曾穎怡，龍 華，衛(wèi)國(guó)英，吳 瓊

(中國(guó)計(jì)量大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

0 引 言

靶向治療是一種新型的腫瘤精準(zhǔn)治療方法，可通過(guò)磁性載體將藥物輸運(yùn)到病灶區(qū)并釋放，有針對(duì)性殺死癌細(xì)胞。因此，磁性納米載體的結(jié)構(gòu)控制及其藥物輸運(yùn)性能是靶向治療中的關(guān)鍵因素[1-5]。

Fe3O4納米顆粒具有良好的磁性能，化學(xué)穩(wěn)定性，生物相容性以及易于加工和修飾等優(yōu)點(diǎn)，成為一種優(yōu)異的生物醫(yī)學(xué)材料[6]。Fe3O4納米顆粒在室溫下具有較強(qiáng)的鐵磁性和電導(dǎo)率，其尺寸在低于一定的臨界值時(shí)(約為20 nm)，具有特殊的超順磁性能[7]。以上特性使得Fe3O4納米顆?？梢詮V泛應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如藥物傳遞[8]，磁熱療[9]，核磁共振成像和診斷[10]等等。

盡管Fe3O4納米顆粒有著優(yōu)異的物理化學(xué)性能，但是如何提高其穩(wěn)定性以及減少顆粒的團(tuán)聚現(xiàn)象仍是現(xiàn)今重要的研究課題[11]。單獨(dú)的Fe3O4納米顆粒由于納米尺寸效應(yīng)極易團(tuán)聚和載藥量有限，限制了其在靶向給藥方面的應(yīng)用。為解決團(tuán)聚現(xiàn)象通常需要對(duì)Fe3O4納米顆粒進(jìn)行表面修飾[12]，提高Fe3O4納米顆粒的穩(wěn)定性和分散性[13-15]，但同時(shí)要考慮對(duì)其磁性的影響及提高載藥量和生物相容性。

為了降低Fe3O4納米顆粒的團(tuán)聚現(xiàn)象，提高其載藥量，本文通過(guò)水解反應(yīng)包覆SiO2層，再通過(guò)水熱反應(yīng)包覆碳層，最后刻蝕掉SiO2，形成了一種Fe3O4@C核殼結(jié)構(gòu)納米材料。期望這種優(yōu)化后的核殼結(jié)構(gòu)相比于普通的核殼結(jié)構(gòu)可以降低對(duì)Fe3O4納米顆粒磁性能的影響，提高復(fù)合材料的藥物負(fù)載性能，探究其作為藥物載體的性能。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原材料

氯化鐵(FeCl3·6H2O，AR)、碳酸氫銨(NH4HCO3)、正硅酸四乙酯(C8H12O8Si/TEOS)、氨水(NH3·H2O)、乙二醇(C2H6O2)、無(wú)水乙醇(C2H5OH/ETOH)、葡萄糖(C6H12O6·H2O)、鹽酸阿霉素(DOX·HCl)、氯化鉀(KCl)、氫氧化鈉(NaOH)，均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，純度均為AR。實(shí)驗(yàn)中所使用的水均為去離子水。

1.2 樣品制備

1.2.1 Fe3O4@C納米顆粒的制備

利用溶劑熱法制備Fe3O4納米顆粒[12-13]，將0.5 mol/L FeCl3·6H2O、1 mol/L NH4HCO3溶入到30 mL乙二醇中形成反應(yīng)體系在200 ℃的高壓反應(yīng)釜里反應(yīng)12 h制成Fe3O4納米顆粒。取以上制備好的0.1 g Fe3O4和1 mol/L C6H12O6·H2O、0.2 mol/L KCl添加到30 mL去離子水中形成反應(yīng)體系在140 ℃的高壓反應(yīng)釜里反應(yīng)制成，反應(yīng)6、12 h制成包覆不同厚度C層的Fe3O4@C納米顆粒。

