孫婧瑜，蘇亞娟，董靜梅

骨骼肌作為脂肪酸氧化代謝的主要場所，在維持機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)中起到了重要的調(diào)控作用（Sanchez et al.，2012）。目前，研究認(rèn)為骨骼肌脂肪酸攝入的增加和/或氧化的減少導(dǎo)致骨骼肌脂肪酸堆積，過多的脂肪酸堆積又將進(jìn)一步損害胰島素信號(hào)通路，從而導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，最終發(fā)生2型糖尿?。℅oodpaster et al.，2004）。然而，骨骼肌脂肪酸代謝紊亂與胰島素抵抗間的分子聯(lián)系尚未闡明。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，被認(rèn)為是2型糖尿病和代謝綜合征治療中一種有效的胰島素增效藥物，能將細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝與胰島素代謝信號(hào)通路聯(lián)系起來（Smith et al.，2017）。AMPK的激活一方面導(dǎo)致骨骼肌脂肪酸氧化代謝增加（O’Neill et al.，2014），另一方面促進(jìn)線粒體生物發(fā)生（O’Neill et al.，2013），從而調(diào)節(jié)骨骼肌脂肪酸的代謝平衡，最終改善胰島素敏感性。近期研究顯示，AMPK的激活除了受AMP/ATP比值的主要調(diào)控外，還受其他分子機(jī)制的調(diào)控，即依賴AMP/ATP比值的改變和不依賴AMP/ATP比值的改變（Ke et al.，2018）。肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）被認(rèn)為是胰島素外周組織中激活A(yù)MPK的主要上游激酶，可直接磷酸化AMPK，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝（Lee et al.，2007）。目前，多數(shù)研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)可能通過影響AMP/ATP的比值，促進(jìn)LKB1激酶對(duì)AMPK的激活（Jeppesen et al.，2013）。然而，是否還有其他途徑激活LKB1-AMPK信號(hào)通路，尚不清楚。另外，不同生理?xiàng)l件下LKB1如何激活A(yù)MPK，亦不明確。因此，本研究著重探討不同生理?xiàng)l件下激活A(yù)MPK的上游信號(hào)通路及其在改善骨骼肌脂肪酸氧化代謝中的作用。

近年來，與脂肪酸代謝有關(guān)的膜蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（fatty acid transport protein-1，F(xiàn)ATP-1）、膜脂肪酸結(jié)合蛋白（plasma membrane fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABPpm）及脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36）在肌肉中均有大量表達(dá)（Febbraio et al.，2008）。其中，CD36更以分布廣泛且功能機(jī)制復(fù)雜多樣而備受關(guān)注。鑒于脂肪酸氧化代謝與胰島素抵抗和2型糖尿病間的密切關(guān)系，許多研究開始關(guān)注CD36在胰島素抵抗防治中的作用。我們前期研究結(jié)果顯示，CD36通過介導(dǎo)Fyn-LKB1復(fù)合物在胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化及相互作用，激活A(yù)MPK，從而對(duì)骨骼肌脂肪酸氧化代謝進(jìn)行直接調(diào)控（Samovski et al.，2015）。另有研究顯示，與其他脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相比，CD36在運(yùn)動(dòng)等能量需求較大時(shí)，對(duì)骨骼肌脂肪酸代謝的調(diào)控作用可能更為重要（Holloway et al.，2009）。因此，本研究以CD36-LKB1信號(hào)通路為切入點(diǎn)，通過構(gòu)建兩種不同的生理?xiàng)l件（高脂膳食與有氧運(yùn)動(dòng)）動(dòng)物模型，借助細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)，著重探討CD36是如何通過激活A(yù)MPK對(duì)骨骼肌脂肪酸氧化代謝進(jìn)行調(diào)控的。

1 材料與方法

1.1 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA干擾

小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞系在6孔板內(nèi)培養(yǎng)，以生長培養(yǎng)基（高糖DMEM、10%小牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)2天后，改用分化培養(yǎng)基（高糖DMEM、2%馬血清、1%谷氨酸、1%青霉素/鏈霉素）進(jìn)行分化培養(yǎng)4～6天。在C2C12細(xì)胞分化第3天時(shí)，換用無抗生素的分化培養(yǎng)基，分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行siRNA干擾：siCont、siCD36（#1和#2）。siCont：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；siCD36-1：5’-GGAUGACAACUUCACAGUUTT-3’；siCD36-2：5’-CCACAUUUCCUACAUGCAATT-3’購買于 Gene Phar‐ma公司。

