周秋華，苗雷，季曉君，左銳，吳艦，徐丹

腫瘤發(fā)生的三大基礎(chǔ)條件是細(xì)胞周期失控、DNA 損傷修復(fù)（DNA damage repair，DDR）和腫瘤免疫逃逸。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)發(fā)揮著重要作用，通過細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（如 G1/S，G2/M）檢測 DNA 是否受到損傷，進(jìn)而決定細(xì)胞周期是否進(jìn)入下一個環(huán)節(jié)。由于遺傳畸變經(jīng)常發(fā)生在G1/S 檢查點(diǎn)，因此腫瘤細(xì)胞更加依賴 S/G2和G2/M 檢查點(diǎn)來維持基因組的完整性。p53 蛋白參與細(xì)胞周期的調(diào)控和 DDR，通過 ATM/Chk2-p53途徑在 G1/S 期和 G2/M 期監(jiān)測基因組的完整性[1]。在惡性腫瘤中，50% 以上的腫瘤存在 p53 基因缺陷或突變，導(dǎo)致細(xì)胞周期 G1/S 檢查點(diǎn)的缺陷，使得腫瘤細(xì)胞 DNA 的復(fù)制及損傷修復(fù)過程更依賴于 G2/M 檢查點(diǎn)[2]，防止有絲分裂過程中產(chǎn)生大量的 DNA 損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在正常細(xì)胞中，G1/S檢查點(diǎn)未受到損傷，因此，G2/M 檢查點(diǎn)不會承受在 DNA 損傷修復(fù)之前停止細(xì)胞周期的負(fù)擔(dān)。這支持了廢除 G2/M 檢查點(diǎn)將選擇性地影響腫瘤細(xì)胞，而不影響正常的細(xì)胞生長的假說。

Wee1 激酶是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，它的功能是在細(xì)胞出現(xiàn) DNA 損傷時(shí)，參與細(xì)胞周期 G2/M 檢查點(diǎn)對 DNA 損傷檢查點(diǎn)的正調(diào)控，從而抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期[3]。Wee1 激酶在 DNA 損傷應(yīng)答通路中起到了關(guān)鍵作用，當(dāng)細(xì)胞的 DNA 損傷被識別后，Wee1 被磷酸化激活，進(jìn)而磷酸化失活 Cdc2（Thr15），使細(xì)胞周期停頓，暫不進(jìn)入有絲分裂，允許細(xì)胞有足夠的時(shí)間進(jìn)行DNA 損傷修復(fù)。p53 基因缺陷的癌細(xì)胞更依賴于Wee1 來維持細(xì)胞正常的有絲分裂進(jìn)程[4]。而在p53 基因功能正常的細(xì)胞中，抑制 Wee1 激酶的活性，可以通過 p53 依賴的方式進(jìn)行 DNA 損傷修復(fù)，正常細(xì)胞的生存不受影響[5]。因此，對于 p53 基因缺陷腫瘤細(xì)胞，Wee1 抑制劑可以作為一種有效的結(jié)合 DNA 損傷治療的致敏劑，使得細(xì)胞過早進(jìn)入有絲分裂以及在有絲分裂期間的細(xì)胞死亡[4]。因此，Wee1 激酶是通過 DNA 損傷修復(fù)機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用的極具潛力的藥物開發(fā)靶點(diǎn)。