1.2.2 Fe3O4@C納米顆粒的界面改性

Fe3O4@C納米顆粒界面改性通過(guò)正硅酸乙酯(TEOS)水解反應(yīng)在Fe3O4表面包覆SiO2層，接著通過(guò)水熱反應(yīng)包覆碳層，最后利用NaOH刻蝕掉SiO2，形成了一種Fe3O4@C核殼結(jié)構(gòu)納米材料。將0.1 g 制備好的Fe3O4顆粒加入到1 mmol正硅酸四乙酯(TEOS)、80 mL C2H5OH(無(wú)水乙醇)、1 mL NH3·H2O、19 mL去離子水的混合溶液中包覆C層制備Fe3O4@SiO2@C，用NaOH刻蝕Fe3O4@SiO2@C得到Fe3O4@C。通過(guò)控制TEOS的添加量和包覆C層時(shí)間制成6種Fe3O4@C， 分別為T(mén)EOS 10 mmol/L，C層包覆6 h、TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h、TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h、TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h、TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h、TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 h的Fe3O4@C納米顆粒。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

接種細(xì)胞：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以每孔4 000～10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板；將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)15 h；加入不同濃度的顆粒(50，100，200，500，1 000和2 000 μg· mL)；處理一段時(shí)間后，吸取孔內(nèi)含有藥物的培養(yǎng)基，加入100 μL CCK-8試劑(CCK-8稀釋比例為V(CCK-8)∶V(培養(yǎng)基)=10∶90)；在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔450 nm處吸光度。

1.4 藥物負(fù)載和釋放實(shí)驗(yàn)

量取25 mL去離子水，溶解1 mg鹽酸阿霉素(DOX·HCl)，稱(chēng)量60 mg待測(cè)試顆粒，加入DOX·HCl溶液中，混合均勻。將上述混合液放入27 ℃的恒溫油浴鍋中，機(jī)械攪拌24 h后，在60 ℃的烘箱中烘干6 h，上層清液封裝儲(chǔ)存，待測(cè)試。利用朗伯-比爾定律公式計(jì)算不同類(lèi)型的Fe3O4@C吸附后溶液中DOX·HCl的濃度。

根據(jù)式(1)計(jì)算藥物負(fù)載率：

藥物負(fù)載率(%) = (1-Cf/Ct)×100%

(1)

式中，Cf為游離在溶液中藥物的量；Ct為投放的藥物總量。

在不同pH值(5.0和7.4)條件下測(cè)試藥物釋放情況，通過(guò)比爾-朗伯公式計(jì)算出溶液中釋放的藥物濃度，進(jìn)而可得釋放的藥物質(zhì)量。

1.5 樣品表征

采用透射電子顯微鏡(FEI Tecnai F20)對(duì)Fe3O4@C納米顆粒的形貌進(jìn)行分析；通過(guò)紅外光譜分析(FTIR)對(duì)復(fù)合界面結(jié)構(gòu)改性后Fe3O4@C磁性納米復(fù)合材料的官能團(tuán)進(jìn)行表征；通過(guò)BET方法計(jì)算材料的比表面積，通過(guò)BJH模型探究材料的孔徑分布以及紫外-可見(jiàn)光吸收光譜分析(UV-Vis)對(duì) Fe3O4@C納米顆粒的藥物負(fù)載率、釋放能力進(jìn)行測(cè)試。使用磁性綜合物理性能測(cè)量系統(tǒng)(PPMS，Dynacool 9T)測(cè)試得到飽和磁化強(qiáng)度Ms，矯頑力Hc和剩余磁化強(qiáng)度Mr。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@C復(fù)合納米顆粒的界面改性及微結(jié)構(gòu)

本文探究了不同正硅酸乙酯(TEOS)的添加量及不同C層包覆時(shí)間對(duì)Fe3O4@C納米顆粒的微結(jié)構(gòu)及藥物輸運(yùn)性能的影響。圖1為改變C層與Fe3O4界面結(jié)構(gòu)條件下所制備的Fe3O4@C納米顆粒的透射電鏡結(jié)果(TEM)。圖1中黑色顆粒為Fe3O4納米顆粒，透明部分為碳球顆粒， Fe3O4@C納米顆粒均呈現(xiàn)出近球形狀，顆粒粒徑大小約50 nm。裸露的Fe3O4納米顆粒由于其固有的磁偶極子的相互作用極易于結(jié)塊，分散性差。相比于純的Fe3O4納米顆粒，C層包覆6 h后的Fe3O4納米顆粒通過(guò)界面改性后的分散性顯著提升(圖1(a)和(b))。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入的TEOS量越多，顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象越明顯(圖1(f))，原因可能是生成的SiO2含量越多，顆粒分散性變差，導(dǎo)致包覆碳層時(shí)在團(tuán)聚體外面包覆，最后刻蝕掉SiO2后Fe3O4顆粒團(tuán)聚明顯。

