孫久惠， 劉 穎， 叢培芳， 史秀云， 馬瑞珩， 金紅旭

1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

低溫環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)可影響呼吸系統(tǒng)，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與系統(tǒng)損傷活動(dòng)有關(guān)[1]。肺作為空腔臟器，是爆震發(fā)生時(shí)最易受損的器官之一。因此，明確低溫爆震對(duì)肺的影響并尋找有效的救治藥物具有重要意義。地骨皮為茄科植物枸杞或?qū)幭蔫坭降母稍锔ぃ猩飰A類、有機(jī)酸及酯類、苯丙素類、蒽醌類、柳杉酚、東莨菪素等成分[2]。地骨皮具有抗細(xì)菌和真菌、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、解熱、降血脂和血糖等多種藥理作用[3]。有研究認(rèn)為，地骨皮提取物能夠抑制體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化能力，加速自由基的清除[4]。本研究旨在探討地骨皮提取物地骨皮乙素對(duì)低溫爆震肺氧化應(yīng)激損傷的影響及機(jī)制，為更有效地利用地骨皮提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 24只雄性C57/BL小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司。地骨皮乙素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒和丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒均購(gòu)自遼寧匯佰生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)許可。

1.2 模型建立 將小鼠隨機(jī)分入對(duì)照組、模型組、地骨皮乙素組，每組各8只。地骨皮乙素組灌胃給予地骨皮乙素4.0 g/kg，每天1次，連續(xù)4周；對(duì)照組和模型組分別灌胃給予等體積生理鹽水。小鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度維持在(22±3)℃，濕度維持在45%～65%，自由飲食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，-20℃、濕度15%恒溫箱中低溫飼養(yǎng)7 d，禁水不禁食，每8小時(shí)觀察小鼠狀態(tài)并喂食，建立低溫?fù)p傷模型。7 d后采用自主設(shè)計(jì)研發(fā)的高仿真爆震傷模擬裝置建立低溫爆震傷致小鼠肺損傷模型(模型組和地骨皮乙素組)，具體方法參考文獻(xiàn)[4]。

1.3 濕干重檢測(cè) 10%水合氯醛麻醉C57/BL小鼠，快速取得肺組織，濾紙擦去表面水分，置于已烤干并稱重(重量為W)的載玻片上稱重并記錄(W1)，然后置于60℃烘箱內(nèi)烘烤24 h，間隔15 min重復(fù)稱重以取得恒重并記錄(W2)。

組織含水量(%)=(W1-W)/(W2-W)×100%

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 將組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白提取后，從已平衡至室溫的密封袋中取出板條和試劑。標(biāo)準(zhǔn)品孔和加樣孔均按照說(shuō)明書(shū)操作。按順序加入工作液和孵育，顯色并終止后450 nm下測(cè)量光密度值。

1.5 反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng) Trizol reagent提取組織總RNA。取4.0 μg總RNA，65℃變性5 min，經(jīng)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，合成cDNA。取5 μl cDNA產(chǎn)物，依次加入10×PCR緩沖液、上下游引物各50 pmol、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、Taq DNA poly-merase 1 U。以下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：94℃ 3 min，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s。進(jìn)行30次循環(huán)后進(jìn)一步延伸，72℃ 5 min。

1.6 Western-blot 分別進(jìn)行組織蛋白提取和總蛋白測(cè)定后，將蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h，分別用一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次，加入相對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次，采用ECL Western印跡試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織含水量比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織含水量升高(P<0.05)；與模型組比較，地骨皮乙素組小鼠肺組織含水量降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織含水量比較

2.2 各組小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較 對(duì)照組、模型組、地骨皮乙素組小鼠SOD1分別為(222±13)pg/ml、(731±29)pg/ml、(253±18)pg/ml，SOD2分別為(112±8)U/ml、(211±12)U/ml、(121±11)U/ml，MDA分別為(235±17)nmol/ml、(669±22)nmol/ml、(238±15)nmol/ml。模型組小鼠SOD1、SOD2、MDA水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，地骨皮乙素組小鼠SOD1、SOD2、MDA水平均低于模型組(P<0.05)。

2.3 各組小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表達(dá)水平比較 對(duì)照組、模型組、地骨皮乙素組小鼠Nrf2 mRNA分別為1、(4.40±0.57)、(1.30±0.28)，Keap1 mRNA分別為1、(3.20±0.34)、(1.50±0.31)，ARE mRNA分別為1、(2.20±0.14)、(1.30±0.17)。模型組小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，地骨皮乙素組小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05)。

2.4 各組小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地骨皮乙素組小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

在爆震傷損傷動(dòng)物模型中，C57/BL小鼠具有結(jié)果精確度高、可比性好、價(jià)格低廉、血量豐富、免疫系統(tǒng)完善、應(yīng)激反應(yīng)均一、器官發(fā)育完全等優(yōu)點(diǎn)，因此，本研究選用C57/BL小鼠建立低溫爆震肺損傷模型。作為呼吸系統(tǒng)的主要器官，肺對(duì)寒冷環(huán)境和沖擊波的反應(yīng)變化非常敏感，主要表現(xiàn)為肺內(nèi)氧氣彌散和氧合效果明顯降低。在低溫爆震損傷后，肺部的病理變化主要表現(xiàn)為：大量中性粒細(xì)胞導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)，肺內(nèi)毛細(xì)血管膜通透性增加，出現(xiàn)肺組織水腫，以及由于血管內(nèi)皮受損而形成的血栓和出血[5-6]。細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肺損傷的重要原因，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高是低溫加速細(xì)胞凋亡的細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)[7-8]。本研究結(jié)果顯示：低溫爆震肺損傷發(fā)生后，小鼠肺組織濕干重增加，血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)改變，Nrf2、Keap1、ARE mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；而地骨皮乙素干預(yù)能夠有效降低小鼠濕干重，減少氧化應(yīng)激蛋白，改善低溫爆震肺損傷，且其機(jī)制與通過(guò)Nrf-Keap1-ARE通路調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。

Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)一系列抗氧化和細(xì)胞應(yīng)激基因來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激，在調(diào)控壽命和衰老進(jìn)程氧化應(yīng)激損傷等防御機(jī)制中起著非常重要的作用[9]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，與Nrf2的結(jié)合減弱，削弱了靶向Nrf2的泛素化修飾和降解，從而使更多新合成的Nrf2轉(zhuǎn)移入核，結(jié)合到相應(yīng)靶基因啟動(dòng)子的ARE序列上，激活下游抗氧化損傷基因轉(zhuǎn)錄。除Nrf-Keap1-ARE通路外，Nrf2作為抗氧化應(yīng)答中最核心的轉(zhuǎn)錄因子之一，還能夠參與非Keap1依賴的抗氧化損傷途徑[10]，激活Nrf2可介導(dǎo)下游的一系列抗氧化酶相關(guān)基因和蛋白，從而抑制氧化損傷，維持細(xì)胞氧化還原平衡。有研究報(bào)道，地骨皮乙素能夠作用于Nrf-Keap1-ARE通路，在多種疾病中發(fā)揮有效作用[11]。

綜上所述，地骨皮乙素能夠有效改善低溫爆震損傷小鼠肺組織的氧化應(yīng)激損傷，機(jī)制與調(diào)節(jié)Nrf-Keap1-ARE通路有關(guān)。