目前，在研的 Wee1 小分子抑制劑主要有PD0166285、PD0407824 以及 MK-1775 等。MK-1775（又名 AZD-1775 或 adavosertib）是阿斯利康公司研發(fā)的一款高選擇性的 Wee1 抑制劑。在包含 223 個激酶的激酶譜研究中，1.0 μmol/L 的MK-1775 只對其中 8 個激酶的抑制率超過 80%。對其中 7 個激酶的活性比 Wee1 激酶（IC50=5 nmol/L）低 10 倍，對 MYT1 激酶的活性比 Wee1激酶低 100 倍。將 MK-1775 與不同作用機(jī)制的DNA 損傷劑聯(lián)用，包括抗代謝物（卡培他濱、5-氟尿嘧啶、吉西他濱和培美曲塞）、DNA 交聯(lián)劑（卡鉑、順鉑和絲裂霉素 C）或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（喜樹堿和多柔比星），在 p53 缺失或突變的宮頸癌、結(jié)腸癌、肺癌和胰腺癌細(xì)胞系中顯示了增強(qiáng)的抗腫瘤療效，這些結(jié)果支持有絲分裂致死性的作用機(jī)制[6]。MK-1775 是目前臨床進(jìn)展最快，研究最多的 Wee1 抑制劑。I 期臨床結(jié)果顯示，MK-1775 單藥治療耐受性良好，劑量爬坡未達(dá)到最大耐受劑量。在與化療藥物聯(lián)合治療的人群中，不良反應(yīng)主要包括疲勞、惡心和嘔吐、腹瀉和血液學(xué)毒性[7]。II 期臨床研究證實(shí)，MK-1775 可使癌癥患者對不同的化療藥物致敏。在 p53 突變的鉑類藥物難治或耐藥的卵巢癌患者中，MK-1775 聯(lián)合卡鉑治療均顯示出了一定的療效[8]。

在本研究中，我們建立了一種新穎、有效的Wee1 激酶小分子抑制劑體外篩選模型。為了獲得單藥細(xì)胞毒性較低的 Wee1 選擇性抑制劑，先通過酶學(xué)篩選出對 Wee1 激酶有抑制活性的小分子，后在 WiDr 細(xì)胞中進(jìn)行單用及與吉西他濱聯(lián)用的細(xì)胞增殖抑制評價(jià)，同時(shí)通過測定細(xì)胞內(nèi) Wee1 下游Cdc2 及 HH3 的磷酸化水平綜合評估 Wee1 抑制劑的活性及細(xì)胞毒性作用。本文以 MK-1775 為例進(jìn)行綜合活性評價(jià)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 Wee1 激酶購自日本 Carna biosciences 公司；ADP-GloTMKinase Assay Kit 購自美國 Promega 公司；MK-1775、吉西他濱購自上海畢得醫(yī)藥公司；MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、NEAA 非必需氨基酸、GlutaMAX 以及丙酮酸鈉均購自美國 Gibco 公司；DMSO 購自美國 Sigma 公司；Cell Counting-LiteTM2.0 溶液購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Phospho-Cdc2(Tyr15) (10A11) 兔 mAb、Cdc2 (POH1) 鼠 mAb以及 GAPDH (D4C6R) 鼠 mAb 均購自美國 CST公司；Phospho-Histone H3 (Ser10) 兔抗體購自美國Millipore 公司；IRDye 800CW 羊抗兔 IgG (H +L)、RDye 680RD 羊抗鼠 IgG (H + L) 以及 Li-Cor封閉緩沖液均購自美國 Li-COR 公司。

1.1.2 儀器 自動加液儀 D300e 以及多功能酶標(biāo)儀購自瑞士 Tecan 公司；自動洗板分液儀購自美國 Bio Tek 公司；生化培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱以及熒光倒置顯微鏡購自美國 Thermo 公司；熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自艾力特生命科學(xué)（上海）有限公司；生物安全柜購自蘇凈安泰公司；Apricot 移液工作站購自美國 Apricot Designs 公司；Odyssey CLx 雙色紅外激光成像系統(tǒng)購自美國 Li-COR 公司。

