張春霞 李 健 李吉濤 王佳佳 李文洋 李明棟

脊尾白蝦基因的克隆與表達分析*

張春霞1,2李 健2①李吉濤2王佳佳2李文洋2李明棟1,2

(1. 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學) 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 山東 青島 266071)

雌激素相關受體(estrogen-related receptor,)是一種真核轉(zhuǎn)錄因子，與雌激素的效應有密切關系，參與生物體的能量代謝、細胞增殖分化和性腺發(fā)育等生理過程。為了解基因在脊尾白蝦()卵巢發(fā)育中的作用，采用cDNA末端快速擴增技術(RACE)克隆獲得脊尾白蝦基因的cDNA序列，該基因全長為2025 bp，包括5′非編碼區(qū)241 bp，3′非編碼區(qū)410 bp，開放閱讀框1374 bp，編碼457個氨基酸。組織表達分析結果顯示，在脊尾白蝦各組織中均有表達，卵巢組織的表達量最高(<0.05)；在卵裂期的表達量顯著高于胚胎及幼體發(fā)育時期(<0.05)；在卵巢發(fā)育過程中呈先降低后升高的趨勢，卵巢發(fā)育Ⅰ期的表達量最高；5-羥色胺浸泡后，實驗組的表達量顯著高于對照組(<0.05)，同時，實驗組卵巢發(fā)育關鍵基因卵黃蛋白原基因的表達量顯著高于對照組(<0.05)。研究表明，基因參與了脊尾白蝦卵巢發(fā)育的調(diào)控，在脊尾白蝦卵巢發(fā)育的早期發(fā)揮關鍵作用。

脊尾白蝦；雌激素相關受體；卵巢發(fā)育；5-羥色胺；基因表達

雌二醇是甲殼動物體內(nèi)重要的類固醇激素，在甲殼動物生殖過程中發(fā)揮重要的作用。甲殼動物體內(nèi)雌二醇的含量會影響其蛻殼、卵母細胞生長及卵黃的發(fā)生(陸劍鋒等, 2010)。在脊椎動物中，雌二醇主要通過與雌激素受體(estrogen receptor,)結合來直接或間接調(diào)控卵巢發(fā)育(Lü, 2016)，然而，在甲殼動物中尚未發(fā)現(xiàn)基因的存在。雌激素相關受體(estrogen-related receptor,)與具有高同源性，尤其在DNA結合域，并且與雌激素效應密切相關(Giguére, 2002)。脊椎動物中基因與其性腺分化和發(fā)育有關(張照斌等, 2008)。對于甲殼動物，已經(jīng)在多個物種中發(fā)現(xiàn)的存在。三疣梭子蟹()(陸洋等, 2016)的基因與其蛻皮、卵原生殖細胞的增殖有關；在羅氏沼蝦()中，基因通過調(diào)控卵母細胞的減數(shù)分裂、生殖相關激素的合成與釋放以及卵黃的生成，進而影響羅氏沼蝦卵巢的發(fā)育(劉金磊等, 2018)，推測甲殼動物的雌激素可能通過與基因結合來調(diào)控卵巢發(fā)育(柳梅梅等, 2015)。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)是甲殼動物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，廣泛分布于甲殼動物的神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官，參與甲殼動物色素遷移、生殖活動、蛻皮活動、骨骼肌收縮等多項生理過程(Richardson, 1991)。5-羥色胺能刺激腦、胸神經(jīng)節(jié)分泌性腺刺激激素，從而促進性腺的發(fā)育。一定濃度5-羥色胺的刺激，能促進蝦、蟹卵巢指數(shù)和卵母細胞直徑的增加(Kulkarni, 1992)，通過5-羥色胺的注射或浸泡能夠加快甲殼動物的卵巢發(fā)育(蔡生力等, 2000)。

