叢琳，袁婧，劉文俊，孫志宏

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010010)

0 引言

酸馬奶在吉爾吉斯斯坦又稱為“Kymyz”，被當(dāng)?shù)厝俗u(yù)為國飲，通常用來招待遠(yuǎn)方貴客。傳統(tǒng)酸馬奶以木桶、瓷缸或塑料桶為容器，新鮮馬奶為原料，前一天的酸馬奶作為發(fā)酵劑，通過攪打，低溫自然發(fā)酵而成。是一種主要產(chǎn)物為乳酸，酒精含量低的發(fā)酵乳飲品。相較于鮮馬乳，酸馬奶有更高的營養(yǎng)價(jià)值和保健效果。本研究采用純培養(yǎng)方法對(duì)吉爾吉斯斯坦地區(qū)酸馬奶中的乳酸菌進(jìn)行分離純化，應(yīng)用16S rRNA基因序列分析方法對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，結(jié)合PacBio SMRT三代測(cè)序技術(shù)對(duì)酸馬奶樣品中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，以更好了解該地區(qū)自然發(fā)酵乳制品中乳酸菌的組成與種類，為乳酸菌的研究和開發(fā)利用提供菌株，為吉爾吉斯斯坦乳制品中微生物多樣性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

本研究10份酸馬奶樣品采集自吉爾吉斯斯坦境內(nèi)，位于比什凱克、阿倫和奧什3個(gè)不同地區(qū)，所有樣品由當(dāng)?shù)啬撩癫捎脗鹘y(tǒng)自然發(fā)酵的方法家庭手工制作?，F(xiàn)場(chǎng)將樣品混勻后采集，一式兩份。采集的樣品一部分置于裝有0.5 g滅菌緩沖劑（M淀粉:MCaCO3=50∶1）的2 mL無菌凍存管中，另一部分裝入無菌離心管中，加入RNA/DNA樣品保護(hù)液并充分混勻、標(biāo)號(hào)。樣品運(yùn)輸全程保持低溫（2~8℃），到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行乳酸菌分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，宏基因組測(cè)序樣品于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器

MRS培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Agar Powder，北京康倍斯(chembase)科技有限公司）；TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生化科技（北京）有限公司；DneasyPowerFood Kit，德國QIAGEN公司；KAPA HiFi HotStartReadyMix PCR Kit，美國KAPA公司。

微量紫外分光光度計(jì)，美國Nanodrop公司；PCR儀，美國Life Technologies公司；電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，美國UVP公司；三代測(cè)序儀PacBio RS II，美國Pacific Biosciences公司。

1.3 乳酸菌分離與鑒定

自然發(fā)酵乳制品中乳酸菌計(jì)數(shù)采用傾注培養(yǎng)法[1]。將樣品充分混勻后用10倍梯度稀釋法[2]選取合適的濃度梯度（10-5，10-6，10-7）對(duì)自然發(fā)酵乳制品進(jìn)行梯度稀釋。吸取1 mL樣品稀釋液于未凝固的MRS固體培養(yǎng)基中搖勻，待培養(yǎng)基徹底干透后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱需氧培養(yǎng)48~72 h。同時(shí)，吸取與活菌計(jì)數(shù)相同稀釋倍數(shù)的樣品稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，待菌落形成后，挑取形態(tài)特征各異的單個(gè)菌落在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上采用平板劃線法進(jìn)行2~3次的劃線純化[3]。把鏡檢結(jié)果為單一菌落形態(tài)的菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將經(jīng)革蘭氏染色后呈陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)顯陰性、菌落無芽孢且形態(tài)均一的純培養(yǎng)物定為疑似乳酸菌，加入適量脫脂乳保護(hù)劑進(jìn)行保藏并編號(hào)。

乳酸菌分離株DNA提取使用TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒，按照說明書的步驟嚴(yán)格操作。取得DNA后，用ND-1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的純度。將符合要求的DNA作為擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增體積為50μL的PCR反應(yīng)，具體包括模板DNA（100~300 ng/mL）2μL，細(xì)菌通用引物正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）1.5μL，反向引物1492R（5′-ACCTTGTTACGACTT-3′）1.5μL，引物濃度均為10μmol/L，10×PCR Buffer（含Mg2＋離子）5μL，Taq DNA polymerase 0.5μL，dNTP 4μL，ddH2O 35.5μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃末端延伸10 min[4]。