1.1.3 細(xì)胞 p53 突變型人結(jié)腸癌細(xì)胞（WiDr 細(xì)胞）購自南京科佰生物科技有限公司，根據(jù)供應(yīng)商指示的培養(yǎng)條件（含 10% FBS、1% 谷氨酰胺、1%NEAA 和 1% 丙酮酸鈉的 MEM 培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 體外激酶實(shí)驗(yàn) 重組激酶 Wee1 在含40 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L MgCl2、0.1 mg/ml BSA、2 mmol/L DTT 的激酶緩沖液（pH 7.5）中調(diào)整反應(yīng)濃度為 0.67 mg/L。然后采用自動加液儀加入MK-1775 化合物，起始濃度 1 μmol/L，1/2 Log 倍梯度稀釋，共設(shè) 8 個梯度，在 30 ℃ 條件下孵育15 min。接著與 2 μg/ml 的底物及 50 μmol/L 的ATP 在 30 ℃ 反應(yīng) 120 min，最后采用 ADP-Glo法評價(jià)目標(biāo)化合物抑制 Wee1 激酶的活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3 次重復(fù)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取適量的 WiDr 細(xì)胞株接種于白壁底透的 96 孔板中，細(xì)胞貼壁 24 h后，用自動加液儀加入吉西他濱進(jìn)行損傷作用，摸索吉西他濱合適的損傷時(shí)間及濃度，然后用自動加液儀加入梯度濃度的 MK-1775 進(jìn)行聯(lián)用，摸索合適的聯(lián)用時(shí)間。聯(lián)用組同時(shí)與單藥吉西他濱以及單藥 MK-1775 比較對細(xì)胞活性的影響。細(xì)胞活力采用 Cell Counting-LiteTM2.0 溶液評價(jià)，采用多功能酶標(biāo)儀測定 luminescence 信號。

1.2.3 Odyssey in-cell Western 驗(yàn)證 取適量的WiDr 細(xì)胞株接種于 384 孔板中，細(xì)胞貼壁過夜后，用 10 nmol/L 的吉西他濱處理 WiDr 細(xì)胞，37 ℃、5% CO2孵育 24 h。第 3 天加入化合物MK-1775（DMSO 最終濃度為 0.1%），37 ℃、5%CO2孵育 7 h。然后加入 8% 固定液固定細(xì)胞，100% 甲醇滲透細(xì)胞。PBS 洗滌后用 Li-Cor 封閉緩沖液封閉。去除封閉緩沖液，加入一定比例的一抗混合液（兔抗-pCdc2/鼠抗-Cdc2 或兔抗-pHH3/鼠抗-GAPDH），4 ℃ 孵育過夜。用 PBST（0.05%Tween 20 的 PBS）洗滌板子 3 次后加入一定比例的二抗混合液（羊抗兔 800CW/羊抗鼠 680RD），避光孵育 45 min。用 PBST洗滌板子 3 次。以1000 r/min 倒置離心 1 min，用近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.2.4.1 體外激酶實(shí)驗(yàn) 所有數(shù)據(jù)分析均采用GraphPad Prism 5 軟件擬合量效曲線，得到化合物對 Wee1 激酶抑制的 IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置單孔。抑制率計(jì)算公式：

其中，Lsample為樣品孔的 luminescence 值；Lmin為無酶無待測化合物的空白對照孔的luminescence 均值；Lmax為有酶、無化合物的陰性對照孔的 luminescence 均值。

1.2.4.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用 GraphPad Prism 5 軟件擬合量效曲線，得到化合物對細(xì)胞增殖抑制的 IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置復(fù)孔。抑制率計(jì)算公式：

抑制率（%）={[1 -（受試物信號值 - 空白組信號值）]/（陰性對照組信號值 - 空白組信號值）}× 100%

其中，受試物信號值為細(xì)胞 + 培養(yǎng)基 + 化合物組熒光信號均值；空白組信號值為培養(yǎng)基組熒光信號均值；陰性對照組信號值為細(xì)胞 + 培養(yǎng)基組熒光信號均值。

1.2.4.3 Odyssey in-cell Western 驗(yàn)證 采用GraphPad Prism 5 軟件擬合量效曲線，得到化合物對 pCdc2 和 pHH3 的 IC50和 EC50值。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 體外 Wee1 激酶抑制試驗(yàn)

MK-1775 是一種有效的選擇性 Wee1 抑制劑，在體外激酶活性檢測中 3 次實(shí)驗(yàn)的 IC50值分別為 1.990、2.771 和 3.281 nmol/L，平均 IC50值為 2.681 nmol/L，CV 值為 24%（圖1）。通過該實(shí)驗(yàn)方法可以篩選出對 Wee1 激酶抑制活性較高的化合物。

