沈凌宇,常雄飛,潘 良,楊 怡,劉曉靜,王世廣△,胡 慧△

(1.北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院，北京 101300；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)是最為常見的女性生殖內(nèi)分泌疾病，以稀發(fā)排卵、高雄激素及卵巢多囊化為主要表現(xiàn)?，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)識到，胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是導(dǎo)致這種復(fù)雜疾病的關(guān)鍵因素之一[1]，臨床上不僅60%～70%的PCOS患者存在超重或肥胖(與IR有密切關(guān)系)，許多體質(zhì)量正?；蚱莸幕颊唧w內(nèi)也存在IR[2]。IR是細(xì)胞、組織或機體需要超過正常量的胰島素才能正常反應(yīng)的一種病理狀態(tài)，其可從下丘腦、垂體、卵巢以及肝臟等多個層面增加體內(nèi)游離雄激素水平[3]。近期研究表明NFκB介導(dǎo)的下丘腦炎癥信號異常是下丘腦PI3K的通路障礙的原因之一[4]，而下丘腦PI3K異常是PCOS-IR及排卵減少的重要機制[5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)針刺具有改善PCOS患者IR的作用[6]，本研究通過建立PCOS-IR大鼠模型，探討電針對PCOS-IR下丘腦NFκB-IKBα-PI3K信號通路的調(diào)控作用，為電針治療PCOS-IR的臨床運用提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK(京)2016-0006]，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物實驗中心SPF級動物實驗室飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22±1)℃，相對濕度65%～70%，12 h明暗交替，自由進(jìn)食水，自訂購之日起適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，實驗過程經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 Glucose Kit[批號20190816，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司]；insulin ELISA kit(批號80-INSRTU-E01，美國Alpco公司)； HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(批號GB23302，武漢賽維爾生物科技有限公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔(批號GB23303，武漢賽維爾生物科技有限公司)；β-actin(批號GB12001，武漢賽維爾生物科技有限公司)；p65 Antibody(批號GB11142，武漢賽維爾生物科技有限公司)；IkB alpha(批號10268-1-AP，武漢三鷹生物科技有限公司)；Mouse Anti-PI 3 Kinase p85 alpha Monoclonal Antibody(批號bsm-33219M，北京博奧森生物科技有限公司)；4 %多聚甲醛(批號：BL539A，Biosharp生物)；蘇木精-伊紅染色液(批號：DH0003，北京化工廠)。

1.2.2 儀器 alphaEaseFC灰度分析軟件(美國Alpha Innotech公司)；KWD-808-Ⅰ電針儀(常州英迪有限公司)；Φ0.22 mm×13 mm一次性無菌針灸針(北京中研太和有限公司)；全自動生化儀AU480(日本奧林巴斯株式會社)；電泳儀(北京六一儀器廠)；全自動多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；石蠟切片機(美國Thermo Scientific)；蠟塊包埋儀(美國Thermo Scientific)。

1.3 造模與分組

將40只大鼠隨機取6只為正常組，正常組大鼠以1 %羥甲基纖維素鈉(CMC)溶液1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃，剩余大鼠經(jīng)來曲唑造模，以相同濃度的CMC-來曲唑混懸液1 mL/100 g灌胃，來曲唑濃度為0.1 mg/mL，每日灌胃1次，持續(xù)灌胃21 d[7]。灌胃最后5 d進(jìn)行大鼠陰道涂片，以大鼠陰道涂片失去周期性變化判定PCOS造模成功。PCOS造模成功的大鼠禁食8 h，眶靜脈取血測定空腹血糖(FPG)及空腹胰島素(FINS)，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，以HOMA-IR>2.8作為PCOS-IR造模成功的評判標(biāo)準(zhǔn)[8]。篩選出造模成功的大鼠12只，模型組、電針組各6只。造模成功后，正常組大鼠持續(xù)予上述濃度CMC溶液1 mL/100 g灌胃，模型組及電針組大鼠持續(xù)予上述濃度的CMC-來曲唑混懸液保證模型的穩(wěn)定性，持續(xù)至取材前1日。

