朱曉宇，童婉婉，趙 楚，田如男

（南京林業(yè)大學 風景園林學院，江蘇 南京 210037）

冬青屬Ilex植物多常綠，樹冠優(yōu)美，果實通常紅色光亮，長期宿存，是良好的庭園觀賞和城市綠化樹種，擁有巨大的園林應用潛力。冬青屬種子具有種胚后熟的特性[1]，常規(guī)播種繁殖生長緩慢，且后代性狀易發(fā)生分離。嫁接繁殖步驟繁瑣，操作技術不易掌握，管理要求嚴格。相比之下，扦插繁殖操作簡單，繁殖系數(shù)較高，還能保持植物的優(yōu)良性狀。然而，冬青屬植物中的很多種類扦插生根困難、成活率低，嚴重制約了該屬植物的推廣和應用[2]。金曉玲等[3]研究了34種雜交冬青的生態(tài)適應性和扦插成活率后發(fā)現(xiàn)：不同品種的冬青扦插成活率存在較大差異，其中光滑冬青Ilex glabra系列栽培品種扦插成活率較高(90.5%～100.0%)，美洲冬青I. verticillata系列栽培品種較低(47.5%～64.3%)。生產(chǎn)上常常使用植物生長調節(jié)劑處理插穗以獲得較高的生根率。胡曼筠等[4]研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)500 mg·L-1鉀鹽吲哚丁酸(KIBA)處理的華中枸骨I. centrochinensis生根率最高，雌雄株分別為83.33%和87.50%，比對照明顯提高了20.83%。冬青‘長葉阿爾塔’I.×altaclerensis‘Belgica Aurea’為冬青屬常綠小喬木，是歐洲冬青I.aquifolium和加那利冬青I. perado的園藝雜交種，均為雌株[5]。該植物莖綠色，具黃色條紋；葉邊緣金黃色不規(guī)則，中央有灰綠色斑紋；入秋紅果累累，經(jīng)冬不落，是優(yōu)良的觀干、觀葉、觀果樹種。此外，該樹種耐修剪，適應性強，亮麗的色彩很適合與其他彩葉植物搭配種植，極具園林應用前景。但‘長葉阿爾塔’扦插生根較為困難，經(jīng)萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、GGR6生根粉處理后生根率均不到40%，生根持續(xù)時間較長，生根機制尚不清楚[6]。本研究考察了植物生長調節(jié)劑種類和質量濃度、處理方法、基質類型對插穗生根的影響，并從形態(tài)解剖學角度探討了插穗不定根的發(fā)生及發(fā)育過程，旨在揭示‘長葉阿爾塔’插穗的生根機制，為冬青屬植物扦插繁殖技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自寧波高新農(nóng)業(yè)技術實驗園區(qū)苗圃。從10 a以上生長健壯、無病蟲害且無機械損傷的‘長葉阿爾塔’嫁接苗母株上采集當年生半木質化枝條為插穗。插穗長度為8～10 cm，上切口平剪，下切口45° 斜剪，保留3～5個芽及頂端2片1/2成熟葉。本研究在南京林業(yè)大學園林實驗中心溫室的扦插床上進行。扦插前基質均經(jīng)過消毒處理，插床配置間歇自動噴霧裝置，保持扦插環(huán)境相對空氣濕度為90%，插穗上方3 m處覆蓋50%遮陽網(wǎng)。扦插時溫室內溫度為20～25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 以植物生長調節(jié)劑種類和質量濃度、處理方法、基質類型為試驗因素，每個因素下設3個水平，采用3因素3水平正交試驗設計(表1)，試驗共9個處理，每處理30根插穗，重復3次。