圖1 Fe3O4@C復(fù)合納米顆粒界面改性后的TEM(a)TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(b) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h;(c) TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h;(e) TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h;(f) TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 h(其它實(shí)驗(yàn)條件見(jiàn)1.2樣品制備)Fig 1 TEM after interface modification of Fe3O4@C composite nanoparticles

圖2 復(fù)合界面改性的Fe3O4@C納米顆粒的紅外光譜圖(a)TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(b) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h;(c) TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h;(e) TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h;(f) TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 hFig 2 Infrared spectra of Fe3O4@C nanoparticles modified by the composite interface

2.2 Fe3O4@C納米顆粒的藥物輸運(yùn)性能

藥物載體的輸運(yùn)性能主要由顆粒的磁性能和比表面積等性能表征。核殼結(jié)構(gòu)的磁性納米復(fù)合材料中磁芯的磁性能會(huì)受到殼層的影響，殼層越厚，磁芯的磁性能下降越明顯[19]。通過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)C層與Fe3O4顆粒的界面結(jié)構(gòu)，既可以保留Fe3O4納米顆粒的磁性能，也可以提高Fe3O4納米顆粒的分散性能，增加其比表面積。我們對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件下制備的Fe3O4@C磁性納米復(fù)合材料進(jìn)行了磁滯回線(xiàn)測(cè)試。

圖3為不同條件下合成的Fe3O4@C納米顆粒的磁滯回線(xiàn)。結(jié)果表明，不同合成條件下的Fe3O4@C納米顆粒的磁滯回線(xiàn)剩磁和矯頑力接近為0，呈現(xiàn)超順磁行為，且其比飽和磁化強(qiáng)度受合成條件影響不大，說(shuō)明界面改性處理對(duì)磁性能影響較小，主要原因在于非磁性C層的厚度較薄，不足以引起比飽和磁化強(qiáng)度的顯著變化。

經(jīng)復(fù)合界面結(jié)構(gòu)改性的Fe3O4@C納米顆粒的N2吸附-脫附等溫曲線(xiàn)和孔徑分布圖如4所示。根據(jù)滯后環(huán)可看出，不同條件下制備的Fe3O4@C納米顆粒均是IV型等溫線(xiàn)，屬于介孔顆粒。根據(jù)孔徑分布圖可以觀察出顆粒的孔徑大小和分布的均一程度，這六種顆粒的均一程度相差不大，具體的差別主要體現(xiàn)在孔徑的大小上。結(jié)果顯示TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的比表面積最大，孔徑相對(duì)較小。

圖3 界面改性的Fe3O4@C納米顆粒磁滯回線(xiàn)(a)TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(b) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h;(c) TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h;(e) TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h;(f) TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 hFig 3 Hysteresis loops of Fe3O4@C nanoparticles modified by interface

圖4 界面改性的Fe3O4@C納米顆粒的N2吸附-脫附等溫曲線(xiàn)和孔徑分布圖(a)TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(b) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h;(c) TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 10 mmol/L，C層包覆12 h;(e) TEOS 15 mmol/L，C層包覆12 h;(f) TEOS 20 mmol/L，C層包覆12 hFig 4 N2 adsorption-desorption isotherm and pore size distribution of interfacial modified Fe3O4@C nanoparticles

2.3 Fe3O4@C納米顆粒的細(xì)胞毒性及藥物負(fù)載能力

圖5 (a)是TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的細(xì)胞增殖率，圖5(b)是TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆12 h的Fe3O4@C納米顆粒的細(xì)胞增值率。圖中虛線(xiàn)是4組空白組培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞增殖率的平均值，TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒為0.154，TEOS添加量 10 mmol/L， C層包覆12 h的Fe3O4@C納米顆粒為0.157。從圖中可以看出這兩種顆粒的增值率都是大于對(duì)照組的細(xì)胞增值率的，并且隨著加入的待測(cè)物濃度增加，細(xì)胞增殖率也顯著提升，說(shuō)明這種納米顆粒無(wú)細(xì)胞毒性。