上述PCR產(chǎn)物需在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)，將滿足測(cè)序要求的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在低溫條件下送往上海美吉生物公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序。

1.4 同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

運(yùn)用DNAStar 5.01軟件中的SeqMan拼接經(jīng)上海美吉生物公司測(cè)序的16S rRNA序列，將拼接好的序列在NCBI（National Center for Biotechnology Infornation）上進(jìn)行BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性比對(duì)，將同源性大于99%且基因片段吻合的DNA序列認(rèn)定為與模式菌株屬于同一菌種，運(yùn)用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建菌株序列進(jìn)化樹，比較它們之間的親緣關(guān)系進(jìn)化距離。

1.5 酸馬奶樣品中宏基因組DNA的提取

使用DneasyPowerFood Kit，2 mL tubes（100）抽提樣品宏基因組DNA，其步驟參照試劑盒中的說明書[5]。用ND-1000紫外分光光度計(jì)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取DNA的濃度、純度與完整度，將DNA純度OD260/280處于1.8~2.0之間，濃度大于20 ng/μL，且片段化程度小的DNA置于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)菌16S rRNA基因序列全長擴(kuò)增

將提取好的細(xì)菌基因DNA作為模板，通過16SrRNA基因序列通用引物（正向引物27F和反向引物1492R）進(jìn)行擴(kuò)增，通過在引物5′端加不同的核苷酸標(biāo)簽（Barcode）來區(qū)分各樣品。PCR擴(kuò)增所需的試劑盒為KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR Kit，擴(kuò)增反應(yīng)體系為50μL：10μmol/L正反向引物各1.5μL，模板DNA 1.5μL，模板濃度需小于100 ng/μL，KAPA Mix 25.0μL，最后用ddH2O補(bǔ)足體系至50μL。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min，98℃變性20 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃末端延伸2 min[6]。

1.7 PacBio SMRT測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

將經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后符合要求的PCR產(chǎn)物純化后混樣，用SMRTbell Template Prep Kit 1.0試劑盒對(duì)混樣DNA進(jìn)行DNA損傷修復(fù)和DNA雙鏈部分缺失堿基修復(fù)。修復(fù)純化后的DNA加接頭，以Qubit 2.0熒光計(jì)檢測(cè)制備文庫的濃度，再用PacBio RS II三代測(cè)序儀對(duì)構(gòu)建完成的DNA文庫進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。對(duì)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，具體的條件為：測(cè)序的最小循環(huán)次數(shù)為5；測(cè)序的最小預(yù)測(cè)精確度為90%；測(cè)序時(shí)DNA插入片段應(yīng)屬于1 400~1 800 nt之間。將滿足要求的高質(zhì)量序列根據(jù)每個(gè)樣品的Barcode信息進(jìn)行去除Barcode處理[7]，用QIIME平臺(tái)對(duì)符合要求的高質(zhì)量序列進(jìn)行微生物組分析，通過柱形圖、折線圖、散點(diǎn)圖展現(xiàn)不同水平上不同自然發(fā)酵酸馬奶中的的菌群結(jié)構(gòu)，用Mann-Whitny/Kruskal-Wallis檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)吉爾吉斯斯坦不同地區(qū)酸馬奶菌落結(jié)構(gòu)的差異性，應(yīng)用R 3.5.0和Origin 2019等軟件對(duì)QIIME分析的微生物組數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵酸馬奶中乳酸菌總數(shù)計(jì)數(shù)與分離

本研究中10份自然發(fā)酵酸馬奶通過純培養(yǎng)后的乳酸菌總數(shù)在6.80×105~3.04×109mL-1范圍之間，具體結(jié)果如表1所示。