6孔板中每孔加入A液（150 μl Optimem、1.5 μl 20 umol/L siRNA）和B液（150 μl Optimem、3 μl Lipofectamine RNAiMAX）（Life Technologies公司）后，將混合物于室溫放置5 min，加入C2C12細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)箱孵育6 h后，換回分化培養(yǎng)基，繼續(xù)分化培養(yǎng)2天。然后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低糖DMEM及無血清饑餓過夜，并用含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細(xì)胞，用于后續(xù)檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

17只8周齡C57BL/6雄性小鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）于同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)訓(xùn)練。小鼠自由進(jìn)食飲水。環(huán)境溫度20℃～24℃，相對(duì)濕度40%～60%，通風(fēng)良好，晝夜12 h/12 h循環(huán)照明。所有操作均嚴(yán)格遵守同濟(jì)大學(xué)道德倫理委員會(huì)的要求。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control group，CON；n=6）、高脂組（high fat diet group，HFD；n=6）和有氧運(yùn)動(dòng)組（exercise group，EX；n=5）。對(duì)照組方案：自由飲食，以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8周。高脂膳食方案：高脂飼料（脂肪：60%kcal、碳水化合物：20%kcal、蛋白質(zhì)：20%kcal）喂養(yǎng)8周。有氧運(yùn)動(dòng)方案：小鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練1周后，以20 m/min跑速，6次/周，60 min/次進(jìn)行運(yùn)動(dòng)并持續(xù)至第8周?；A(chǔ)飼料及高脂飼料均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 動(dòng)物取材

最后一次實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，對(duì)小鼠禁食12 h，然后取材。小鼠麻醉后頸椎脫位致死，迅速分離雙側(cè)腓腸肌，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光、電鏡、酶活等實(shí)驗(yàn)檢測。剩余組織置于-80℃冰箱冷凍待用。

1.4 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

取60～80 mg腓腸肌置于含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（Beyotime公司）中，剪碎后充分勻漿（或C2C12細(xì)胞裂解液），冰上靜置30 min后，離心機(jī)12 000 rpm、4℃離心10 min，取上清。BCA法（#20201ES76，YESEN公司）測定蛋白樣品濃度后進(jìn)行煮沸變性。蛋白樣品經(jīng)過SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜。p AMPK（T172）（#2535）、p ACC（S79）（#3661）購買于 Cell signaling公司，CD36（AF2519）購買于R&D systems公司，PGC-1α（H-300）（sc-13067）購買于 Santa Cruz Biotechnology公司 ，GAPDH（G8795）購買于Sigma-Aldrich公司。TBST洗膜3次，每次 5 min，二抗（1∶5 000）室溫孵育 1 h。采用 ECL（#36208ES60，YESEN公司）發(fā)光法檢測目標(biāo)蛋白條帶，并用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)

制備腓腸肌冰凍切片，置于4%多聚甲醛冰上固定60 min，室溫封閉 60 min后，加入 LKB1一抗（LKB1，1∶200，5c10，Millipore公司），4℃孵育過夜。然后加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗（1∶500），室溫孵育 60 min。滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑（#36308ES11，YESEN公司）封片。使用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。熒光強(qiáng)度反映LKB1蛋白表達(dá)的變化情況，共定位程度反映LKB1向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位的情況。

1.6 超微結(jié)構(gòu)透射電鏡實(shí)驗(yàn)

剪取體積為3 mm×3 mm×3 mm的骨骼肌組織，取材過程中盡量減小對(duì)組織的牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷，迅速投入2.5%戊二醛固定液中，4℃固定3 h以上。然后用0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS（pH 7.4）漂洗3次，每次10 min，0.5%的鋨酸0.1 mol/L固定3 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS（pH 7.4）漂洗3次，每次10 min，依次放入50%、70%、80%、90%、95%、100% 酒精中脫水，每次 15 min。Spurr樹脂浸透包埋，70℃聚合48 h。切片機(jī)切60～80 nm超薄切片，鈾鉛雙染色（2%醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，各染色10 min），切片室溫干燥，于透射電子顯微鏡下進(jìn)行拍攝。