圖1 MK-1775 對 Wee1 激酶的抑制作用Figure 1 Inhibition of Wee1 kinase by MK-1775

2.2 體外單藥與聯(lián)用對 WiDr 細(xì)胞株的增殖抑制

2.2.1 吉西他濱損傷條件的優(yōu)化 參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]摸索吉西他濱的損傷作用時(shí)間。吉西他濱作用48 h 后對 WiDr 細(xì)胞的損傷作用較弱，10 μmol/L最大抑制率不到 20%（圖2A）。當(dāng)作用時(shí)間延長到 72 h后，10 μmol/L 的吉西他濱最大抑制率可達(dá)到 60%，損傷作用比作用 48 h 有大幅增強(qiáng)（圖2B）。當(dāng)吉西他濱與不同濃度的 MK-1775 聯(lián)用時(shí)，MK-1775 明顯增強(qiáng)了吉西他濱對 WiDr 細(xì)胞的增殖抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性（圖2C）。根據(jù)吉西他濱作用 72 h 的結(jié)果，選擇了 1.5、4.5、13.5 nmol/L 的吉西他濱單藥抑制率分別在 14%、28%、40% 的條件下觀察其與MK-1775 的聯(lián)用作用。

圖2 WiDr 細(xì)胞中吉西他濱作用時(shí)間的優(yōu)化（A：48 h；B：72 h；C：吉西他濱與 MK-1775 聯(lián)用）Figure 2 Optimization of gemcitabine action time in WiDr cells (A: 48 h; B: 72 h; C: Gemcitabine incubated with MK-1775)

2.2.2 吉西他濱損傷濃度以及 MK-1775 作用時(shí)間的優(yōu)化 將 3 個不同濃度的吉西他濱作用于 WiDr細(xì)胞 48 h 后，聯(lián)合 MK-1775 分別作用 24、48 以及 72 h。結(jié)果顯示，吉西他濱濃度為 1.5 nmol/L時(shí)，對 MK-1775 的增敏作用微弱，與 MK-1775的單藥抑制率曲線幾乎重合。吉西他濱濃度為13.5 nmol/L 時(shí)，對 MK-1775 的增敏作用雖然較強(qiáng)，但是抑制窗口較窄，這可能是由于吉西他濱濃度過高導(dǎo)致的細(xì)胞毒性作用，因此 4.5 nmol/L 是吉西他濱 3 個濃度中最為適宜的損傷濃度（圖3）。從 MK-1775 化合物的作用時(shí)間來看，作用 72 h的藥效窗口最大。因此，我們選擇了 4.5 nmol/L 的吉西他濱損傷 48 h 后聯(lián)用 MK-1775 化合物作用72 h 的條件用于后期在細(xì)胞水平評價(jià) MK-1775的活性。

圖3 WiDr 細(xì)胞中吉西他濱損傷濃度以及 MK-1775 作用時(shí)間的優(yōu)化（A：聯(lián)用 24 h；B：聯(lián)用 48 h；C：聯(lián)用 72 h）Figure 3 Optimization of gemcitabine damage concentration and time of MK-1775 in WiDr cells (A: 24 h; B: 48 h; C: 72 h)

2.2.3 WiDr 細(xì)胞增殖抑制篩選模型的應(yīng)用 結(jié)果顯示，MK-1775 單藥對 WiDr 細(xì)胞的 IC50值分別為 380.2、488.1 和 352.2 nmol/L，3 次實(shí)驗(yàn)的CV 值為 18%，符合重復(fù)性的要求（圖4A）。當(dāng)MK-1775 與吉西他濱聯(lián)用時(shí)，對 WiDr 細(xì)胞的IC50值分別為 114.0、155.6 和 85.0 nmol/L，3 次實(shí)驗(yàn)的 CV 值為 30%，表明該檢測體系較為穩(wěn)定（圖4B）。3 次單藥與聯(lián)用實(shí)驗(yàn) IC50的比值分別為 3.3、3.1、4.1，體現(xiàn)出了較為明顯的聯(lián)用效果。