1.2.2 指標觀測與數(shù)據(jù)處理 春季扦插 80 d 后統(tǒng)計相關生根指標。觀測指標包括：插穗存活率(%)、生根率(%)、生根數(shù)量(單個處理的單株平均不定根數(shù)量，條)、最長不定根長(單個處理的單株平均最長不定根長，cm)、平均不定根長(單個處理的單株平均根長，cm)，并對插條生根部位和特征進行觀察記錄。計算插穗存活率=存活插穗數(shù)/總插穗數(shù)×100%；生根率=生根插穗數(shù)/總插穗數(shù)×100%；根系效果指數(shù)=(平均根長×根系數(shù)量)/總插穗數(shù)[7]。數(shù)據(jù)采用 Excel 2003整理，并用 SPSS 24.0軟件進行方差分析及多重比較。

1.2.3 外部形態(tài)觀察 插穗扦插前用 1 000 mg·L-1的NAA溶液速蘸插穗10 s，扦插基質為珍珠巖，每處理30根插穗，重復3次。自扦插當天開始取樣，以后每隔14 d取樣1次，每次隨機取3根插穗，共取樣6次(0 、14、28、42、56、70 d)。觀察扦插生根過程中插穗基部形態(tài)變化，愈傷組織和不定根的發(fā)生情況，并拍照記錄，拍照記錄后的插穗用于后期解剖學觀察。

1.2.4 解剖學觀察 觀察‘長葉阿爾塔’插穗莖段的橫切面結構及其在扦插過程中的變化；通過掃描電鏡、透射電鏡觀察扦插過程中各類型愈傷組織的表面形態(tài)及內部細胞結構的變化。①石蠟切片。參照周乃富等[8]的方法，對插穗基部1 cm左右的莖段進行切片，并用OLYMPUS顯微鏡觀察并拍照，分析插穗內部不定根的發(fā)生發(fā)育過程。②掃描電鏡。參照FOWKE等[9]的方法，對插穗基部愈傷組織的結構進行掃描電鏡觀察并拍照(Quanta 200)。③透射電鏡。參照WU等[10]的方法，對新鮮愈傷組織材料(0.5 cm3)進行透射電鏡觀察并拍照(JEM 1400)。

2 結果與分析

2.1 不同處理對插穗生根的影響

由表2可知：不同處理‘長葉阿爾塔’插穗存活率、生根率、最長根長、根系效果指數(shù)4個指標差異極顯著(P＜0.01)。其中，T9處理插穗存活率達63.98%、生根率達48.83%、最長根長達5.15 cm、根系效果指數(shù)達4.90，均極顯著高于其他處理(P＜0.01)。從表3可知：植物生長調節(jié)劑的種類和質量濃度、處理方法水平3的生根率極顯著高于水平1與水平2(P＜0.01)；基質類型水平1與水平2的生根率極顯著高于水平3(P＜0.01)。綜合表2和表3可知：‘長葉阿爾塔’插穗經(jīng)1 000 mg·L-1IBA溶液速蘸10 s，扦插在V(草炭)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)＝3∶3∶4 或 4∶3∶3 的基質中可獲得較高的生根率。

表2 不同處理對‘長葉阿爾塔’插穗生根的影響Table 2 Effects of different treatments on rooting of I.× altaclerensis ‘Belgica Aurea’

表3 正交試驗各因素對插穗生根率的多重比較Table 3 Multiple comparison of rooting rate on different fators of orthogonal test

2.2 插穗生根過程的外部形態(tài)觀察

與扦插前(圖1A)相比，扦插14 d時，插穗切口邊緣能夠觀察到少量淺綠色的愈傷組織(圖1B)；扦插28 d時，插穗切口處表皮開裂，并與木質化部分分離(圖1C)；扦插42 d時，插穗切口上方1 cm左右的部位出現(xiàn)條狀開裂，此時愈傷組織較多，沿著表皮與木質化部分的界限呈環(huán)狀分布(圖1D)；扦插56 d時，大部分插穗切口處均形成點狀、淺黃色的愈傷組織，少量不定根突破皮層，開始皮外伸長生長(圖1E)；扦插70 d時，多數(shù)插穗基部均能明顯觀察到不定根，其生長部位在距插穗下切口上部2 cm內，有些不定根可生長至2 cm左右(圖1G)；扦插90 d時(不在取樣周期內，僅用于外部形態(tài)觀察)，有大量不定根形成，其長度超過5 cm(圖1H)。同時，扦插過程中也發(fā)現(xiàn)有些插穗基部形成發(fā)達的愈傷組織，將切口全部包住(圖1F)，但并未觀察到愈傷組織內長出不定根(圖1I)。此外，有些插穗既不長出愈傷組織，也沒有形成不定根，也不死亡，出現(xiàn)“假活”現(xiàn)象；也有部分插穗自頂端開始發(fā)黑褐化，最終死亡(圖1J)。