脊尾白蝦()廣泛分布于我國沿岸，因其具有生長快、繁殖能力強、味道鮮美且營養(yǎng)價值高等優(yōu)點，已成為我國海水池塘養(yǎng)殖的主要蝦類品種(連春盎等, 2017; 竇全偉等, 2019)。脊尾白蝦因卵巢可連續(xù)多次發(fā)育并抱卵繁殖而為人們所關注，是研究十足目(Decapoda)真蝦繁殖機制的潛在模式生物(馬驪等, 2018)。然而，通過人工控制技術仍未解決脊尾白蝦無法全年繁殖的難題。本研究基于前期轉(zhuǎn)錄組研究篩選到可能調(diào)控脊尾白蝦卵巢發(fā)育的基因，利用cDNA末端快速擴增技術(RACE)克隆獲得脊尾白蝦基因全長序列，分析其在不同組織、卵巢發(fā)育不同階段的表達情況，探究其響應外源5-羥色胺的表達模式，以期闡明基因在卵巢發(fā)育過程中的作用，為深入了解脊尾白蝦等甲殼動物卵巢發(fā)育問題奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

脊尾白蝦取自山東日照海辰水產(chǎn)有限公司，均為活力好、生長健康的個體，將實驗用蝦暫養(yǎng)于200 L的PVC桶中，暫養(yǎng)7 d。24 h持續(xù)充氧，每天換水清污1次，換水量為1/3，每天早晚2次飼喂蛤蜊肉。取10尾健康的脊尾白蝦各組織，包括肌肉、眼柄、觸角腺、甲殼(不帶表皮)、胃、心臟、腸道、卵巢、鰓和肝胰臟于液氮中研磨，用于RNA的提取。

1.2 5-羥色胺對脊尾白蝦卵巢發(fā)育的影響

隨機選取暫養(yǎng)7 d的脊尾白蝦雌蝦進行實驗。根據(jù)預實驗結果，設置對照組和實驗組，實驗組5-羥色胺濃度為50 μg/mL，此劑量間隔3 d浸泡1次，即第1、5和9天分3次浸泡對親蝦進行促熟實驗，每組30尾脊尾白蝦，設置3個平行。實驗期間的管理與暫養(yǎng)相同。實驗結束后，取卵巢組織，每組取6尾，置于液氮中保存，用于RNA的提取。采用qRT-PCR方法檢測浸泡后脊尾白蝦卵巢中基因和卵黃蛋白原基因的含量。

1.3 EcERR基因的cDNA全長克隆

使用Trizol法提取脊尾白蝦卵巢總RNA，選擇質(zhì)量及完整性較好的卵巢組織的總RNA，使用SMARTTMRACE cDNA amplification kit分別合成3′和5′RACE的cDNA第一鏈。從脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組文庫中獲得基因部分EST序列，利用Primer Premier 5軟件設計中間片段引物驗證其準確性后，設計3′和5′RACE特異性引物(表1)。3′和5′RACE引物分別與UPM引物配對進行cDNA的3′和5′末端擴增。利用Omega公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒對目的片段進行切膠回收，將目的片段與Peasy-T1載體(北京全式金生物技術有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細胞Trans1-T1中，過夜培養(yǎng)后，通過藍白斑篩選挑出陽性單克隆，經(jīng)PCR檢測合格后送測序。

1.4 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測

根據(jù)王緒峨(1989)對脊尾白蝦早期胚胎發(fā)育的特征描述，對脊尾白蝦早期胚胎發(fā)育各時期(卵裂期、囊胚期、原腸期、無節(jié)幼體期、前溞狀幼體期、后溞狀幼體期和溞狀幼體)進行取樣。使用Trizol法提取脊尾白蝦各組織(肌肉、眼柄、觸角腺、甲殼、胃、心臟、腸道、卵巢、鰓和肝胰腺)、胚胎和幼體發(fā)育的不同時期及不同卵巢發(fā)育時期的卵巢組織的總RNA，用紫外分光光度計與1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量及完整性。