1.4 干預(yù)方法

電針組大鼠裝入自制避光袋，Φ0.22×13 mm針灸針直刺雙側(cè)“帶脈”穴[9]3～5 mm，具體位置在大鼠臍水平第12肋的前下方，連接電針，選擇疏密波2/100 Hz，具體強度維持在0.6～1.4 mA，每次持續(xù)20 min。正常組、模型組大鼠裝入避光袋中20 min，無其他干預(yù)措施。每日1次，連續(xù)14 d。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 大鼠卵巢HE切片 取大鼠卵巢放入4 %多聚甲醛溶液中24 h，石蠟包埋后按6 μm厚度切片，蘇木精-伊紅染色后封片。

1.5.3 胰島素抵抗水平檢測 取材前各組大鼠禁食、不禁水8 h，每100 g腹腔注射0.3 mL 2%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，腹主動脈采血5 mL，4 ℃，3 000 r/min離心20 min。取上清用氧化酶法測定空腹血糖(FPG)，用ELISA法測定空腹胰島素(FINS)，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及胰島素敏感指數(shù)(IAI)，公式為：HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(m IU/L)/22.5；IAI=Ln(1/FPG×FINS)。

1.5.4 下丘腦NFκB、IKBα及PI3K蛋白表達(dá)檢測 各組大鼠麻醉取血后，斷頭分離大腦，在冰浴上分離出下丘腦，放于-80 ℃保存，用于Western blot檢測。將下丘腦加入蛋白酶抑制劑置入勻漿機中徹底勻漿，12 000 rpm離心10 min，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。沸水浴變性后，10%分離膠 120 V，5%濃縮膠75 V電泳。后將蛋白25 V恒壓轉(zhuǎn)膜過夜，用5%的脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗(β-actin、p65 Antibody、IkB alpha、Mouse Anti-PI 3 Kinase p85 alpha Monoclonal Antibody)4 ℃孵育過夜，TBST室溫?fù)u床上洗3次×5 min，將二抗(HRP標(biāo)記山羊抗大鼠1∶3 000、HRP標(biāo)記山羊抗兔1∶1 000)室溫孵育30 min，TBST室溫?fù)u床上洗3次×5 min。在暗室中將ECLA和ECLB兩種試劑等體積混合于PVDF膜上的蛋白充分反應(yīng)，曝光后用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影，將膠片進(jìn)行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢病理改變差異

正常組可見正常的卵泡及黃體；模型組卵巢體積增大，正常卵泡大多數(shù)被囊狀卵泡取代，出現(xiàn)多囊樣改變，卵泡膜層增厚，顆粒細(xì)胞層變??；電針組可見正常卵泡，卵泡膜層較模型組薄，顆粒細(xì)胞層增厚。見圖1。

注：A為正常組，B為模型組，C為電針組。圖1 各組大鼠HE染色切片(20×)

2.2 各組大鼠WC、Lee’s指數(shù)及體質(zhì)量增加率的變化

模型組WC、Lee’s指數(shù)及體質(zhì)量增加率比正常組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；電針干預(yù)后腰圍、體質(zhì)量增加率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，但仍高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腰圍、Lee’s指數(shù)及體質(zhì)量增加率的比較

2.3 各組大鼠血清FPG、FINS、HOMA-IR及IAI的變化

各組大鼠血清FPG、FINS、HOMA-IR及IAI的變化見表2，模型組血清FPG、HOMA-IR、IAI與正常組相比明顯上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，電針干預(yù)后FPG、HOMA-IR及IAI下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但治療后FPG依舊高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明針刺可改善來曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠造成的胰島素抵抗。

表2 治療后各組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR及IAI比較

2.4 各組大鼠下丘腦NFκB、IKBα及PI3K蛋白表達(dá)的變化

與正常組比較，模型組下丘腦NFκB蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，IKBα及PI3K蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，電針組下丘腦NFκB蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，IKBα及PI3K蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠下丘腦NFκB、IKBα及PI3K蛋白表達(dá)的比較