圖5 (a) TEOS添加量 10 mmol/L，C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的細(xì)胞增殖率；(b) TEOS添加量10 mmol/L，C層包覆12 h的Fe3O4@C納米顆粒的細(xì)胞增殖率(其他實(shí)驗(yàn)條件見(jiàn)1.3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))Fig 5 (a) Cell proliferation rate of Fe3O4@C nanoparticles coated in C layer for 6 h with 10 mmol/L of TEOS;(b) the cell proliferation rate of Fe3O4@C nanoparticles coated with C layer for 12 hours after the addition of 10 mmol/L TEOS (see 1.3 cytotoxicity test for other experimental conditions)

為研究經(jīng)界面改性后的Fe3O4@C藥物吸附效果，我們采用了紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)不同類(lèi)型的Fe3O4@C進(jìn)行測(cè)試。圖6是測(cè)試顆粒吸附藥物前后的UV-Vis，通過(guò)觀察顆粒吸附藥物前后吸光度曲線(xiàn)變化可以看出TEOS 10 mmol/L， C層包覆6 h、TEOS 15 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的吸附效果較好，經(jīng)過(guò)模擬室溫下24 h的吸附后， 480 nm處的特征峰下降明顯，尤其是TEOS 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒特征峰處吸光度基本為0，表明顆粒對(duì)藥物的吸附效率接近100 %。

圖6 Fe3O4@C納米顆粒吸附藥物前后溶液的UV-Vis(a) Fe3O4納米顆粒；(b) C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒;(c) TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h;(d) TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 hFig 6 Fe3O4@C UV-Vis of solution before and after drug adsorption by nanoparticles

由藥物負(fù)載率的計(jì)算公式，可以得出改性后的Fe3O4@C納米顆粒對(duì)于DOX·HCl的吸附效果良好，負(fù)載率均在97 %以上，TEOS 15 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒的藥物負(fù)載率為97.52%，與純Fe3O4納米顆粒和Fe3O4@C納米顆粒的藥物負(fù)載率相比均有所提升。其中，效果最好的為T(mén)EOS 10 mmol/L，C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒，負(fù)載率達(dá)到98.9%(圖6 (c))。

2.4 經(jīng)界面改性后的Fe3O4@C納米顆粒的藥物釋放能力

正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境pH值不同[21]。血液pH值和正常細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境pH值約為7.4，而癌細(xì)胞周?chē)腥樗岷吞妓岬姆e累，導(dǎo)致癌細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境較低(5.8～7.8)[22]?；诖耍疚脑O(shè)計(jì)了兩個(gè)pH值釋放環(huán)境，pH值=5.0和7.4。外殼層通過(guò)pH調(diào)控釋放藥物的原理是殼層表面具有弱酸性或弱堿性基團(tuán)，當(dāng)所處環(huán)境pH發(fā)生變化時(shí)，會(huì)使其發(fā)生溶解度的變化，或者伸縮變化，從而使藥物從介孔的孔道中釋放出來(lái)。根據(jù)對(duì)不同類(lèi)型的Fe3O4@C藥物負(fù)載性能研究，我們發(fā)現(xiàn)TEOS 10 mmol/L， C層包覆6 h、TEOS 15/L mmol，C層包覆6 h的TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h的Fe3O4@C 3種納米顆粒對(duì)DOX·HCl的吸附效果良好，負(fù)載率最高達(dá)到98.9%，于是對(duì)這3種吸附過(guò)藥物的顆粒進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。

在pH值為5的條件下，添加TEOS 10 mmol/L， C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒藥物釋放率達(dá)到了81.70%。而在pH值為7.4的條件下，添加TEOS 10 mmol/L，C層包覆6 h的Fe3O4@C納米顆粒藥物釋放率為65.82%。