圖1 ‘長葉阿爾塔’插穗生根過程的外部形態(tài)變化Figure 1 Morphologic variations during rooting process of I.×altaclerensis ‘Belgica Aurea’

2.3 插穗生根過程的解剖結構觀察

2.3.1 插穗扦插前的解剖結構 扦插前‘長葉阿爾塔’嫩枝插穗的橫切面由表皮(Ep)、皮層(Co)、維管柱3部分組成(圖2A)。維管柱包括韌皮部(Ph)、維管形成層(Vc)、木質部(Xy)、髓(Pi)等部分；在皮層與韌皮部之間存在由一層或多層纖維細胞組成的環(huán)狀厚壁組織(Ps)，呈連續(xù)或不連續(xù)的環(huán)狀排列，被染成紅色(圖2B)。試驗中大量切片觀察并未發(fā)現(xiàn)插穗莖段橫切面內存在潛伏根原基，表明‘長葉阿爾塔’的根原基是在扦插后誘導產(chǎn)生的。

圖2 ‘長葉阿爾塔’插穗生根過程的解剖結構Figure 2 Anatomical structure observation during rooting process of I. × altaclerensis ‘Belgica Aurea’

2.3.2 不定根的發(fā)生過程 根據(jù)解剖觀察結果，‘長葉阿爾塔’插穗生根過程可劃分為3個時期，即形成層細胞活躍期、不定根原基形成期和不定根形成期。①形成層細胞活躍期：由于植物生長調節(jié)劑的誘導，形成層細胞在28 d左右開始旺盛分裂，連續(xù)平周分裂產(chǎn)生胞質濃、細胞核大、染色深的薄壁細胞，并有向外擴張的趨勢。②不定根原基形成期：根誘導42 d左右，髓射線正對的形成層細胞分裂最旺盛，在髓射線加寬部位和緊靠韌皮部的部位形成一團大小相當、細胞核較大、核仁明顯、細胞質較濃的根原基細胞團(圖2C)。隨后，根原基細胞團不斷分裂沖破連續(xù)的厚壁組織，并向皮層方向生長，突破皮層的根原基細胞團受到擠壓分化形成楔形的根原基(圖2D)。③不定根形成期：根原基形成后 (約56 d)，朝向表皮一端的細胞團轉化為不定根的頂端分生組織，頂端分生組織細胞不斷分裂、生長，逐漸突破皮層細胞和表皮(圖2E)；同時，位于不定根根尖后端的細胞從外向內逐漸分化形成根的維管系統(tǒng)，最終與莖的維管系統(tǒng)相連形成幼根(圖2F)。

2.4 扦插生根過程中愈傷組織的細胞形態(tài)學觀察

2.4.1 掃描電鏡觀察 圖3A顯示同一插穗上2種不同類型的愈傷組織，①為白色、透明、塊狀的愈傷組織，②為淺黃色、不透明、點狀的愈傷組織。白色塊狀愈傷組織表面有很多凸出且大小均一的球形細胞，細胞間間隙較小，為胚性愈傷組織細胞(圖3B和圖3C)，多以細胞團的形式存在(圖3D)，表面黏液較多，且?guī)в猩倭啃鯛罡街?圖3E)。從圖3F發(fā)現(xiàn)：淺黃色點狀愈傷組織表面粗糙，細胞大多死亡破裂(圖3G)，細胞表面有附著物(圖3H)，在死亡破裂的細胞之間存在間隙，表面存在凹陷(圖3I)。