cDNA的合成：基因組DNA去除，在RNase-free的離心管中配制如下混合液：2 μL RNA，10 μL RNase free ddH2O，4 μL 4×gDNA wiper mix，瞬時離心數(shù)秒，使溶液聚集于管底，用移液器輕輕吹打混勻，42℃ 2 min；配制逆轉(zhuǎn)錄反應體系，在上一步反應液中直接加入4 μL 5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ，50℃15 min，85℃ 5 s。合成的cDNA用于后期脊尾白蝦基因的克隆及qRT-PCR檢測。

Duan等(2013)研究發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦18S rRNA (18S)作為內(nèi)參基因具有穩(wěn)定性，本研究以18S rRNA作為內(nèi)參基因。根據(jù)脊尾白蝦內(nèi)參基因18S rRNA (NCBI登錄號: GQ369794)、基因、卵黃蛋白原基因(NCBI登錄號：JQ319034)的ORF序列，合成qRT-PCR引物(表1)。按照ChamQTMSYBR?Color qPCR master mix說明書，利用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀器進行熒光定量分析。10 μL反應體系：5.0 μL SYBR Color qPCR master mix (2×)，0.2 μL Rox reference dyeⅡ(50×)，正、反向引物各0.4 μL (10 μmol/L)，3.0 μL去離子水，1.0 μL cDNA。反應程序：95℃ 30 s，95℃5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個實驗組設置3次重復，采用2–ΔΔCt方法(Livak, 2001)計算目的基因的相對表達量，利用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，運用Duncan多重比較進行顯著性檢驗。

表1 本研究所用引物序列

Tab.1 Sequences of the primers used in this study

1.5 生物信息學分析

利用SeqMan進行序列拼接與組裝，得到基因的cDNA全長。NCBI ORF Finder (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定其開放閱讀框并預測氨基酸序列，利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)進行同源性比對。利用SignalP 4.0軟件分析信號肽，利用MEGA 6.0軟件(Tamura, 2011)中的neighbor-joining法(Saitou, 1987)構建系統(tǒng)樹。

2 結果與分析

2.1 EcERR cDNA全長的克隆及氨基酸序列分析

采用RACE法克隆得到脊尾白蝦cDNA全長，命名為，GenBank登錄號為MN265353。cDNA全長為2025 bp，其中，5′端非編碼區(qū)241 bp，3′端非編碼區(qū)410 bp，開放閱讀框1374 bp，編碼457個氨基酸，預測分子量大小為50.83 kDa，理論等電點為7.84，N端具有特殊的信號肽序列(1～29 aa)(圖1)。SMART軟件分析預測，含有2個保守功能結構域、1個核受體C4鋅指結構(ZnF_C4)(124～195 aa)、1個配體結合結構域(HOLI結構域)(267～426 aa)及1個低復雜性區(qū)域(11～23 aa) (圖2)。

預測EcERR氨基酸親水性的平均值為–0.331，說明該蛋白具有較強的親水性，但在2個保守的功能結構域存在多個疏水區(qū)，其中，368位點的疏水性最強，為2.656，207位點的親水性最強，為–3.056。在配體結合區(qū)，可以明顯看到9個疏水區(qū)域(圖3)。

2.2 EcERR同源性分析及系統(tǒng)進化樹結構

使用NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)對脊尾白蝦基因編碼的氨基酸序列與其他物種基因編碼的氨基酸序列進行同源性比較。結果發(fā)現(xiàn)，其與羅氏沼蝦同源性最高達到98.47%，與擬穴青蟹()、三疣梭子蟹和中華絨螯蟹()同源性分別為80.84%、78.82%和79.43%。利用MEGA 6.0軟件對脊尾白蝦EcERR氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，并構建系統(tǒng)進化樹(圖4)，結果顯示，EcERR氨基酸與同為長臂蝦科(Palaemonidae)的羅氏沼蝦的親緣關系最近，其與甲殼動物聚為一支，然后與昆蟲類聚為一大支；哺乳動物、鳥類、魚類等脊椎動物存在、和3種亞型，且和亞型的進化關系更近。

