張李智桐 張佳敏 王衛(wèi) 劉達玉 唐楊 王柯

摘? 要：針對預(yù)調(diào)理火鍋牛肉的嫩化工藝，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶進行復(fù)配，研究2 種酶的復(fù)配比例、復(fù)合酶添加量及酶處理時間對牛肉持水力和硬度的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計對工藝條件進行優(yōu)化，確定復(fù)配酶法嫩化最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配比例1︰1.19、復(fù)合酶添加量0.085%、嫩化處理時間3.1 h，在確定的最佳工藝條件下加工預(yù)調(diào)理火鍋牛肉，并與常規(guī)產(chǎn)品對比，酶法嫩化后的牛肉持水力上升27%，肌原纖維小片化指數(shù)提升45%，膠原蛋白溶解度增加29%，剪切力降低29%，硬度降低69%，產(chǎn)品嫩度得到明顯改善。

關(guān)鍵詞：預(yù)調(diào)理;牛肉;酶法;嫩化工藝;響應(yīng)面法

Optimization of Enzymatic Tenderization of Pre-conditioned Hot Pot Beef by Response Surface Methodology

ZHANG Lizhitong¹， ZHANG Jiamin^1，*， WANG Wei¹， LIU Dayu²， TANG Yang²， WANG Ke³

（1.Meat Processing Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu ??610106， China; 2.College of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu? ?610106， China; 3.Sichuan Zhangfei Beef Co.Ltd.， Langzhong? ?610058， China）

Abstract： The tenderization of pre-conditioned hot pot beef using a mixture of papain and neutral protease was optimized by one-factor-at-a-time approach and response surface methodology. Mixing ratio between the two enzymes， enzyme dosage and treatment time were considered as independent variables， and water-holding capacity and hardness of beef as responses. It was found that the optimal process conditions were determined as follows： mixing ratio between papain and neutral protease 1：1.19， enzyme dosage 0.085%， and treatment time 3.1 h. Compared with the conventional product， the water-holding capacity of enzymatically tenderized beef increased by 27%， the myofibrillar fragmentation index （MFI） increased by 45%， the solubility of collagen increased by 29%， the shear force decreased by 29%， the hardness dropped by 69%， and the tenderness was significantly improved.

Keywords： pre-conditioning; beef; enzymatic method; tenderization process; response surface methodology

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211112-227

中圖分類號：TS251.52??????????? 文獻標志碼：A???????????????????? 文章編號：

引文格式：

張李智桐， 張佳敏， 王衛(wèi)， 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化預(yù)調(diào)理火鍋牛肉酶法嫩化工藝[J]. 肉類研究， 2022， 36（3）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211112-227.??? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Lizhitong， ZHANG Jiamin， WANG Wei， et al. Optimization of enzymatic tenderization of pre-conditioned hot pot beef by response surface methodology[J]. Meat Research， 2022， 36（3）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20211112-227.??? http：//www.rlyj.net.cn

牛肉是火鍋中的常用食材，不同部位的牛肉在食用品質(zhì)及加工性能等方面有著較大差異^[1-2]，如里脊、眼肉、胸肉等肉質(zhì)細嫩，適用于燒烤或炒制;肩胛肉肥瘦適中，牛肉風(fēng)味濃郁，適用于涮、燉、烤、燜等;肉排、肋腹肉等脂肪較多，筋肉相連，肉汁豐富，適合于做成牛排;而頸肉、腿肉等肌肉纖維較粗，肉質(zhì)較硬，一般用做碎肉或是拿來燉、煮湯，價值也相對較低。隨著近年來預(yù)調(diào)理食品的興起，將牛肉原料經(jīng)修割、切制、調(diào)味、腌制、嫩化等處理后制成的預(yù)調(diào)理火鍋牛肉產(chǎn)品也越來越豐富，但這類產(chǎn)品在涮煮過程中往往存在肉質(zhì)老、韌性大、煮制時間長等問題，影響其感官品質(zhì)^[3]。通過調(diào)理可改善牛肉感官品質(zhì)，提升嫩度，開發(fā)系列方便火鍋牛肉產(chǎn)品^[4]，以其食用方便、滋味鮮美、肉質(zhì)鮮嫩等特點，尤其適應(yīng)當(dāng)前廣大餐飲行業(yè)及家庭烹飪對美味、優(yōu)質(zhì)食材的需求^[5]，市場前景廣闊。