圖3 ‘長葉阿爾塔’愈傷組織的掃描電鏡觀察Figure 3 Scanning electron microscopic observation on callus of I. × altaclerensis ‘Belgica Aurea’

2.4.2 透射電鏡觀察 同一愈傷組織中既有胚性愈傷組織細胞也有非胚性愈傷組織細胞。胚性愈傷組織細胞質濃厚、細胞器較明顯(圖4A)；非胚性愈傷組織細胞質稀薄，有明顯的中央大液泡，幾乎觀察不到細胞器(圖4B)。胚性愈傷組織細胞核大，核仁明顯，在靠近細胞膜的胞質區(qū)域里有較多的淀粉粒和線粒體，還可觀察到內含淀粉粒的葉綠體。淀粉可以為插穗生根提供充足的營養(yǎng)，線粒體較多說明其呼吸作用較強，代謝旺盛(圖4C、4D、4E、4F)。同時，仍有部分胚性愈傷組織細胞出現(xiàn)輕微的質壁分離現(xiàn)象(圖4G)，這可能是老化愈傷組織中的衰老細胞。非胚性愈傷組織細胞的細胞質受到液泡擠壓，細胞核等僅分布于細胞壁附近，但仍可觀察到明顯的核仁(圖4H)。

圖4 ‘長葉阿爾塔’愈傷組織的透射電鏡觀察Figure 4 Transmission electron microscope observation on callus of I. × altaclerensis ‘Belgica Aurea’

3 討論

3.1 植物生長調節(jié)劑與生根

選擇最優(yōu)的植物生長調節(jié)劑種類和質量濃度、處理時間等因素組合可以有效提高植物扦插生根率和生根數(shù)[11]。研究[12]表明：植物生長調節(jié)劑可以促進插穗基部細胞的分生與分化，加速插穗內可溶性糖、淀粉及可溶性蛋白的水解和代謝，使下切口成為營養(yǎng)物質的中心吸收區(qū)域；使用植物生長調節(jié)劑還可以提高插穗內過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)的活性，調節(jié)內源激素水平，活化形成層，促進根原基的形成[13-16]。IBA在促進難生根樹種的生根及改善根系品質方面取得了較好的效果[17-18]。本研究中，IBA促進插穗生根效果顯著優(yōu)于ABT1和NAA，這可能是由于IBA被氧化分解的速度慢、傳導擴散性能差，作用于插穗基部的時間長，有利于促進不定根的發(fā)生[19]。本試驗最佳處理的生根率僅為48.83%，今后可結合其生根過程的激素調控、酶活性變化等方面對‘長葉阿爾塔’的生根機制開展更深入探究。

3.2 ‘長葉阿爾塔’插穗生根類型

根據(jù)不定根在插穗上的形成部位不同，木本植物插穗生根類型分為皮部生根型、愈傷組織生根型和混合生根型[20]。本研究發(fā)現(xiàn)：‘長葉阿爾塔’插穗生根部位多在插穗切口上方2 cm左右的皮部，切口處無愈傷組織或僅有少量愈傷組織，也有少數(shù)插穗基部的愈傷組織發(fā)達，但仍然從切口上方的皮部形成多條不定根，與金建邦等[21]對歐洲鵝耳櫪Carpinus betulus扦插不定根的發(fā)生發(fā)育研究結果類似。同時，觀察‘長葉阿爾塔’插穗莖段的橫切面切片后，并未發(fā)現(xiàn)潛伏根原基的存在，推測不定根是從扦插后誘導產(chǎn)生的誘生根原基發(fā)育而來，與山木通Clematis finetiana[22]、紅花槭Acer rubrum[23]等的根原基來源相同。因此，‘長葉阿爾塔’插穗生根類型屬于皮部誘導生根型。

