曹 莉，武周慧，程如楠, 王家偉，吳清民，王 真*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，獸醫(yī)學(xué)(中獸醫(yī))北京市重點實驗室 ，北京102206；2. 北京大學(xué)第三醫(yī)院 實驗動物中心，北京100191；3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，北京100193 )

沙門菌是一種很常見的食源性致病菌，引起人和多種動物感染。據(jù)統(tǒng)計，在所有食物中毒中，沙門菌感染畜禽類食品，而造成人類食品中毒是最為嚴重的，在細菌性食物中毒占比為42.6%～60%[1]。截止到2007年，沙門菌有多達2600余種血清型，其中能引起人類和畜禽沙門菌病的主要兩大血清型是鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)和腸炎沙門菌(Salmonellaenteritidis)。鼠傷寒沙門菌可導(dǎo)致人的急性胃腸炎，且能夠引起小鼠產(chǎn)生全身傷寒性疾病[2]。

毒力島是一組染色體 DNA 片段，分子量非常大，可以對細菌感染過程進行調(diào)控。在很大程度上面增強病原菌的致病能力[3]。研究表明，隨著細菌的毒力基因進化，大多致病菌，如李斯特氏菌、大腸桿菌、耶爾森氏菌、沙門菌、幽門螺桿菌等，大部分都存在著1個或多個毒力島基因[4]。沙門菌的毒力島(SPI)較復(fù)雜，有5個SPI，包括SPI-1，SPI-2，SPI-3，SPI-4 和 SPI-5，由 60 個基因編碼。沙門菌的毒力島影響著沙門菌對腸道上皮細胞的侵襲力，且與該菌在鎂離子不足條件下或在巨噬細胞內(nèi)的存活有關(guān)[5]。SPI-3是mgtC基因的編碼產(chǎn)物，對沙門菌在低 Mg2+環(huán)境和巨噬細胞中的存活起了重要作用[6,7]。為了進一步研究沙門菌毒力島基因mgtC的生物學(xué)功能，用λ- Red同源重組技術(shù)構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌mgtC基因缺失株；對mgtC基因缺失株的生長特性、抗菌肽耐受、酸敏感性、生物被膜形成能力、胞內(nèi)增殖以及小鼠體內(nèi)毒力進行研究，分析了mgtC基因的功能，闡述了毒力致病機制，為沙門菌致病機制的全面闡釋提供理論指導(dǎo)并奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料

鼠傷寒沙門菌S.TyphimuriumATCC 14028s，質(zhì)粒pKD46， pCP20， pKD3及互補質(zhì)粒pBR322均由獸醫(yī)學(xué)(中獸醫(yī))北京市重點實驗室保存；鼠源巨噬細胞J774A.1，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳清民教授實驗室饋贈；BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司；PCR Mixture、DNA Marker 、限制性內(nèi)切酶、凝膠回收試劑盒、T4 連接酶等均購自北京擎科生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

用 Primer 5.0設(shè)計6對引物。引物 F1 和 F2 由兩部分組成，序列前部與mgtC基因同源，后部與氯霉素抗性基因(cat)同源，F(xiàn)1 和 F2 用于擴增cat基因。引物 F3、F4與mgtC基因同源，用于缺失基因mgtC的鑒定，引物 F5、F6用于mgtC基因擴增和構(gòu)建回補菌株。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成上述引物(表1)。

表1 PCR擴增所用引物Tab.1 The primer sequences for PCR amplification

1.3 mgtC基因缺失株及回補株的構(gòu)建

使用引物 F1/F2擴增質(zhì)粒pKD3上的氯霉素基因片段，進行膠回收；將培養(yǎng)至對數(shù)期的沙門菌S.typhimuriumATCC 14028s (攜帶 pKD46)菌液中加入終濃度為 30 mmol/L-阿拉伯糖，誘導(dǎo)2 h 后冰浴10 min ，用冰的去離子水洗滌3次，加ddH2O水重懸，制備感受態(tài)細胞。將帶有mgtC同源臂氯霉素電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，涂布氯霉素平板，培養(yǎng)之后進行PCR鑒定。在42 ℃的條件下，將陽性菌熱激去除質(zhì)粒pKD46，通過氨芐青霉素平板篩選和 PCR鑒定獲得一次缺失菌株。將上步經(jīng)平板篩選和PCR鑒定的質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)化入一次缺失菌株中，篩選得到敲除氯霉素片段的菌株，即為mgtC基因缺失菌株SM△mgtC，再次進行PCR鑒定。擴增mgtC基因連接到質(zhì)粒pBR322中。將其電轉(zhuǎn)化至菌株SM△mgtC中，經(jīng)鑒定陽性菌株命名為SM△mgtC::mgtC，即為回補菌株。