2.3 EcERR的組織表達特征

利用qRT-PCR方法分析脊尾白蝦基因在各個組織中的表達情況(圖5)。結果顯示，在眼柄、肌肉、肝胰腺、心臟、卵巢、鰓、觸角腺、甲殼、胃和腸中均有表達，其中，在卵巢中相對表達量最高，胃和心臟次之，在肌肉和肝胰腺的表達量最低。

圖1 脊尾白蝦EcERR的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列

黑色框標記起始密碼子和終止密碼子；實線表示信號肽；雙下劃線表示多腺苷酸信號AATTAAA

The black box marks the start codon and the stop codon; The solid line represents the signal peptide. Double underline represents the polyadenylation signal AATTAAA

圖2 EcERR結構域預測

圖3 EcERR氨基酸序列疏水性結果預測

2.4 EcERR基因在胚胎發(fā)育過程中的表達特征

脊尾白蝦基因在胚胎發(fā)育過程中的表達特征如圖6所示，卵裂期基因的表達量顯著高于其他發(fā)育時期(0.05)，隨胚胎發(fā)育和細胞分裂，其整體呈先下降再升高再下降的趨勢。無節(jié)幼體期與前溞狀幼體期無顯著性差異，基因在前溞狀幼體期、無節(jié)幼體期的表達量顯著高于囊胚期、原腸期、后溞狀幼體期和溞狀幼體第1天(<0.05)。

2.5 EcERR基因在卵巢發(fā)育時期的表達

利用qRT-PCR分析在脊尾白蝦不同卵巢發(fā)育時期的表達水平如圖7所示，在卵巢發(fā)育過程中，基因呈先下降再上升的趨勢?；蛟诼殉舶l(fā)育Ⅰ期表達量最高(<0.05)，隨后表達量顯著下降，到卵巢發(fā)育Ⅲ期表達量最低；卵巢發(fā)育Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期之間，表達量無顯著差異；卵巢發(fā)育Ⅳ期表達量顯著低于卵巢發(fā)育Ⅴ期(<0.05)；卵巢發(fā)育Ⅰ期和Ⅴ期的表達量相比無顯著差異。

圖4 EcERR氨基酸序列NJ系統(tǒng)進化樹

圖5 脊尾白蝦EcERR在各組織中的表達

不同字母代表差異顯著(<0.05)。下同

Different letters mean significant difference (<0.01). The same as below

2.6 5-羥色胺對EcERR和卵黃蛋白原基因表達的影響

脊尾白蝦經(jīng)5-羥色胺浸泡后，脊尾白蝦卵巢發(fā)育Ⅰ期的卵巢組織中卵黃蛋白原基因(vitellogenin,)的表達情況如圖8所示。經(jīng)5-羥色胺浸泡后的實驗組卵黃蛋白原基因的表達量極顯著高于對照組(未浸泡5-羥色胺組)(<0.01)，是對照組的15.15倍；實驗組脊尾白蝦卵巢中基因的表達量極顯著的高于對照組(<0.01)，是對照組的4.48倍。