3.3 莖段解剖結構與生根的關系

插穗莖段結構是影響不定根發(fā)生、發(fā)育的“解剖學原因”[24]。對于難生根樹種而言，插穗內部的機械組織(包括厚角組織與厚壁組織2類)是根原基形成和發(fā)育的阻礙因子[25-26]。樹木扦插生根的難易程度與皮層和韌皮部之間的厚壁組織關系密切。多數(shù)難生根樹種厚壁組織連續(xù)且呈環(huán)狀，如珙桐Davidia involucrata[27]等。若插穗皮層中沒有這種組織，或雖有但并不連續(xù)，則插穗生根相對容易，如喜樹Camptotheca acuminata[28]等。本研究發(fā)現(xiàn)‘長葉阿爾塔’1年生插穗莖段皮層與韌皮部之間，存在1～2層由纖維細胞組成的環(huán)狀厚壁組織，呈連續(xù)或不連續(xù)狀，可能與插穗的發(fā)育程度有關；進一步觀察發(fā)現(xiàn)僅少數(shù)根原基能突破連續(xù)的環(huán)狀厚壁組織。此外，‘長葉阿爾塔’插穗生根需經(jīng)歷較長時間，春季56 d左右才能觀察到突破表皮的不定根。由于生根進程緩慢，在此過程中插穗新葉、芽的生長消耗了大量的養(yǎng)分，且較長的時間容易導致插穗因病原菌侵害而褐化死亡，降低生根率。因此，為提高插穗生根率，應選擇1年生、木質化程度較弱的枝條進行扦插，以減少厚壁組織對插穗生根率的影響。

3.4 愈傷組織與生根的關系

扦插后，通常會在插穗基部表皮或表皮與木質化部分交接處形成愈傷組織，可由插穗莖段中的皮層、韌皮部、維管形成層、髓等多個部位的細胞快速分裂而來。插穗愈傷組織與不定根發(fā)生發(fā)育的關系可概括為以下3種：①愈傷組織的形成是不定根生長發(fā)育的物質基礎。此類愈傷組織中可以分化形成根原基細胞，在一定條件下可發(fā)育形成不定根[29]，如灑金柏Platycladus orientalis[30]等多數(shù)針葉樹種均屬于此類。②愈傷組織的產(chǎn)生與不定根形成無直接因果關系、彼此獨立[31]。這類愈傷組織通常不能形成根原基，只能分化形成獨立的維管束、輸導組織等，在插穗與基質之間無機鹽、水分等物質交換過程中起著中介作用，如灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides[32]等屬于此類。③愈傷組織的產(chǎn)生不利于不定根的發(fā)生、發(fā)育[33]。如高度發(fā)達的愈傷組織抑制了白樺Betula platyphylla嫩枝插穗根原基細胞的分化，進而阻礙了不定根的形成[34]。本研究發(fā)現(xiàn)：‘長葉阿爾塔’插穗愈傷組織產(chǎn)生與不定根發(fā)生、發(fā)育彼此獨立，適度分化的愈傷組織能夠保護切口免受外界病菌侵入，防止插穗內有效物質的流失，還可以充當水分等物質交換的橋梁。但過度分化的愈傷組織會占用插穗內部的營養(yǎng)物質，抑制不定根的形成。

4 結論

冬青‘長葉阿爾塔’插穗經(jīng) 1 000 mg·L-1IBA 溶液速蘸 10 s，扦插在V(草炭)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶3∶4或4∶3∶3的基質中可獲得較高的生根率，其插穗生根類型屬于皮部誘導生根型，根原基起源于髓射線與維管形成層交叉處，環(huán)狀厚壁組織是阻礙其插穗生根的機械原因?！L葉阿爾塔’插穗愈傷組織中并未觀察到根原基發(fā)端細胞，其產(chǎn)生與不定根發(fā)生、發(fā)育彼此獨立，可分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，胚性愈傷組織多為白色，其表面細胞體積較小且排列緊密，常成團分布，細胞核大質濃，細胞器豐富；非胚性愈傷組織細胞多為黃色，其表面細胞大多死亡破裂，空泡化明顯，幾乎沒有細胞器。