1.4 基因缺失株觀察

取SM、SM△mgtC和SM△mgtC::mgtC三種沙門菌株單菌落于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，在搖床中37 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 取樣，測定OD600值，繪制3種菌的生長曲線。

1.5 基因缺失株對多粘菌素B敏感性試驗

挑取SM、SM△mgtC和SM△mgtC::mgtC單菌落接種于10 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將各菌液稀釋至106CFU/mL，取100 μL加入到96孔板中，并加入100 μL 0.3 μg/mL的多粘菌素B，混勻后放入37 ℃恒溫箱孵育1 h后計數(shù)，計算各菌株的存活率。

1.6 基因缺失株酸敏感性試驗

使用生理鹽水調(diào)整SM、SM△mgtC和SM△mgtC::mgtC菌液濃度為 1×108CFU/mL；各菌液平均分成2管，其中1管離心后，加入新鮮的LPM培養(yǎng)基(pH為5.5)；放置37 ℃恒溫箱1 h后取出計數(shù)；離心后加入LPM培養(yǎng)基(pH為3)，再次放置37 ℃恒溫箱1 h后取出計數(shù)，分析各菌株存活率。

1.7 基因缺失株生物被膜形成能力檢測

取SM、SM△mgtC菌液按1%接入LB液體培養(yǎng)基，并將其培養(yǎng)到對數(shù)生長期， 150 μL/ 孔加入到96 孔板中，在搖床30 ℃，180 r/min培養(yǎng)；24 h后棄去菌液，蒸餾水多次沖洗去浮游菌，加入2 %結(jié)晶紫室溫染色 15 min，用蒸餾水沖洗；加33%乙醇溶解結(jié)晶紫，測量OD630值，數(shù)據(jù)整理后進行分析。

1.8 基因缺失株細胞黏附與侵襲試驗

取生長良好的鼠源巨噬細胞J774A.1，以 1×105/孔鋪于24 孔細胞板；根據(jù)SM、SM△mgtC和SM△mgtC::mgtC細菌計數(shù)結(jié)果，以MOI=10的劑量感染J774A.1細胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min后，用PBS沖洗，加入含 0.5%(vol/vol)吐溫-20的PBS緩沖液，對細胞裂解液進行稀釋計數(shù)，并統(tǒng)計黏附細胞的細菌數(shù)量。黏附力計算公式：黏附的細菌量/感染細胞的細菌量；孵育1 h時，用慶大霉素殺死胞外細菌，裂解細胞后進行活菌計數(shù)，統(tǒng)計重組菌的侵襲力。

1.9 基因缺失株胞內(nèi)存活能力的測定

鼠源巨噬細胞J774A.1，以 1×105/孔鋪于24孔細胞板；將SM、SM△mgtC和SM△mgtC::mgtC以MOI=10分別感染J774A.1細胞，孵育20 min后掉上清，加入含20 μg/mL 慶大霉素的DMEM維持培養(yǎng)基殺死胞外細菌。分別在在感染后 1 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h時加入1 % Tritoxn-100，對裂解的細胞進行細菌計數(shù)，繪制各菌株在胞內(nèi)的增殖曲線。

1.10 小鼠體內(nèi)毒力測定

選購BALB/c 小鼠，每組10只。取SM、SM△mgtC菌液，以104劑量腹腔注射小鼠，逐日觀察記錄小鼠死亡日期和數(shù)量。接種后7日，SM△mgtC組剖殺3只小鼠，對其脾臟載菌量進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 mgtC基因缺失株和回補菌株的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

以引物F1 和 F2，擴增質(zhì)粒 pKD3中的氯霉素基因序列 ，電轉(zhuǎn)化至攜帶質(zhì)粒pKD46的親本菌中，熱激去除質(zhì)粒 pKD46；利用質(zhì)粒 pCP20 消除氯霉素片段，得到缺失菌株SM△mgtC，PCR 鑒定結(jié)果如圖 1，基因缺失株SM△mgtC擴增條帶約為160 bp，SM擴增條帶為640 bp，回補菌株擴增條帶為640 bp，與預(yù)期相符，表明成功構(gòu)建了mgtC基因缺失菌株。