圖4 MK-1775 單用（A）及與吉西他濱聯(lián)用（B）對 WiDr 細(xì)胞的增殖抑制作用Figure 4 Proliferation inhibition of WiDr cells by MK-1775 alone (A) or in combination with gemcitabine (B)

上述數(shù)據(jù)表明 DNA 損傷劑吉西他濱激活DNA 損傷通路后，Wee1 抑制劑加劇細(xì)胞毒性作用。4.5 nmol/L 的吉西他濱單用對細(xì)胞的抑制率僅為 15% 左右，但與 MK-1775 聯(lián)用對細(xì)胞的增殖抑制作用顯著增強(qiáng)。而 MK-1775 單用表現(xiàn)出溫和的增殖抑制作用。通過單藥的細(xì)胞增殖抑制篩選模型找到毒性較低的 Wee1 抑制劑，與吉西他濱損傷劑聯(lián)用篩選出對損傷劑具有較強(qiáng)增敏作用的目標(biāo)化合物。因此，該模型具有在早期細(xì)胞篩選預(yù)測單藥 Wee1 抑制劑非靶標(biāo)毒性，減少后期聯(lián)用策略可能會產(chǎn)生的不良反應(yīng)。與吉西他濱聯(lián)用效果也為體內(nèi)藥效劑量的選擇提供了參考。

2.3 p-Cdc2 和 pHH3 測定結(jié)果

吉西他濱處理后，MK-1775 對 WiDr 細(xì)胞中Wee1 下游底物 Cdc2（Tyr15）的磷酸化以及有絲分裂進(jìn)程標(biāo)志物組蛋白 H3（Ser10）的磷酸化可以反映 Wee1 激酶的活性。結(jié)果顯示，MK-1775能夠抑制 WiDr 細(xì)胞中 Cdc2 的磷酸化（IC50=157.2 nmol/L，圖5A），使得由吉西他濱誘導(dǎo)的DNA 損傷檢查點(diǎn)失效，并且通過誘導(dǎo)組蛋白 H3磷酸化（EC50= 103.4 nmol/L，圖5B）使細(xì)胞過早進(jìn)入有絲分裂，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。這些結(jié)果可以預(yù)測化合物通過抑制 Wee1 激酶增強(qiáng)抗腫瘤作用。在激酶實(shí)驗(yàn)測定中有活性的化合物如果在細(xì)胞中是無活性的，可能是由于細(xì)胞滲透不足、培養(yǎng)基結(jié)合的差異或?qū)ι瘻y定讀數(shù)的干擾。

圖5 MK-1775 對 WiDr 細(xì)胞中 Cdc2（A）以及 HH3（B）磷酸化水平的影響Figure 5 Effects of MK-1775 on Cdc2 (A) and HH3 (B) phosphorylation in WiDr cells

3 討論

DDR 是維持基因組穩(wěn)定性的基本機(jī)制。有一些腫瘤細(xì)胞通過 DDR 通路的過表達(dá)或不受控制的激活已被證明可以保護(hù)癌細(xì)胞免受 DNA 損傷劑的殺傷作用。這些癌細(xì)胞能夠耐受高增殖率誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激，并維持內(nèi)在的遺傳不穩(wěn)定性。Wee1 激酶在非惡性細(xì)胞的細(xì)胞周期中發(fā)揮調(diào)控遺傳穩(wěn)定性，而在癌細(xì)胞中具有促進(jìn) DNA 損傷修復(fù)和細(xì)胞周期控制的能力。多項(xiàng)研究表明，惡性細(xì)胞具有高表達(dá)的 Wee1，已成為化療/放療方案良好的預(yù)后生物標(biāo)志物，癌細(xì)胞似乎嚴(yán)格依賴于 Wee1 激酶的功能來生存，特別是那些 p53 基因缺陷型腫瘤[8]。p53基因缺陷的各種惡性腫瘤使用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)的化療/放療療法相比 p53 基因野生型的腫瘤細(xì)胞更為難治。截至目前，直接靶向 p53 的藥物尚處于研發(fā)階段，而合成致死的方法給予研究者們新的希望。Wee1 抑制劑聯(lián)合放化療療法就是基于其原理，主要機(jī)制是 Wee1 抑制劑能夠阻滯 p53 基因缺陷型腫瘤在 G2/M 期檢查點(diǎn)的 DNA 損傷修復(fù)，使細(xì)胞過早進(jìn)入有絲分裂從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。臨床前和臨床數(shù)據(jù)顯示，Wee1 抑制劑 MK-1775 能增加 p53缺陷的癌細(xì)胞對放化療的敏感性[10-12]。