1.7 線粒體呼吸鏈酶活性檢測

根據(jù)說明書，使用相應(yīng)的分析試劑盒（南京建城生物工程研究所）測定骨骼肌中腺苷三磷酸酶（ATP synthase，ATPase）及檸檬酸合成酶（citrate synthetase，CS）的活性。用TECAN微孔板法記錄吸光度。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SEM）表示。組間比較采用ANOVA單因素方差分析，顯著性差異水平設(shè)置為P＜0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 CD36缺乏對(duì)骨骼肌細(xì)胞脂肪酸氧化代謝信號(hào)通路AMPK/ACC激活的影響

圖1顯示，經(jīng)siCD36干擾后的C2C12細(xì)胞中CD36蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.001），說明本實(shí)驗(yàn)中的CD36基因敲低效率較好。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siCD36干擾后的C2C12細(xì)胞，AMPK、乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC）磷酸化水平顯著增加（P＜0.01，P＜0.05），說明CD36基因缺乏能夠激活骨骼肌細(xì)胞脂肪酸氧化信號(hào)通路。

圖1 CD36缺乏對(duì)C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Figure 1.Effect of CD36 Deficiency on Related Protein Expression Levels in C2C12 Cells

2.2 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的影響

圖2顯示，與CON組小鼠相比，8周高脂膳食能夠誘導(dǎo)小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的增加（P＜0.01）；然而，經(jīng)過8周有氧運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平雖有增加的趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與HFD組相比，EX組小鼠骨骼肌CD36蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。該結(jié)果說明，不同生理?xiàng)l件下，小鼠骨骼肌CD36蛋白表達(dá)水平不同。

圖2 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌CD36蛋白表達(dá)水平的影響Figure 2. Effect of Different Physiological Conditions on the Expression Levels of CD36 Protein in Skeletal Muscle of Mice

2.3 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌AMPK/ACC信號(hào)通路激活的影響

與CON組小鼠相比，經(jīng)過8周高脂膳食干預(yù)的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.05，圖3）；經(jīng)過8周有氧運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌AMPK蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.05）。與高脂膳食組小鼠相比，經(jīng)過8周有氧運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果說明，不同生理?xiàng)l件刺激對(duì)小鼠骨骼肌AMPK/ACC信號(hào)通路激活程度不同。

圖3 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌AMPK/ACC信號(hào)通路激活的影響Figure 3.Effect of Different Physiological Conditions on the AMPK/ACC Signaling Pathway Activation in Skeletal Muscle of Mice

2.4 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌LKB1向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的影響

本研究進(jìn)一步評(píng)估不同生理?xiàng)l件下LKB1的胞內(nèi)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)位。小鼠骨骼肌組織LKB1免疫熒光檢測結(jié)果顯示，LKB1被標(biāo)記為綠色熒光，細(xì)胞核被DAPI標(biāo)記為藍(lán)色，二者的共定位重疊區(qū)域?yàn)樗{(lán)綠色（圖4）。本研究結(jié)果顯示，與CON組相比，HFD組綠色熒光與細(xì)胞核共定位程度較為明顯，說明HFD能夠誘導(dǎo)LKB1向細(xì)胞核聚集。與HFD組相比，EX組綠色熒光與細(xì)胞核共定位區(qū)域減少。

圖4 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌LKB1向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的影響（×400）Figure 4.Effect of Different Physiological Conditions on LKB1 Translocation to Cell Nucleus in Skeletal Muscle of Mice（×400）

2.5 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌線粒體生物發(fā)生調(diào)控因子PGC-1α蛋白表達(dá)水平的影響

圖5顯示，與CON組小鼠相比，經(jīng)過8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)的小鼠骨骼肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coacti‐vator-1，PGC-1α）蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），該結(jié)果說明，有氧運(yùn)動(dòng)可能通過增加PGC-1α的表達(dá)，促進(jìn)線粒體生物發(fā)生。然而，與CON組相比，經(jīng)過8周高脂膳食干預(yù)的小鼠骨骼肌PGC-1α蛋白表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌PGC-1α總蛋白表達(dá)水平的影響Figure 5. Effect of Different Physiological Conditions on the Expression Levels of PGC-1α Protein in Skeletal Muscle of Mice