M.DL2000；1. mgtC基因缺失株；2. 親本菌株；3.回補菌株圖1 基因缺失株SM△mgtC的PCR鑒定M.DL2000: 1. mgtC gene deleted strain;2. Wild strains;3. complementary strainFig.1 Identification of deleted SM△mgtC strain by PCR

2.2 重組菌生長特性觀察結(jié)果

SM、SM△mgtC和SM△mgtC::mgtC菌株不同時間點菌液的OD600生長曲線如圖2所示，培養(yǎng)時間為6 h，基因缺失株SM△mgtC的 OD值略低于親本菌株SM，但總體生長差異不顯著，說明mgtC基因缺失不影響沙門菌的生長。

圖2 重組菌生長特性測定Fig.2 Growth cuvers of recombinant stains

* P<0.05圖3 重組菌多粘菌素B敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Polymyxin B sensitivity tests of recombinant strains

2.3 重組菌多粘菌素B敏感性測定結(jié)果

使用終濃度為0.15 μg/mL多粘菌素B作用各重組菌1 h后，活菌計數(shù)。結(jié)果如圖3所示，在多粘菌素B作用下mgtC基因缺失株的存活率顯著低于親本菌株，說明mgtC基因的缺失影響了鼠傷寒沙門菌對多粘菌素B的耐受性。

2.4 重組菌酸性敏感性測定結(jié)果

酸適應(yīng)是將各菌株首先暴露于pH為5.5的LPM液體培養(yǎng)基，然后暴露于pH為3的LPM液體培養(yǎng)基中；然后計算存活率。結(jié)果如圖4所示，在酸適應(yīng)情況下，SM△mgtC的存活率為45%左右，親本菌株SM的存活率為60%左右，SM△mgtC與SM相比存活率差異顯著，回補株酸耐受能力得到恢復(fù)。由此表明mgtC基因的缺失影響了沙門菌的酸性耐受能力。

* P<0.05圖4 重組菌酸敏感性試驗結(jié)果Fig.4 Acid sensitivity tests of recombinant strains

2.5 重組菌生物被膜形成能力分析結(jié)果

結(jié)晶紫染色法定量分析菌株SM、SM△mgtC的生物被膜形成能力，染色結(jié)果如圖5所示，試驗結(jié)果如圖6所示，親本菌株SM顯示強黏附的生物被膜，SM△mgtC顯示弱黏附的生物被膜，基因缺失菌株SM△mgtCBF形成量僅為親本菌株的30%左右。表明mgtC基因參與沙門菌的生物被膜形成。

圖5 重組菌生物被膜染色分析Fig.5 Analysis of biofilm staining of recombinant strains

**P<0.05)圖6 重組菌生物被膜形成能力分析Fig.6 Analysis of biofilm formation abilities of recombinant strains

2.6 重組菌細胞黏附和侵襲力測定結(jié)果

細菌黏附率和侵襲力如圖7所示，SM△mgtC基因缺失株對巨噬細胞的黏附率為30%左右，與親本菌株的黏附率差異不明顯；感染1 h時，SM△mgtC胞內(nèi)活菌數(shù)(Log10CFU/mL)為5.3，親本菌株的胞內(nèi)載量為5.5，兩者相比差異不明顯(圖7)。說明mgtC基因的缺失不影響鼠傷寒沙門菌對細胞的黏附作用和侵襲力。

圖7 重組菌細胞黏附作用和侵襲力測定Fig.7 Adhesion and invasiveness tests of recombinant strains

* P<0.05, ** P<0.01圖8 重組菌胞內(nèi)增殖能力測定結(jié)果Fig.8 Intracellular viabilitytests of recombinant strains

2.7 重組菌的胞內(nèi)存活能力測定結(jié)果

如圖8所示，SM△mgtC胞內(nèi)增殖能力顯著低于親本菌株；在感染后的 8 h時，親本菌株和回補株在胞內(nèi)出現(xiàn)大量增殖，而基因缺失菌株SM△mgtC的胞內(nèi)載菌量 (LgCFU/mL)開始下降；感染12 h時，SM△mgtC的胞內(nèi)載菌量比親本株SM約降低了1，即細胞載菌量降低了約 10 倍；表明mgtC基因嚴重影響鼠傷寒沙門菌的胞內(nèi)存活能力。