MK-1775 已開展了大量的臨床前研究，評價(jià)了其在單藥和聯(lián)合治療中的療效。關(guān)于其作用機(jī)制，當(dāng)用于單藥治療時(shí)，MK-1775 能夠誘導(dǎo) S和（或）G2/M 細(xì)胞周期檢查點(diǎn)跳躍。在聯(lián)合治療中，MK-1775 能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)跳躍、抑制 DNA 損傷修復(fù)和誘導(dǎo)凋亡來增強(qiáng)化療（放療）藥物的細(xì)胞毒性[8]。體外實(shí)驗(yàn)表明，MK-1775 單用在 p53 野生型、p53 突變型和 p53 缺失型的肉瘤細(xì)胞中均觀察到細(xì)胞毒性。MK-1775 單用產(chǎn)生的細(xì)胞毒性與其對 Wee1 的抑制無關(guān)，可能是其通過對 Cdc2（Tyr15）直接的磷酸化抑制導(dǎo)致肉瘤細(xì)胞過早進(jìn)入有絲分裂或者由于其本身對 DNA 的損傷作用導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[13]。考慮到 Wee1 抑制劑通常與化療藥物聯(lián)合使用，上述情況可能會增加細(xì)胞毒性相關(guān)的不良事件，并破壞靶向 Wee1 的化學(xué)致敏策略[14]。事實(shí)上，目前還沒有開發(fā)出針對其功能的選擇性抑制劑。因此，研發(fā)單用毒性低的 Wee1抑制藥物具有更加廣闊的臨床應(yīng)用前景。

在本文中，我們描述了 MK-1775 的體外活性，它是一種有效的 Wee1 小分子抑制劑，與吉西他濱聯(lián)用，在 p53 缺陷人結(jié)腸癌細(xì)胞中通過抑制細(xì)胞中 Cdc2 的磷酸化，導(dǎo)致 DNA 損傷檢查點(diǎn)失效，通過磷酸化組蛋白 H3 誘導(dǎo)細(xì)胞過早進(jìn)入有絲分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但是 MK-1775 單藥也存在一定的劑量依賴毒性?，F(xiàn)有的 Wee1 抑制劑的細(xì)胞活性通常伴隨著對有著相似結(jié)合位點(diǎn)的其他激酶的抑制，會帶來脫靶作用。在早期篩選，從時(shí)間、成本、人力的角度我們不可能基于激酶譜篩選方法篩選靶向性更好的選擇性抑制劑。我們采用單藥增殖抑制實(shí)驗(yàn)和與損傷劑聯(lián)用實(shí)驗(yàn)，旨在篩選出單藥低毒并且對 DNA 損傷劑有增效作用的 Wee1抑制劑。該方法操作簡單、方法穩(wěn)定、評價(jià)成本較激酶譜篩選低，可在早期預(yù)測 Wee1 抑制劑脫靶細(xì)胞毒效應(yīng)。該模型優(yōu)化的關(guān)鍵因素為損傷劑作用的濃度與時(shí)間以及 Wee1 抑制劑作用的時(shí)間。這種篩選方法的意義在于避免單藥的細(xì)胞毒作用，同時(shí)保證臨床療效，以改善安全性，可能使傳統(tǒng)治療不良預(yù)后的腫瘤對常規(guī)治療更加敏感。