圖6 EcERR在不同胚胎發(fā)育時期的表達

圖7 EcERR基因在卵巢發(fā)育各時期的表達

圖8 卵黃蛋白原基因在脊尾白蝦卵巢中的表達

** 代表差異極顯著(<0.01)。下同

** means highly significant difference (<0.01). The same as below

圖9 EcERR基因在卵巢中的表達

3 討論

3.1 EcERR基因cDNA全長的克隆及序列分析

本研究克隆脊尾白蝦基因，其編碼的蛋白序列與其他甲殼動物大小及結構基本一致，N端具有29個氨基酸組成的信號肽序列。脊尾白蝦基因與多數(shù)核受體基因結構一樣，包含1個DNA結合域(ZnF_C4鋅指結構域)、1個配體結合結構域及1個低組分復雜區(qū)域，2個結構域的生理功能主要是通過調(diào)控基因表達來實現(xiàn)?；蚺c具有很強的同源性，但作用方式不同?；?qū)儆诠聝汉耸荏w家族成員，缺乏天然的內(nèi)源性配體，只能以非配體依賴型方式發(fā)揮作用，即其必須與相關輔調(diào)節(jié)因子結合，形成ERR-輔調(diào)節(jié)因子復合物，識別目標調(diào)控基因上的ERE或ERRE位點，激活啟動下游靶基因表達，參與信號通路的調(diào)控(Long, 2020; 陳健等, 2001)。

3.2 EcERR在脊尾白蝦卵巢發(fā)育中的功能研究

具有組織表達特異性，Real-time PCR的結果表明，其在卵巢中的表達量顯著高于其他組織(<0.05)，為鰓、肌肉等組織的8～18倍(圖5)。研究表明，基因在多種物種的性腺中高表達，哺乳動物中，基因在小鼠()生殖系統(tǒng)中大量表達，其表達從生殖細胞開始一直維持到性別分化(Park, 2017)；在魚類中，在青鳉和底鳉()的腦和性腺組織中表達量最高(Cheung, 2013; Tarrant, 2006)；在軟體動物中，在貽貝()(Nagasawa, 2015)的生殖腺中大量表達；在甲殼動物中，在羅氏沼蝦的卵巢中表達量最高(趙苗鑫等, 2017)?；蛟诓煌锓N性腺組織的高表達，均說明可能在動物的生殖發(fā)育和性成熟中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

基因在無脊椎動物的卵巢和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，敲除家蠶()受精卵的基因后，其胚胎發(fā)育時間會延遲，發(fā)現(xiàn)其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控糖酵解途徑中的3大限速酶基因(丙酮酸激酶、己糖激酶和磷酸果糖激酶)，推測其可能通過調(diào)控糖酵解途徑來影響家蠶的胚胎發(fā)育(龍威, 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在受精卵期的表達顯著高于其他胚胎發(fā)育時期(<0.05)，隨著細胞分裂，表達量呈下降趨勢，推測可能通過調(diào)節(jié)糖酵解途徑，為細胞分裂提供能量。基因在擬黑多刺蟻()卵巢的卵子發(fā)生過程中的濾泡細胞和生長期，卵黃發(fā)生期的卵母細胞中的表達量較高(歐陽霞輝等, 2014)；表達定位于地中海貽貝()、貽貝卵巢的濾泡細胞中，可與基因相互作用調(diào)控卵母細胞的發(fā)育(Nagasawa, 2015)；Liu等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，基因在羅氏沼蝦卵巢發(fā)育早期的表達量較高，在Ⅱ和Ⅲ期的表達量降低，推測其可能對羅氏沼蝦卵巢發(fā)育早期進行調(diào)控。根據(jù)王緒峨(1987)的研究，將脊尾白蝦卵巢發(fā)育大致分為5期，本研究根據(jù)卵巢大小和顏色收集了脊尾白蝦不同發(fā)育時期的卵巢樣本，發(fā)現(xiàn)在卵巢發(fā)育早期表達量較高，隨著卵巢的逐漸成熟，隨之降低，在卵巢發(fā)育Ⅲ期表達量最低，隨后逐漸回升，說明參與了脊尾白蝦卵巢發(fā)育，推測其在卵巢發(fā)育早期發(fā)揮關鍵的調(diào)控作用。