表1 吉爾吉斯斯坦酸馬奶中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果 mL-1

乳酸菌總數(shù)能夠反映發(fā)酵乳制品的新鮮程度，展現(xiàn)發(fā)酵乳制品在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等過程中菌株的生長狀態(tài)。孫天松等[1]曾研究哈薩克斯坦的不同地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中的乳酸菌多樣性，揭示該地區(qū)酸馬奶樣品乳酸菌總數(shù)均大于1.00×106mL-1。由此可以推測(cè)吉爾吉斯斯坦地區(qū)自然發(fā)酵酸馬奶的新鮮程度較好，乳酸菌的存活能力較高。

本研究中10份酸馬奶樣品共分離得到109株菌，經(jīng)革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)顯陰性結(jié)果篩選后得到疑似乳酸菌共91株。通過觀察菌落形態(tài)，其菌落邊緣呈整齊或不平，菌落表面呈粗糙或光滑，菌落中央有凸起或凹陷，菌落顏色呈白色、乳黃色或接近于透明。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)革蘭氏染色后的疑似乳酸菌分離菌株形態(tài)呈均勻排列的桿狀、球狀或橢球狀，排列呈對(duì)、呈鏈、成片或呈環(huán)狀。

2.2 乳酸菌分離菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)同源性序列比對(duì)（BLAST）結(jié)果顯示，91株分離株均為乳酸菌，將其16S rRNA基因序列與模式菌株的16S rRNA基因序列利用MEGA7.0軟件繪制乳酸菌序列進(jìn)化樹。通過圖1（比例尺為0.01）的系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，分離到的91株乳酸菌分離株為2個(gè)屬11個(gè)種，包括植物乳桿菌（Lb.plantarum）、馬乳酒樣乳桿菌（Lb.kefiranofaciens）、副干酪乳桿菌（Lb.paracasei）、干酪乳桿菌（Lb.casei）、哈爾濱乳桿菌（Lb.harbinensis）、發(fā)酵乳桿菌（Lb.fermentum），德氏乳桿菌（Lb.delbrueckii）和瑞士乳桿菌（Lb.helveticus）等。

圖1 部分乳酸菌分離株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)純培養(yǎng)從吉爾吉斯斯坦地區(qū)的10份酸馬奶樣品中分離共91株乳酸菌，其中副干酪乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌種，占所有分離株的29.67%，除KG12，KG15和KG26樣品外，其余樣品均有分離，具體結(jié)果如表2所示。

表2 吉爾吉斯斯坦酸馬奶中乳酸菌分離鑒定結(jié)果

2.3 吉爾吉斯斯坦自然發(fā)酵酸馬奶的細(xì)菌多樣性

2.3.1 α多樣性

經(jīng)過SMRT三代測(cè)序，10份吉爾吉斯斯坦自然發(fā)酵酸馬奶共獲得32 553條高質(zhì)量DNA序列，平均每個(gè)發(fā)酵乳樣品獲得3 255條DNA序列。其中KG12樣品獲得的代表性O(shè)TUs最少，為146條，KG17樣品獲得的代表性O(shè)TUs最多，為488條。吉爾吉斯斯坦比什凱克、阿倫和奧什3個(gè)地區(qū)酸馬奶的Chao1指數(shù)分別為（445.94±207.47）、（294.38±0.00）和（308.29±53.76）；發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為（206.50±163.00）、（163.00±0.00）和（144.67±31.64）；香農(nóng)指數(shù)分別為（4.22±1.39）、（3.11±0.00）、（5.08±0.25）;辛普森指數(shù)分別為（0.74±0.19）、（0.58±0.00）、（0.93±0.02）。通過比較發(fā)現(xiàn)，奧什地區(qū)的酸馬奶細(xì)菌群落多樣性和種數(shù)較其他兩個(gè)地區(qū)更為豐富,具體如表3所示。

表3 吉爾吉斯斯坦酸馬奶的測(cè)序序列信息和α多樣性指數(shù)