嫩度是評價肉品品質(zhì)的重要指標，也是消費者期待的指標之一^[6-7]。目前提高肉品嫩度的方法主要有物理方法、生物方法和化學(xué)方法^[8]。其中，利用蛋白酶對肉類原料進行嫩化是肉類嫩化的重要手段之一^[9]。肉類常用的嫩化蛋白酶有木瓜蛋白酶^[10-11]、中性蛋白酶^[12-13]、菠蘿蛋白酶^[14]及獼猴桃蛋白酶^[15-16]。通過前期的實驗篩選，針對預(yù)調(diào)理火鍋牛肉的嫩化，本研究選擇以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶作為嫩化酶，以硬度和持水力作為主要考察指標研究其嫩化效果^[17]，并通過響應(yīng)面分析確定中性蛋白酶和木瓜蛋白酶最佳復(fù)配比例及嫩化條件，為預(yù)調(diào)理牛肉的工業(yè)化加工提供理論依據(jù)。

1?? 材料與方法

1.1?? 材料與試劑

牛后腿肉，四川張飛牛肉有限公司。

木瓜蛋白酶（10⁵U/g）? ?南寧龐博生物工程有限公司;胰蛋白酶（10⁵ U/g）? ?和氏璧生物科技公司;硫酸、氯化鉀、石油醚、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯胺T、鹽酸、疊氮化鈉（均為分析純） ??成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 ??儀器與設(shè)備

BFBJ-70L制冷攪拌按摩機? ?杭州嘉興艾博公司;WR-40LR快速水分測定儀? ?武漢正元環(huán)境科技股份有限公司;TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀? ?英國Stable Micro Systems公司;HWS-12-5電熱恒溫水浴鍋? ?上海一恒實業(yè)有限公司;TG-15M冷凍離心機? ?濟南愛來寶醫(yī)療科技有限公司;SXT-06索氏抽提器? ?上海洪紀儀器設(shè)備有限公司。

1.3 ??方法

1.3.1?? 預(yù)調(diào)理牛肉制作工藝

將牛后腿肉剔除表面筋腱，順著肌肉纖維方向分割為5 cm寬的長條;將分割好的肉條置于滾揉機中，依次按比例加入腌料和酶，于4 ℃條件下滾揉20 min;滾揉結(jié)束后取出牛肉條，再在4 ℃條件靜置嫩化。腌料配方為：純凈水8.0%、白砂糖1.2%、食用鹽0.8%、復(fù)合磷酸鹽0.5%、味精0.1%。

1.3.2?? 單因素試驗

將中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)配后，加入磷酸鹽緩沖液稀釋到1 800 U/mL，在25 ℃條件下活化30 min備用。在腌制環(huán)節(jié)加入活化后的復(fù)合蛋白酶液進行嫩化處理，以持水力和硬度為評價指標，研究復(fù)合酶復(fù)配比例（體積比）、復(fù)合酶添加量及酶處理時間3 個單因素對牛肉性質(zhì)的影響^[18-19]。

單因素試驗設(shè)計如下：

復(fù)配比例設(shè)計：固定復(fù)合酶的添加量0.06%，酶處理時間2 h，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配比例分別為4︰1、2︰1、1︰1、1︰2、1︰4，測定牛肉的硬度和持水力。

復(fù)合酶添加量設(shè)計：固定復(fù)合酶的復(fù)配比例1︰1，酶處理時間2 h，分別添加0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%的復(fù)合酶，測定牛肉的硬度和持水力。

酶處理時間設(shè)計：固定復(fù)合酶的復(fù)配比例1︰1，添加量0.06%，分別將肉嫩化1、2、3、4、5 h，測定牛肉的硬度和持水力。

1.3.3?? 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，分析每個因素的最佳指標，再采用Box-Behnken試驗設(shè)計對復(fù)合酶的復(fù)配比例、復(fù)合酶添加量及酶處理時間進行響應(yīng)面優(yōu)化，具體條件見表1。

1.3.4?? 持水力測定

肉品持水力使用離心法進行測定^[20]。將處理后的牛肉剁成肉末，使用約10 g肉末測定其初始質(zhì)量，記為m₀;將肉末置于離心管中精確稱質(zhì)量，記為m₁，在18 ℃條件下以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，倒掉離心產(chǎn)生的水分，使用定量濾紙將管內(nèi)及肉末表面水分擦干后稱質(zhì)量，記為m₂，持水力按式（1）計算。