2.8 小鼠體內(nèi)毒力試驗結(jié)果

體內(nèi)毒力試驗結(jié)果顯示，在12 d內(nèi)接種SM的小鼠全部死亡，而接種SM△mgtC的小鼠16 d內(nèi)的存活率為100%；接種7 d時，SM△mgtC組小鼠脾載菌量和肝臟載菌量比SM組小鼠載菌量低近2個數(shù)量級(圖9)。表明mgtC基因的缺失影響了沙門菌的毒力。

圖9 重組菌小鼠體內(nèi)載菌量測定Fig.9 Virulence tests in mice of recombinant strains

3 討 論

作為兼性胞內(nèi)寄生菌，沙門菌通過形成包裹菌體的內(nèi)噬體的方式在細胞內(nèi)進行增殖和擴散[8]。沙門菌能引起多種動物發(fā)病，造成成年動物持續(xù)時間可達數(shù)月的隱性感染和持續(xù)性感染，這給該病的防治帶來很大的困難[9]。鼠傷寒沙門菌是一種胞內(nèi)病原體，可以導(dǎo)致宿主局部或全身感染，通過研究毒力島基因mgtC的生物學(xué)功能，進一步闡釋鼠傷寒沙門菌的致病機制，也可為沙門菌病疫苗的研究提供了方向[10]。因此研究沙門菌致病性相關(guān)因子的功能和致病機制，可提供對于沙門菌病的防控策略。本研究主要圍繞沙門菌毒力島基因mgtC的生物學(xué)功能展開研究，探索其在沙門菌致病中的作用，為防治鼠傷寒沙門菌病的研究奠定基礎(chǔ)。

多粘菌素 B是一種陽離子抗菌肽，通過在微生物的細胞壁上打孔，形成一種大分子通道引起細菌內(nèi)容物的釋放，造成細菌死亡[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)通過多粘菌素 B的刺激，mgtC基因缺失菌株的存活率較親本菌株的低，表明mgtC基因?qū)κ髠抽T菌的抗菌肽耐受性產(chǎn)生了作用。生物被膜(Biofilm，BF)作為病原菌抵御藥物和免疫系統(tǒng)殺傷的有效物理屏障，對細菌的生長意義非凡。沙門菌在不利環(huán)境下生存甚至造成長期持續(xù)性感染的主要的原因是其在生長和感染過程中也能于多種附著物表面產(chǎn)生BF[13, 14]。通過結(jié)晶紫半定量法試驗，表明mgtC基因缺失株的生物被膜形成能力比親本菌株降低約 70 %，該結(jié)果進一步解釋了SM△mgtC抗菌肽耐受性降低的原因。

沙門菌在胞內(nèi)最常見的惡劣條件之一是酸脅迫，因此感知和響應(yīng)酸脅迫的能力對其生存至關(guān)重要。沙門菌通過復(fù)雜的酸存活系統(tǒng)響應(yīng)酸性pH變化，統(tǒng)稱為耐酸反應(yīng)(ATR)。當(dāng)鼠傷寒沙門菌在亞致死pH(pH 4.5～5.5)下體外生長一代后，沙門菌便獲得在極端酸性條件下(pH 3)存活的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，在酸適應(yīng)情況下，SM△mgtC的存活率為45%左右，與親本菌株SM相比存活率顯著降低。由此表明mgtC基因的缺失影響了沙門菌的酸性耐受能力，進一步解釋了mgtC基因缺失株喪失胞內(nèi)增殖能力的原因。小鼠體內(nèi)毒力感染試驗結(jié)果表明，注射SM的小鼠在12 d內(nèi)全部死亡，而注射SM△mgtC的小鼠存活率為100%，此時小鼠肝臟和脾臟的細菌載量顯著低于親本菌。

綜上，本研究利用λ-Red 同源重組技術(shù)構(gòu)建了mgtC基因缺失菌株，通過生長特性、酸性應(yīng)激、多粘菌素B敏感性、生物被膜檢測、胞內(nèi)存活和小鼠體內(nèi)毒力等生物學(xué)功能研究，證實mgtC基因與鼠傷寒沙門菌的致病性密切相關(guān)，有望進一步闡釋沙門菌的致病機制，為防治沙門菌病奠定研究基礎(chǔ)。