2.3.2 β多樣性

分析吉爾吉斯斯坦不同地區(qū)酸馬奶的菌群多樣性變化，通過PC1（第一主成分）和PC2（第二主成分）進(jìn)行主坐標(biāo)分析，基于加權(quán)距離的主坐標(biāo)分析PC1坐標(biāo)和PC2坐標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為77.5%和13.17%，基于非加權(quán)距離的主坐標(biāo)分析PC1坐標(biāo)和PC2坐標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為29.92%和14.19%。從圖中可以看出，采集于吉爾吉斯斯坦不同地區(qū)的酸馬奶制品有明顯的分離狀態(tài)，同時(shí)存在一定的交疊，如圖2所示。

圖2 不同地區(qū)酸馬奶制品中菌群主坐標(biāo)分析

2.3.3 細(xì)菌組成

經(jīng)檢測(cè)，吉爾吉斯斯坦10份自然發(fā)酵酸馬奶細(xì)菌在細(xì)菌門水平的組成主要分為4個(gè)菌門，除厚壁菌門外，還有變形菌門、擬桿菌和極少量的藍(lán)藻細(xì)菌。其中，厚壁菌門是吉爾吉斯斯坦自然發(fā)酵酸馬奶制品中的主要菌門，相對(duì)占比的均值為98.38%，是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門。除絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門厚壁菌門外，不同地區(qū)不同樣本的酸馬奶制品中細(xì)菌門的相對(duì)占比各不相同，不同樣本細(xì)菌門水平組成如表4所示。

表4 不同酸馬奶中細(xì)菌門水平組成 %

在細(xì)菌屬水平，吉爾吉斯斯坦10份自然發(fā)酵酸馬奶樣品中共檢測(cè)到20個(gè)細(xì)菌屬。主要由乳桿菌屬、乳球菌屬這2個(gè)乳酸菌屬構(gòu)成。其中，KG12酸馬奶樣品中有相對(duì)占比最高的乳桿菌屬，達(dá)99.92%；KG23酸馬奶樣品中有相對(duì)占比最高的乳球菌屬，為12.97%。通過進(jìn)一步分析可知，吉爾吉斯斯坦自然發(fā)酵酸馬奶中還有一些相對(duì)占比小于1%的細(xì)菌菌屬，如克呂沃爾菌屬、沙雷氏菌屬、土芽孢桿菌屬、魏斯特菌屬等，研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)酸馬奶細(xì)菌屬種類及相對(duì)占比不同，不同地區(qū)酸馬奶制品細(xì)菌屬水平組成如圖3（a）所示。

圖3 不同酸馬奶細(xì)菌組成

在細(xì)菌種水平，10份樣品共檢測(cè)到30個(gè)細(xì)菌菌種，在所有樣品中相對(duì)占比大于1%的除了有瑞士乳桿菌（48.04%）和哈爾濱乳桿菌（11.68%）外，還有類谷糠乳桿菌（6.11%），德氏乳桿菌（5.69%），馬乳酒樣乳桿菌（4.52%），發(fā)酵乳桿菌（3.79%），食二酸乳桿菌（3.21%），橋乳桿菌（3.01%），乳酸乳球菌（2.06%），副干酪乳桿菌（1.20%），牛糞乳桿菌（1.14%）等。除含量較多的菌種外，吉爾吉斯斯坦自然發(fā)酵酸馬奶樣品中還檢測(cè)出一些低豐度（相對(duì)占比小于1%）的菌種，不同發(fā)酵乳制品細(xì)菌種水平組成見圖3（b）。

測(cè)序中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌菌種包含了純培養(yǎng)中獲得的所有分離菌株種類，其中瑞士乳桿菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株，這與在純培養(yǎng)中優(yōu)勢(shì)菌株為副干酪乳桿菌的結(jié)果并不相同。

2.3.4 核心微生物分析

核心微生物通常表示每個(gè)OTU在樣品中出現(xiàn)的頻率[8]，通過核心微生物組成有助于分析不同發(fā)酵乳制品微生物群落的特征。通過分析可知，吉爾吉斯斯坦酸馬奶樣品種水平的核心微生物為瑞士乳桿菌，其次為哈爾濱乳桿菌、類谷糠乳桿菌、德氏乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、食二酸乳桿菌、橋乳桿菌、乳酸乳球菌、副干酪乳桿菌、牛糞乳桿菌等，酸馬奶樣品的核心微生物組成如圖4所示。