1.3.5? ?全質(zhì)構(gòu)剖面分析

使用質(zhì)構(gòu)儀對牛肉的硬度和剪切力進行測定，參考郭強^[21]的方法。樣品制備方法：將牛肉加工成表面積為3 cm×3 cm、高度為3 cm的肉塊，放入蒸煮袋中，再放入80 ℃的水浴鍋，至牛肉塊中心溫度為70 ℃時取出，擦干水分，然后修割成1 cm×1 cm×1 cm的方形肉丁。牛肉硬度采用全質(zhì)構(gòu)分析（TPA）進行測定，參數(shù)設(shè)定為：探頭型號P/36R，測試模式為壓縮，測前速率2.00 mm/s，測中速率1.00 mm/s，測后速率10.00 mm/s，應(yīng)變比50%，間隔時間10.0 s，觸發(fā)力0.05 g，環(huán)境溫度25 ℃，每組平行測定5 次，結(jié)果取平均值。剪切力參數(shù)設(shè)定為：探頭型號HDP/BSW，測試模式為壓縮，測前速率2.00 mm/s，測中速率1.00 mm/s，測后速率10.00 mm/s，選擇終點目標的模式為探頭位移25.00 mm，且觸發(fā)力為0.2 g，每個肉樣測定5 次，結(jié)果取平均值。

1.3.6?? 肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）測定

參考黃明等^[22]的方法。按照11.2 mmol/L K₂HPO₄、100 mmol/L KCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸、8.8 mmol/L KH₂PO₄、1 mmol/L MgCl₂、1 mmol/L NaN₃的比例配制MFI緩沖液。準確稱取4 g牛肉樣品，加入40 mL 2 ℃的MFI緩沖液，放入高速均質(zhì)機中，每次勻漿20 s，間隔1 min勻漿3 次。均質(zhì)后，將漿液移入離心管中，在1 000×g、2 ℃條件下離心15 min，完成后除去上清并重新添加40 mL 2 ℃的MFI緩沖液，在相同條件下重新離心15 min，除去上清并添加10 mL 2 ℃的MFI緩沖液使沉淀物懸浮。使用濾紙過濾懸浮液，并使用10 mL 2 ℃的MFI緩沖液沖洗離心管。使用雙縮脲法測定過濾后的懸浮液蛋白質(zhì)量濃度（ρ，mg/mL），在540 nm波長處使用MFI緩沖液調(diào)整懸浮液蛋白質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL，將MFI緩沖液添加量記為V（mL），MFI按式（2）計算。

MFI=ρ×V×200??????????? （2）

1.3.7?? 膠原蛋白溶解度測定

動物的結(jié)締組織中結(jié)構(gòu)蛋白主要由膠原蛋白構(gòu)成^[23]。膠原蛋白的含量多少影響肉質(zhì)的好壞，是判斷肉品嫩度的指標之一^[24]。酶將結(jié)締組織破壞后，膠原蛋白缺少束縛會變?yōu)橛坞x態(tài)，進而分解成各種氨基酸。膠原蛋白不能直接測定，所以一般測定其硝化分解的氨基酸，這些氨基酸中主體是羥脯氨酸，占分解氨基酸的14%～15%，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定^[25]，所以可以通過測定羥脯氨酸的含量，再乘以換算系數(shù)7.25得出膠原蛋白含量^[26]。羥脯氨酸的含量參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量》測定。

膠原蛋白溶解度測定：將10 g肉樣勻漿后置于離心機中，4 ℃、1 000×g離心10 min，靜置分層。上清液中的羥脯氨酸視為可溶性膠原蛋白，含量記為n₁（%），沉淀樣液（懸濁液）中的羥脯氨酸視為不可溶性膠原蛋白，含量記為n₂（%），膠原蛋白溶解度按式（3）計算。

1.4?? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Office Excel 2016和SPSS Statistics 26.0軟件進行處理，使用Origin 2017軟件作圖，采用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計。