2.6 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)的影響

在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，CON組小鼠骨骼肌肌絲結(jié)構(gòu)清晰，肌小節(jié)排列整齊，橫紋清楚，Z線、M線結(jié)構(gòu)清晰，肌絲間線粒體排列整齊，呈橢圓形，嵴結(jié)構(gòu)清晰，排列密集。HFD組骨骼肌肌絲結(jié)構(gòu)明顯紊亂，典型肌小節(jié)結(jié)構(gòu)消失，大部分線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的破壞，表現(xiàn)為線粒體排列紊亂，腫脹，部分嚴(yán)重的線粒體嵴和基質(zhì)消失出現(xiàn)空泡樣改變。EX組骨骼肌結(jié)構(gòu)較為清晰、肌小節(jié)排列較整齊，線粒體數(shù)量增多、體積增大、形態(tài)較HFD明顯改善（圖6）。

圖6 透射電鏡下不同生理?xiàng)l件小鼠骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變Figure 6.Ultrastructural Changes of Muscular Mitochondria Under Transmission Electron Microscope

2.7 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌線粒體相關(guān)酶活性的影響

線粒體呼吸鏈相關(guān)酶的活性已廣泛應(yīng)用于線粒體功能的估計(jì)（Lobo-Jarne et al.，2008）。因此，我們通過檢測ATPase活性和CS活性來評(píng)估不同生理?xiàng)l件對(duì)骨骼肌線粒體功能的影響。研究結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)顯著增加ATPase活性（P＜0.05），而高脂膳食干預(yù)顯著降低CS的活性（P＜0.05）。說明高脂膳食能降低線粒體功能，運(yùn)動(dòng)干預(yù)能改善線粒體功能。

圖7 不同生理?xiàng)l件對(duì)小鼠骨骼肌線粒體酶活性的影響Figure 7.Effect of Different Physiological Conditions on Mitochondrial Related Enzymes Activities in Skeletal Muscle of Mice

3 分析與討論

高脂膳食是導(dǎo)致飲食性肥胖發(fā)生的重要原因之一，而適量的運(yùn)動(dòng)是目前國際上公認(rèn)的控制飲食性肥胖安全、有效的途徑。AMPK作為一種細(xì)胞內(nèi)能量傳感器和調(diào)節(jié)劑，在細(xì)胞能量消耗時(shí)被激活，從而誘導(dǎo)ACC的失活，增加骨骼肌脂肪酸的氧化代謝。然而，激活A(yù)MPK/ACC的上游信號(hào)分子，尚不清楚。因此，本研究利用高脂膳食及有氧運(yùn)動(dòng)兩種不同生理?xiàng)l件，著重探討了CD36作為信號(hào)分子，可能通過誘導(dǎo)LKB1的胞內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活A(yù)MPK/ACC信號(hào)通路，并且通過調(diào)控PGC-1α改善線粒體數(shù)量及功能，最終對(duì)骨骼肌脂肪酸氧化代謝進(jìn)行調(diào)控。

3.1 不同生理?xiàng)l件對(duì)CD36-AMPK信號(hào)通路的影響

CD36是細(xì)胞表面重要的FA受體，與骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系密切（Samovski et al.，2018）。在肥胖人群及2型糖尿病患者的骨骼肌細(xì)胞膜上均發(fā)現(xiàn)了CD36高表達(dá)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過量累積，這可能是骨骼肌胰島素抵抗發(fā)生的重要原因之一（Bonen et al.，2004）。激活的AMPK一方面通過誘導(dǎo)GLUT4和CD36向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位（Hames et al.，2014），增加骨骼肌胰島素敏感性；另一方面，激活的AMPK通過ACC的失活來增加長鏈脂肪酸β氧化，從而增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)消耗。因此，骨骼肌中AMPK信號(hào)受損與FA氧化能力下降及胰島素抵抗發(fā)生有關(guān)（Tanaka et al.，2001）。與AMPK相似，CD36能夠促進(jìn)FA向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響骨骼肌脂肪酸的攝取及氧化。禁食、機(jī)械收縮等生理?xiàng)l件均能誘導(dǎo)CD36向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位（Silverstein et al.，2009）。因此，CD36誘導(dǎo)的FA攝取和氧化的協(xié)同增加有助于胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞FA代謝。

本研究首先利用小RNA干擾技術(shù)，在細(xì)胞水平上探討CD36缺失對(duì)AMPK/ACC信號(hào)通路的影響。結(jié)果表明，CD36基因沉默能夠顯著增加AMPK/ACC磷酸化水平，說明CD36基因缺乏能夠激活骨骼肌細(xì)胞脂肪酸氧化代謝信號(hào)通路。然后，進(jìn)一步研究不同生理?xiàng)l件下CD36對(duì)AMPK/ACC信號(hào)通路激活的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在CD36高表達(dá)的高脂膳食組，AMPK/ACC磷酸化水平顯著降低；與高脂膳食組相比，在CD36低表達(dá)的有氧運(yùn)動(dòng)組，AMPK/ACC磷酸化水平顯著增加。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞水平上的結(jié)論，即CD36可能作為信號(hào)分子對(duì)AMPK激活進(jìn)行調(diào)控。然而，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌CD36的表達(dá)無顯著影響，說明有氧運(yùn)動(dòng)可能不通過CD36總蛋白的調(diào)控激活A(yù)MPK/ACC信號(hào)通路。

高脂膳食能夠增加CD36蛋白表達(dá)，該結(jié)果與Roep‐storff等（2004）的研究相一致。這可能是因?yàn)樵诟咧攀车某掷m(xù)作用下，CD36作為骨骼肌中重要的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，通過誘導(dǎo)自身表達(dá)的變化，增加外源性脂肪酸的攝入，以促進(jìn)線粒體的氧化代謝，從而消耗掉攝入的過量脂肪酸，對(duì)骨骼肌脂質(zhì)堆積起到保護(hù)作用。然而，經(jīng)過長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌CD36總蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)多元化的調(diào)控。有研究顯示，急性耐力運(yùn)動(dòng)能夠誘導(dǎo)人體骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平的增加（Holloway et al.，2006）。然而，對(duì)有兩年以上耐力訓(xùn)練經(jīng)歷的受試者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)長期的耐力訓(xùn)練并不能提高股外側(cè)肌CD36總蛋白的表達(dá)（Kiens et al.，2004）。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，經(jīng)過8周有氧運(yùn)動(dòng)的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達(dá)水平雖有增加的趨勢，但無顯著性差異。結(jié)合他人的研究結(jié)果，推測CD36蛋白表達(dá)水平可能與有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)的時(shí)間及干預(yù)方式有關(guān)。比如，骨骼肌CD36蛋白表達(dá)水平的升高可能是對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練初期的一個(gè)暫時(shí)性的適應(yīng)過程，而這種適應(yīng)性的過程可能會(huì)隨著運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)間的延長而逐漸消退。因此，在今后的研究中，可以選取運(yùn)動(dòng)初期、運(yùn)動(dòng)中期以及運(yùn)動(dòng)末期的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測，從而可以更清晰地反映CD36總蛋白含量在運(yùn)動(dòng)適應(yīng)過程中的變化。

研究顯示，長期高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖或胰島素抵抗大鼠骨骼肌中AMPK磷酸化水平顯著減少（Lessard et al.，2007）。Liu等（2006）發(fā)現(xiàn)，5個(gè)月的高脂膳食能夠?qū)е鹿趋兰MPK、ACC蛋白的磷酸化水平顯著下降，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。主要原因可能是，長期的高脂膳食一方面可能通過降低AMPK/ACC的磷酸化水平，損傷骨骼肌脂肪酸氧化代謝；另一方面，在高脂膳食的作用下，進(jìn)一步導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)脂肪酸的堆積，從而影響胰島素敏感性。本研究結(jié)果亦顯示，高脂膳食能顯著降低骨骼肌AMPK、ACC蛋白磷酸化水平。另外，本研究結(jié)果顯示，有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)能增加骨骼肌AMPK、ACC的蛋白磷酸化水平，該結(jié)果與Cao等（2012）的研究結(jié)果相一致。這可能是由于有氧運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌AMPK、ACC磷酸化水平增加是對(duì)能量失衡的一種代償性適應(yīng)過程。綜上所述，CD36可能作為信號(hào)分子激活A(yù)MPK。然而，CD36激活A(yù)MPK的途徑，尚不清楚。

