]，因此本研究中的篩選體系在 37 ℃ 孵育 8 d 后觀測實(shí)驗(yàn)結(jié)果能保證結(jié)果的可靠性和靈敏性。

圖1 Mtb H37Rv 生長曲線Figure 1 The growth curve of Mtb H37Rv

2.2 抑制劑高通量篩選

利用 2.1 建立的篩選模型，對樣品庫 L4000的 7285 個化合物進(jìn)行篩選，并對初篩陽性的化合物進(jìn)行排重（主要是排除已有抗結(jié)核活性報(bào)道的化合物）后，得到 411 個陽性樣品，陽性率為 5.64%。進(jìn)一步測定了它們對標(biāo)準(zhǔn)菌株MtbH37Rv 的MIC 值（圖2），絕大多數(shù)樣品對MtbH37Rv 的抑制活性大于 1 μmol/L，而 MIC 值小于 1 μmol/L的樣品有 60 個，占比 14.60%。

圖2 抗結(jié)核活性樣品對 Mtb H37Rv 的 MIC 值Figure 2 The minimal inhibition concentrations of anti-TB compounds to Mtb H37Rv

2.3 抑制劑對 MDR Mtb 抑制活性測定

在獲得抗結(jié)核活性化合物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測定了它們對臨床分離的 MDRMtb28和 1731 的抑制活性，結(jié)果如表2 所示。從 411 個對標(biāo)準(zhǔn)菌株有抑制活性的化合物中，總共獲得 24 個對耐藥菌株具有抑制活性的化合物（占化合物庫全部樣品的 0.33%）。從結(jié)果可以看出，絕大多數(shù)對標(biāo)準(zhǔn)菌株抑制活性強(qiáng)的樣品對耐藥菌株也具有抑制效果，極少數(shù)樣品（如 LBI191 和 LTBI207）對標(biāo)準(zhǔn)菌株抑制活性較弱、對耐藥菌株卻具有良好的抑制活性。這些化合物中，LTBI118 和 LTBI139 對敏感菌和耐藥菌都表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制活性（≤ 0.08 μmol/L），而 LTBI18 等 11 個樣品對所有菌株的 MIC 值差異在 8 倍以內(nèi)。在后續(xù)研究中需要對它們予以重視。

表2 化合物對 Mtb 標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床耐藥菌株的抑制活性（μmol/L）Table 2 The activities of compunds to the standard and clinical drug-resistant Mtb (μmol/L)

2.4 抑制劑成藥性預(yù)測

采用 Swisse-ADME 網(wǎng)絡(luò)工具對獲得的 24 個活性樣品進(jìn)行成藥性分析，總體分析結(jié)果采用WlogPer-TPSA 二維圖譜展示（圖3），標(biāo)記為藍(lán)色的化合物可能是 P-糖蛋白的底物，紅色的化合物則不是；有 12 個化合物落在允許區(qū)域內(nèi)，其中黃色區(qū)域內(nèi)的樣品能夠穿透血腦屏障，白色區(qū)域內(nèi)的樣品具有較好的腸道吸收性能。這 12 個化合物中，LTBI18、LTBI120、LTBI153 和 LTBI371 對Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株及 MDR 菌株都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其余化合物對不同菌株的抑制活性差異較大。而具有最強(qiáng)抗菌活性的化合物 LTBI118 和LTBI139 則落在允許區(qū)域以外，不具有成藥性。

圖3 WlogPer-TPSA 二維圖譜展示抗結(jié)核化合物的成藥性Figure 3 The drug abilities of anti-TB compounds demonstrated via WlogPer-TPSA two-dimensional diagram

進(jìn)一步查看這 12 個化合物的生物利用度雷達(dá)圖發(fā)現(xiàn)，化合物 LTBI121 和 LTBI371 的藥化性質(zhì)最佳，其中 LTBI121 的藥化性質(zhì)參數(shù)幾乎都位于粉色的允許區(qū)域內(nèi)，LTBI371 的參數(shù)則完全落在粉色區(qū)域內(nèi)（圖4）。而化合物 LTBI18、LTBI120和 LTBI153 不飽和程度很高導(dǎo)致生物利用度較差。從圖3 可以看出，化合物 LTBI121 能夠穿透血腦屏障，LTBI371 能通過腸道吸收。Swisse-ADME 預(yù)測的結(jié)果還表明 LTBI121 對CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6 及 CYP3A4 具有抑制性，而 LTBI371 對所有 CYP 不具有抑制性。表明具有較強(qiáng)抑菌活性的化合物 LTBI371 更具有研究價值。

圖4 LTBI121（A）和 LTBI371（B）的生物利用度雷達(dá)圖Figure 4 The bioavailability radar of LTBI121 (A) and LTBI371 (B)