圖2 各組大鼠下丘腦NFκB、IKBα及PI3K蛋白免疫印跡圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗病機多腎虛，多痰濕，中焦在其中發(fā)揮著重要的作用，中焦運化失調(diào)則水液代謝失調(diào)而生膏脂，升降樞機失司則下不能滋腎水養(yǎng)胞宮，上不能益腦明神，致生殖軸異常。帶脈位處中焦，是全身唯一一條橫行經(jīng)脈，對十二正經(jīng)及其他奇經(jīng)八脈起著維系的作用，“帶脈”穴不僅對糖脂代謝有重要作用[10]，也用于治療月經(jīng)病，《針灸甲乙經(jīng)》記載:“婦人少腹堅痛，月水不通，帶脈主之”，本研究采用針刺“帶脈”穴來治療PCOS，主要基于對“帶脈失約是PCOS不可忽視的病機之一”的認(rèn)識[11]。

本研究關(guān)注PCOS-IR下丘腦轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要基于以下原因：目前學(xué)界認(rèn)為PCOS的發(fā)病機制與下丘腦-垂體-性腺軸功能失調(diào)、高雄激素血癥及IR密切相關(guān)[12]，PCOS患者中IR患病率高達(dá)75%，其中許多是不依賴肥胖的方式存在的，其原因與下丘腦炎癥狀態(tài)有密切關(guān)系。PCOS-IR機制主要在于受體后水平，即信號向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)過程異?；騾⑴c傳導(dǎo)的信號分子功能異常，其可以影響生殖功能的主要靶點也在下丘腦[13]。

既往研究表明來曲唑造模后大鼠進(jìn)食量明顯增加，過量飲食后，下丘腦處于促炎信號激活的狀態(tài)，導(dǎo)致一種慢性和穩(wěn)定的炎癥背景，稱為“下丘腦微炎癥”[14]。下丘腦微炎癥狀態(tài)在體質(zhì)量顯著增加之前就已經(jīng)改變了胰島素敏感性[4]，NFκB是神經(jīng)代謝性炎癥的關(guān)鍵中介之一[15]，NFκB與抑制蛋白IKBα結(jié)合，處于抑制狀態(tài)。IKBα的減少/消失將NFκB釋放進(jìn)入細(xì)胞核啟動基因轉(zhuǎn)錄。NFκB的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括細(xì)胞因子及其受體、黏附分子和凋亡因子等，共同啟動了炎癥反應(yīng)。NFκB可通過細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子(AOCS3)與PI3K信號通路整合，從而導(dǎo)致葡萄糖代謝異常[16]，同時也會刺激GnRH調(diào)節(jié)生殖功能基因的表達(dá)[17]，加速LH釋放，從而導(dǎo)致T增加，引起卵泡發(fā)育障礙[18]，觸發(fā)PCOS的發(fā)生[19]。

本實驗結(jié)果選取來曲唑造模的PCOS大鼠作為研究對象，研究結(jié)果表明經(jīng)來曲唑灌胃后大鼠存在下丘腦微炎癥及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，與Lian[20]的研究結(jié)果相一致?！皫}”穴是奇經(jīng)八脈帶脈所過之處，沖任督脈起于胞宮，皆絡(luò)于帶脈，從巡行上講，帶脈與腦及胞宮有密切聯(lián)系，本實驗電針“帶脈”穴干預(yù)后，大鼠體脂參數(shù)、胰島素抵抗指數(shù)及下丘腦NFκB、PI3K信號通路有一定改善，從實驗角度佐證了古籍中“帶之為病，腹?jié)M，腰溶溶如坐水中”以及“婦人少腹堅痛，月水不通，帶脈主之”的論述，證實了針刺帶脈對卵泡發(fā)育有一定作用，提示電針可通過改善下丘腦NFκB通路改善生殖軸功能，治療PCOS-IR的潛在機制之一，與中藥治療相關(guān)疾病有異曲同工之妙[11, 20-21]。臨床中PCOS-IR患者往往為帶脈樞機受損、脾胃升降運化失司，聚痰生濕，痰濕循經(jīng)下流胞宮，阻滯胞門造成腎水難達(dá)胞宮、經(jīng)水閉塞不行，本研究為臨床治療該類患者取穴提供另一種思路。同時本研究初次從下丘腦微炎癥的角度探討電針治療PCOS-IR的機制，為PCOS的治療提供新的思路，而下丘腦炎癥的產(chǎn)生可能與飲食增加導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡、腸道免疫異常有關(guān)[22]，這也是目前中醫(yī)干預(yù)PCOS的潛在靶點[23]，其相關(guān)環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。