圖4 酸馬奶中核心微生物組成

2.3.5 OTU水平的菌群分析

通過Venn圖對(duì)吉爾吉斯斯坦不同地區(qū)采集的發(fā)酵酸馬奶制品OTU（代表性序列）的組成分析，根據(jù)不同OTU在酸馬奶制品中的豐度計(jì)算出不同樣品間的共有或特有OTU[9]。由圖5可知，比什凱克地區(qū)采集的酸馬奶有211個(gè)特有OTU，奧什地區(qū)有132個(gè)特有OTU，阿倫地區(qū)有125個(gè)特有OTU。比什凱克，奧什和阿倫3個(gè)地區(qū)采集的酸馬奶的共有OTU有30個(gè)，占總OTU的4.47%。其中，奧什和阿倫地區(qū)的共有OTU為2個(gè)，只占OTU總數(shù)的0.3%。結(jié)果表明不同地區(qū)的發(fā)酵乳制品之間菌群的共性各有不同，其中奧什地區(qū)與阿倫地區(qū)的差異最大。

圖5 不同采樣地區(qū)酸馬奶中的特有OTU分析

3 討論

通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法從吉爾吉斯斯坦10份自然發(fā)酵酸馬奶中分離得到91株乳酸菌菌株，屬于2個(gè)屬，11個(gè)種。樣品的優(yōu)勢(shì)菌種為副干酪乳桿菌，占所有酸馬奶樣品分離株的29.67%，這與喬健敏[10]等人研究的內(nèi)蒙古地區(qū)自然發(fā)酵酸馬奶中乳酸菌組成結(jié)果符合。通過PacBio SMRT測(cè)序方法分析酸馬奶后，發(fā)現(xiàn)樣品中的細(xì)菌隸屬于4個(gè)門，20個(gè)屬，30個(gè)種。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌（93.98%），優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種為瑞士乳桿菌（48.04%）和哈爾濱乳桿菌（11.68%）。與劉文俊等[11]研究的蒙古國的傳統(tǒng)酸馬奶中的乳酸菌組成結(jié)果類似。孫志宏等[12]通過高通量測(cè)序法研究tarag（自然發(fā)酵乳制品）中的細(xì)菌和真菌多樣性、種群結(jié)構(gòu)等，發(fā)現(xiàn)目前研究中使用的瑞士乳桿菌分離物中存在3個(gè)亞群，且大多數(shù)來自特定生態(tài)起源的瑞士乳桿菌菌株都有特定的種群結(jié)構(gòu)，這可能是酸馬奶樣品中的優(yōu)勢(shì)菌種為瑞士乳桿菌的重要原因之一[13]。吉爾吉斯斯坦境內(nèi)酸馬奶的細(xì)菌組成在3個(gè)地區(qū)之間也存在一定差異：瑞士乳桿菌是比什凱克與阿倫地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌種，奧什地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌種為哈爾濱乳桿菌。在3個(gè)地區(qū)中，奧什地區(qū)的細(xì)菌多樣性最高，阿倫地區(qū)的酸馬奶樣品中菌群豐富度最低。

4 結(jié)論

本文通過純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)研究了吉爾吉斯斯坦10份自然發(fā)酵酸馬奶中的乳酸菌與細(xì)菌組成，共分離得到91株乳酸菌。通過PacBio SMRT分析后，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種為瑞士乳桿菌（48.04%），酸馬奶中的細(xì)菌組成、細(xì)菌數(shù)量及優(yōu)勢(shì)菌種存在地域差異。本研究保存的乳酸菌資源和報(bào)道的自然發(fā)酵酸馬奶細(xì)菌圖譜，有助于后續(xù)幫助當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)發(fā)酵乳的發(fā)展。此外，我們需要關(guān)注傳統(tǒng)發(fā)酵乳的發(fā)酵環(huán)境和工藝，避免一些條件致病菌帶來的食品安全問題。