我們也利用 Molsoft L.L.C. 對 LTBI371 的成藥性進(jìn)行計(jì)算（圖5），打分為 0.91，接近于大多數(shù)藥物類藥指數(shù)的中值，具有潛在的成藥性。

圖5 LTBI371 類藥性指數(shù)Figure 5 The drug-likeness score of LTBI371

3 討論

耐藥Mtb的產(chǎn)生和蔓延使得臨床對抗結(jié)核藥物的需求十分迫切，雖然全球在抗結(jié)核藥物開發(fā)方面投入了大量資金和人力，但是缺口依然很大[1]，開發(fā)新型抗結(jié)核藥物依然是全球抗感染藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。我們實(shí)驗(yàn)室通過構(gòu)建分子或細(xì)胞水平的抑制劑高通量篩選模型對本單位的合成化合物庫樣品（約 15 萬樣次）進(jìn)行篩選，獲得了一批結(jié)構(gòu)新穎的抗結(jié)核化合物[15]，但沒能獲得更進(jìn)一步的研究成果。然而，藥物研發(fā)成功的案例往往能給作為后來者的我們提供思路及方向。異煙肼在沉睡近 80年之后才發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗結(jié)核活性，并最終成為治療結(jié)核病的一線用藥；母核來源于抗瘧藥氯喹的喹諾酮類藥物在抗結(jié)核領(lǐng)域也具有一定的研究和應(yīng)用價值[17-18]。這些例子表明化合物（或藥物）新活性的發(fā)現(xiàn)或許是藥物開發(fā)研究的捷徑。

本研究中我們從上海陶塑生物科技有限公司購買了具有生物活性的化合物庫 L4000（含有7285 個樣品），該樣品庫收藏了近年來新發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒以及衰老、凋亡、自噬和人體代謝調(diào)節(jié)功能的化合物?？紤]到采用模式菌株進(jìn)行活性樣品篩選會產(chǎn)生不同程度的陽性樣品丟失、L4000 的庫容量也比較小，我們直接采用基于MtbH37Rv建立的細(xì)胞水平的抑制劑高通量篩選模型對這些樣品進(jìn)行篩選。通過實(shí)驗(yàn)的開展，我們總共得到 411 個具有抗結(jié)核活性的化合物，通過測定它們對Mtb標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床分離的多藥耐藥菌株的最低抑菌濃度，總共獲得了 24 個對它們都有抑制活性的化合物樣品，總體陽性率為0.33%，遠(yuǎn)高于對一般樣品庫進(jìn)行活性篩選的陽性率（0.1%）[19]。表明化合物的生物活性可能具有廣泛意義，這也是老藥新用開發(fā)成功概率比較高的原因。SIB（Swiss institute of bioinformatics）分子建模小組開發(fā)和維護(hù)的 SwissDrugDesign 是基于網(wǎng)絡(luò)的綜合性計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)網(wǎng)站，我們采用其Swiss-ADME 模塊對 24 個化合物進(jìn)行成藥性分析，包括分子量、氫鍵供（受）體、旋轉(zhuǎn)鍵、脂溶性、水溶性、CYP 酶抑制活性、P-糖蛋白結(jié)合能力及可合成性等。這些參數(shù)的優(yōu)劣對于合成化合物能否開發(fā)成為藥物至關(guān)重要，但是這些評判標(biāo)準(zhǔn)對于天然產(chǎn)物并不適用[20]。本研究中，我們得到 12 個具有成藥前景的抗結(jié)核化合物。但是，我們并沒有對這些活性樣品按照來源進(jìn)行分類，這就使得部分具有研究前景的化合物可能因?yàn)槌伤幮詤?shù)較差而被排除。因此，在后續(xù)研究中需要重點(diǎn)關(guān)注具有抗結(jié)核活性的天然產(chǎn)物。在 12 個具有成藥性的活性化合物中，腺苷激酶抑制劑 LTBI371 的成藥性最好，該化合物具有廣泛的生物學(xué)活性[21-24]，我們也首次發(fā)現(xiàn)了它具有抗結(jié)核活性。然而由于抗感染藥物的特殊性，很多抗生素的藥化性質(zhì)參數(shù)根本不能滿足 Lipinski、Ghose、Veber 或 Egan 等限定的成藥規(guī)則。因此，后續(xù)研究中需要采用實(shí)驗(yàn)手段對這 24 個抗結(jié)核活性樣品的毒性、藥代動力學(xué)及體內(nèi)、外藥效學(xué)進(jìn)行研究，最終從這些化合物中篩選得到藥學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的藥物先導(dǎo)物。