5-羥色胺作為生物胺，廣泛分布于甲殼動物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，5-羥色胺具有促進卵巢發(fā)育的效應，其通過調(diào)控神經(jīng)器官中性腺刺激激素的釋放，從而影響卵巢發(fā)育，在大西洋招潮蟹()中注射5-羥色胺激動劑，其卵巢指數(shù)和卵母細胞直徑顯著增大(Meeratana, 2006)；體外注射5-羥色胺可以明顯促進中國對蝦()的卵巢發(fā)育(蔡生力等, 2000)。卵黃蛋白原基因是非哺乳卵生動物卵細胞發(fā)育過程中產(chǎn)生的重要物質(zhì)成分，為胚胎及幼體發(fā)育提供營養(yǎng)和功能性的物質(zhì)，是卵巢發(fā)育重要的標記基因(Wang, 2020)。K?hler等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，在無脊椎動物中，雌激素必須與基因的雌激素反應元件結合，才能啟動卵黃蛋白原等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究通過5-羥色胺浸泡脊尾白蝦后發(fā)現(xiàn)，實驗組脊尾白蝦的卵巢開始發(fā)育，而對照組不發(fā)育；且實驗組脊尾白蝦卵巢發(fā)育Ⅰ期的卵巢組織中卵黃蛋白原基因的表達量是空白組的15.15倍。實驗組脊尾白蝦卵巢中基因的表達量顯著高于對照組(< 0.05)，是空白對照組的4.48倍，說明5-羥色胺對脊尾白蝦卵巢發(fā)育有一定的促進作用，參與脊尾白蝦的卵巢發(fā)育的過程，但其調(diào)控機理有待進一步研究。

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Cloning and Expression Analysis ofin

ZHANG Chunxia1,2, LI Jian2①, LI Jitao2, WANG Jiajia2, LI Wenyang2, LI Mingdong1,2

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education (Shanghai Ocean University), Shanghai 201306, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071, China)

Estrogen-related receptor () is a eukaryotic transcription factor that is closely related to the effect of estrogen and is involved in the regulation of energy metabolism, cell proliferation and differentiation, gonadal development, and other physiological processes. To understand the role of estrogen-related receptors in the ovarian development of, thewas cloned using RACE technology. The gene is 2025 bp long, including an open reading frame of 1374 bp, a 5′ untranslated region of 241 bp, and a 3′ untranslated region of 410 bp, which encodes 457 amino acids. Tissue expression analysis showed thatwas expressed in manytissues, with the highest expression level in ovarian tissue. The expression level ofin the cleavage stage was significantly higher than in that of other embryo and larval development stages (<0.05). The expression level offirst decreased and then increased during ovarian development, with the highest expression level in StageⅠ. After 5-hydroxytryptamine invaded, the expression levels of vitellogenin andin the experimental group were significantly higher than in the control group (<0.05). The results showed thatis involved in the regulation ofovarian development and plays a key role in its early stages.

; Estrogen-related receptor; Ovarian development; 5-Hydroxytryptamine; Gene expression

LI Jian, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2022)02-0185-09

10.19663/j.issn2095-9869.20210129001

* 國家重點研發(fā)計劃課題(2019YFD0900403)、財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金、國家自然科學基金(32072974)和中國水產(chǎn)科學研究院基本科研業(yè)務費項目(2020TD46)共同資助 [This work was supported by the Earmarked Fund for the National Key Research and Development Program of China (2019YFD0900403), China Agriculture Research System of MOF and MARA, National Natural Science Foundation of China (32072974), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD46)]. 張春霞，E-mail: zhangchunxiacx@163.com

李 健，研究員，E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

2021-01-29,

2021-02-22

張春霞, 李健, 李吉濤, 王佳佳, 李文洋, 李明棟. 脊尾白蝦基因的克隆與表達分析. 漁業(yè)科學進展, 2022, 43(2): 185–193

ZHANG C X, LI J, LI J T, WANG J J, LI W Y, LI M D. Cloning and expression analysis ofin. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(2): 185–193

(編輯 馮小花)