圖7(a)是3種納米復(fù)合材料分別在pH值為5.0和pH值為7.4的環(huán)境下的釋放率與時(shí)間的曲線(xiàn)對(duì)比圖。隨著DOX·HCl的釋放，負(fù)載的DOX·HCl減少，PBS中的DOX·HCl增加，PBS中的DOX·HCl會(huì)抑制釋放速率。同時(shí)可以觀察出顆粒在前10 h釋放藥物最快。同一納米顆粒不同pH值環(huán)境下，顆粒在pH值為5.0時(shí)釋放率要高于pH值為7.4時(shí)的釋放率，說(shuō)明該顆粒在酸性環(huán)境中藥物釋放效果更好。這主要是由于靜電相互作用有助于pH控制釋放速率，隨著pH值從7.4降至5.0，顆粒表面的zeta電位升高，這意味著表面的負(fù)電荷減少，負(fù)電荷越少意味著顆粒與DOX·HCl之間的相互作用越弱，因此DOX·HCl更傾向于在低pH值的環(huán)境中釋放[22]。值得注意的是，即使在很長(zhǎng)一段時(shí)間后釋放緩慢，釋放也并沒(méi)有達(dá)到平穩(wěn)。如果繼續(xù)投入新鮮的磷酸緩沖溶液，藥物釋放還會(huì)繼續(xù)發(fā)生。

為探究藥物釋放的動(dòng)力學(xué)行為，我們根據(jù)Higuchi模型進(jìn)行了線(xiàn)性擬合分析[23]，擬合結(jié)果見(jiàn)圖7 (b)，結(jié)果表明在兩種環(huán)境中第一段釋放過(guò)程均在8 h左右結(jié)束。曲線(xiàn)a在第一段釋放曲線(xiàn)中的斜率較大，是因?yàn)檫@段時(shí)間的釋放是由于靜電相互作用造成的。DOX·HCl在中性環(huán)境中帶正電，藥物載體表面具有大量的-OH，與DOX·HCl有較強(qiáng)的靜電相互作用，而在酸性環(huán)境中相互之前的作用較弱，加速了藥物的釋放。曲線(xiàn)b在第二段釋放過(guò)程中斜率較大，是因?yàn)榈诙酷尫胖饕峭ㄟ^(guò)介孔的孔道所調(diào)節(jié)的，同種顆粒具有相同的介孔孔道，酸性環(huán)境中藥物在第一階段釋放較多，后續(xù)實(shí)驗(yàn)就會(huì)更加緩慢。同時(shí)，不管在何種環(huán)境，藥物的釋放速率都會(huì)越來(lái)越慢，這是因?yàn)镻BS溶液中越來(lái)越多的DOX·HCl抑制了藥物的釋放。

圖7 復(fù)合界面改性的Fe3O4@C的藥物釋放率與時(shí)間曲線(xiàn)與藥物載體不同pH的釋放動(dòng)力學(xué)擬合曲線(xiàn):曲線(xiàn)a為T(mén)EOS 10 mmol/L，C層包覆6 h(pH=5.0)；曲線(xiàn)b為 TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h(pH=5.0); 曲線(xiàn)c為 TEOS 20 mmol/L，C層包覆6 h(pH=5.0); 曲線(xiàn)d為T(mén)EOS 10 mmol/L，C層包覆6 h(pH=7.4); 曲線(xiàn)e為 TEOS 15 mmol/L，C層包覆6 h(pH=7.4); 曲線(xiàn)f為T(mén)EOS 20 mmol/L，C層包覆6 h(pH=7.4)Fig 7 Drug release rate and time curve of Fe3O4@C modified by composite interface and kinetics fitting curves of drug carrier release at different pHs

3 結(jié) 論

對(duì)Fe3O4@C復(fù)合納米顆粒進(jìn)行了界面改性，研究表明界面改性后的顆粒分散性明顯增加，增加了顆粒的表面利用率及對(duì)藥物的負(fù)載量。

(1)合成了一系列復(fù)合界面結(jié)構(gòu)改性后的Fe3O4@C磁性納米復(fù)合材料，相比于純的Fe3O4納米球，這種界面改性的顆粒分散性明顯增加。

(2)核殼結(jié)構(gòu)磁性納米復(fù)合材料表面含有—OH，—CHO基團(tuán)，均為親水性基團(tuán)，可以作為載藥系統(tǒng)用于負(fù)載親水性藥物。經(jīng)界面改性后的Fe3O4@C復(fù)合納米磁性顆粒呈現(xiàn)超順磁行為，界面改性對(duì)其磁性能影響較小。

(3)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明該復(fù)合結(jié)構(gòu)顆粒無(wú)有細(xì)胞毒性。對(duì)DOX·HCl吸附24 h之后，發(fā)現(xiàn)對(duì)DOX·HCl的負(fù)載率可以達(dá)到98.9 %。