數(shù)據(jù)規(guī)范化表達：持水力規(guī)范化得分、硬度規(guī)范化得分和規(guī)范化綜合評分分別按式（4）～（6）計算。

持水力規(guī)范化得分（X）=持水力值????????????????????? （4）

硬度規(guī)范化得分（Y）=|硬度值-14|×0.1???????????????? （5）

2?? 結(jié)果與分析

2.1?? 單因素試驗結(jié)果

2.1.1?? 木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配比例對牛肉持水力與硬度的影響

由圖1可知，復(fù)合酶復(fù)配比例對嫩化后牛肉持水力、硬度有不同影響，持水力隨著木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配比例增加而先增加后降低，當(dāng)復(fù)配比例接近1︰1時持水力達到最高，為72.34%。牛肉硬度隨復(fù)配比例增加整體呈現(xiàn)上升趨勢，且在復(fù)配比例達到1︰1之前牛肉硬度呈緩慢增長，而后隨著復(fù)配比例的增加，硬度的增長速率加快，所以應(yīng)該將復(fù)配比例控制在1︰1。郭強等發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶雖然都可以對肉的肌原纖維進行分解，達到嫩化的目的，但是它們的酶切作用位點、應(yīng)用范圍均不同，木瓜蛋白酶主要作用于肌原纖維及結(jié)締組織，中性蛋白酶主要作用于肌動纖維及彈性蛋白，肉品的持水力主要來源于肌原纖維中細胞的蛋白分子對水分基團的靜電作用^[27]，所以木瓜蛋白酶對肉品持水力的影響比中性蛋白酶大。綜上，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶最適復(fù)配比例為1︰1。

2.1.2?? 復(fù)合酶添加量對牛肉持水力與硬度的影響[l4]

由圖2可知，隨著復(fù)合酶添加量增加，牛肉持水力在酶添加范圍內(nèi)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢0.06%～0.10%存在最大值。當(dāng)復(fù)合酶添加量增加時，牛肉中肌纖維部分降解，肌絲間隙擴大，肌纖維包裹的蛋白和游離水接觸面積增加，肌肉能束縛更多的游離水，促使細胞的持水能力上升;當(dāng)復(fù)合酶添加量繼續(xù)增加時，由于牛肉肌纖維過度降解，無法對水分有很好的保持作用，導(dǎo)致持水力下降。硬度隨復(fù)合酶添加量增加一直呈下降趨勢，在添加量為0.10%時下降趨勢逐漸放緩。綜上，復(fù)合酶最適添加量為0.08%。

2.1.3?? 酶處理時間對牛肉持水力與硬度的影響

由圖3可知，隨著酶處理時間延長，牛肉持水力呈先上升后下降趨勢，且在3 h時持水力達到最高，為73.12%。牛肉硬度隨著處理時間延長而降低，在處理時間為3 h左右時下降幅度變小。由于酶在長時間降解牛肉的過程中會不斷破環(huán)牛肉的肌肉纖維，導(dǎo)致牛肉的肌原纖維斷裂過度，產(chǎn)生較大的空隙，持水能力逐步降低。中性蛋白酶的失活溫度為35～40 ℃，本實驗在25 ℃條件下進行，所以隨著時間的延長，中性蛋白酶活性逐漸降低，酶逐漸失活。綜上，牛肉最適處理時間為3 h。

2.2?? 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1?? 優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以復(fù)合酶中木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配比例（A）、復(fù)合酶添加量（B）和酶處理時間（C）為自變量，以持水力（X）和硬度（Y）通過數(shù)據(jù)規(guī)范化表達獲得的綜合評分（Z）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2。

將規(guī)范化綜合得分（Z）帶入Box-Behnken響應(yīng)面試驗方案中，利用Design-Expert進行回歸模型及方差分析，得到復(fù)配比例（A）、復(fù)合酶添加量（B）、酶處理時間（C）與規(guī)范化綜合得分（Z）的二階多項式：Z=40.23+1.76A+1.12B+2.14C+2.12AB+2.85AC-2.28BC-6.00A²-9.89B²-10.02C²。

由表3可知，模型的F值為26.40且P<0.01，證明模型極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。R²=0.971 4>0.9，證明相關(guān)系數(shù)與實驗值相關(guān)性高，模型較好，修正確定系數(shù)（R²_Adj）=0.934 6>0.8，預(yù)測相關(guān)系數(shù)（R²_Pred）=0.716 9，說明模型需要簡化，但對實驗結(jié)果影響不大。失擬項P=0.108 9>0.05，證明模型擬合程度高，分析結(jié)果可用于預(yù)測實驗結(jié)果。其中一次項C，二次項A²、B²、C²對結(jié)果影響極顯著（P<0.01）。[l5]

由圖4可知，交互項AC、BC有交互作用明顯，說明復(fù)配比例和酶處理時間之間、復(fù)合酶添加量和酶處理時間之間交互作用明顯。AB之間交互作用不明顯，即復(fù)合酶添加量和復(fù)配比例交互作用不明顯^[28]。

2.2.2?? 模型優(yōu)化及驗證實驗

通過回歸模型計算出復(fù)合酶的最佳實驗條件：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶復(fù)配比例1︰1.19、酶處理時間3.13 h、復(fù)合酶添加量0.085%，綜合評分為40.57。為了便于操作，實際工藝參數(shù)為：復(fù)配比例1︰1.19、復(fù)合酶添加量0.085%、酶處理時間3.1 h。使用實際工藝再次進行牛肉嫩化實驗，得到的結(jié)果表明，牛肉持水力為75.14%，硬度為14.35 N，綜合評分為40.24，實際的實驗結(jié)果與模擬計算的結(jié)果偏差為2.58%，說明該配方具有可行性。

2.3?? 酶法嫩化處理牛肉的肉質(zhì)特性分析

按照最佳嫩化工藝加工預(yù)調(diào)理牛肉，并與未進行嫩化的對照組進行比較。由表4可知，牛肉持水力在酶的嫩化作用后有極顯著提升（P<0.01），說明經(jīng)過嫩化的牛肉在蒸煮過程中蒸煮損失將減少，并且能很好保留其營養(yǎng)物質(zhì)。MFI是一種代表肌原纖維分解程度的指標，在蛋白酶的剪切作用下，牛肉的肌肉纖維被分解，形成小片段。當(dāng)MFI越大時，證明纖維組織斷裂程度越大^[29]。牛肉嫩化前后的MFI提升45%，表明復(fù)合酶對牛肉肌肉纖維的分解作用顯著。另一方面，膠原蛋白溶解度是一種影響肉嫩度的指標^{[16，30]}。通過復(fù)合酶的作用，膠原蛋白中的大分子蛋白被分解成小分子蛋白，在降低嫩度的同時，對肉品的理化性質(zhì)也有提升，所以膠原蛋白溶解度越高，復(fù)合酶對產(chǎn)品品質(zhì)的改善越佳。在復(fù)合蛋白酶作用下，牛肉中膠原蛋白溶解度增加29%。經(jīng)過酶法嫩化后的預(yù)調(diào)理火鍋牛肉剪切力和硬度均顯著降低（P<0.05），證明嫩化酶能夠有效改善火鍋牛肉的肉質(zhì)。

通過單因素試驗和響應(yīng)面分析試驗，酶處理時間對牛肉嫩化程度的影響最為顯著（P<0.01）。復(fù)合酶對牛肉的嫩化有顯著效果，促使牛肉中的蛋白初步分解，使得持水力增加，從而使得牛肉的顯色更好，口感更飽滿，嫩度上升。嫩化時間超過4 h后，肌肉纖維被破壞嚴重，牛肉的持水力降低，口感變柴、變綿，失去嫩化的意義，因此應(yīng)該控制酶處理時間、溫度、酶添加量等指標。本研究從牛肉的理化性質(zhì)和質(zhì)構(gòu)等方面進行研究，得出復(fù)合酶對牛肉產(chǎn)品有改善作用，但是尚未對產(chǎn)品的風(fēng)味變化進行研究，所以復(fù)合酶是否會對產(chǎn)品整體風(fēng)味產(chǎn)生影響，還有待繼續(xù)研究。

4?? 結(jié) ?論

采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對牛肉進行處理，能夠有效改善預(yù)調(diào)理火鍋牛肉的肉質(zhì)。采用BOX-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計對2 種酶的復(fù)配比例、復(fù)合酶添加量、酶處理時間進行優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳嫩化條件為：木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)配比例1︰1.19、復(fù)合酶添加量0.085%、酶處理時間3.1 h。在確定的最佳工藝條件下加工預(yù)調(diào)理火鍋牛肉，并與常規(guī)產(chǎn)品對比，酶法嫩化后牛肉的持水力上升27%，MFI提升45%，膠原蛋白溶解度增加29%，剪切力降低29%，硬度降低69%，產(chǎn)品嫩度得到明顯改善。

參考文獻：