3.2 不同生理?xiàng)l件下LKB1胞內(nèi)轉(zhuǎn)位對(duì)AMPK激活的作用

LKB1作為AMPK上游分子，可以對(duì)AMPK進(jìn)行直接調(diào)控，從而參與骨骼肌FA氧化代謝（Hardie et al，2013）。然而，不同生理?xiàng)l件下LKB1對(duì)AMPK的激活作用，尚不清楚。目前，對(duì)蛋白胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的研究技術(shù)相對(duì)成熟。因此，我們前期工作已有效鎖定LKB1胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化對(duì)AMPK激活的效應(yīng)方式，即棕櫚酸作為CD36的配體，通過減少CD36與Fyn的結(jié)合能力，減少Fyn對(duì)LKB1的激活，從而抑制LKB1向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，使滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LKB1增多，從而激活A(yù)MPK，最終對(duì)脂肪酸氧化代謝起到調(diào)控作用（Samovski et al.，2015）。然而，不同生理?xiàng)l件下是否也通過影響CD36，抑制LKB1向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，激活A(yù)MPK信號(hào)通路，從而改善骨骼肌脂肪酸氧化代謝，尚不清楚。因此，我們進(jìn)一步評(píng)估了不同生理?xiàng)l件下LKB1的胞內(nèi)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)位。研究結(jié)果顯示，HFD組LKB1與細(xì)胞核共定位程度較為明顯，說明高脂膳食干預(yù)能夠誘導(dǎo)LKB1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，這可能是激活A(yù)MPK的重要原因，該結(jié)果與Thomson等（2007）的研究結(jié)果相一致。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，AMPK缺失對(duì)AICAR誘導(dǎo)的FA氧化代謝無影響（Dzamko et al.，2008）。這可能是因?yàn)長KB1的下游靶點(diǎn)除了AMPK外，還有其他下游靶點(diǎn)對(duì)FA氧化代謝進(jìn)行調(diào)控。因此，我們進(jìn)一步探討了不同生理?xiàng)l件下LKB1胞內(nèi)轉(zhuǎn)位激活的其他下游靶點(diǎn)。

在線粒體能量代謝過程中，PGC-1α作為一種激活劑，在協(xié)調(diào)線粒體生物發(fā)生及代謝相關(guān)信號(hào)通路中起著重要的作用。最直接的證據(jù)是PGC-1α基因的過表達(dá)能夠增加線粒體數(shù)量，提高線粒體功能。相反，PGC-1α的缺失導(dǎo)致線粒體功能障礙及代謝紊亂（Handschin et al.，2007）。因此，PGC-1α可能是LKB1作用的下游靶點(diǎn)之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可能通過調(diào)控骨骼肌PGC-1α和線粒體相關(guān)酶的表達(dá)，改善線粒體功能（Jager et al.，2007）。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)能激活小鼠骨骼肌AMPK，增加PGC-1α表達(dá)及線粒體數(shù)量。結(jié)果表明，AMPK激活至少可以部分通過調(diào)控PGC-1α，增加線粒體的數(shù)量及其功能。這可能是因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的能量缺乏，通過增加AMP/ATP的比率啟動(dòng)了AMPK/PGC-1α途徑。AMPK/PGC-1α是調(diào)控線粒體能量代謝的重要信號(hào)途徑，通過感知細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)對(duì)線粒體生物發(fā)生及其功能進(jìn)行直接調(diào)控，與糖尿病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切（Wu et al.，2016）。

綜上所述，我們提出以下科學(xué)假設(shè)：HFD誘導(dǎo)的CD36高表達(dá)，促進(jìn)LKB1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，使滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LKB1減少，從而減少了LKB1對(duì)AMPK的激活作用。AMPK激活的減少，一方面能夠抑制ACC的磷酸化，減少脂肪酸的氧化代謝；另一方面通過調(diào)控線粒體相關(guān)基因，減少線粒體的數(shù)量，損傷線粒體功能（圖8）。

圖8 CD36/LKB1/AMPK信號(hào)通路在調(diào)控骨骼肌脂肪酸氧化代謝中的作用機(jī)制示意圖Figure 8.The Role of CD36/LKB1/AMPK Signaling Pathway in Regulating Skeletal Muscle FA Oxidation Metabolism

4 結(jié)論

本研究在細(xì)胞及組織層面上證實(shí)CD36作為信號(hào)分子，而非脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，當(dāng)siRNA誘導(dǎo)CD36低表達(dá)時(shí)，激活A(yù)MPK；而HFD誘導(dǎo)CD36高表達(dá)時(shí)，通過誘導(dǎo)LKB1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，抑制AMPK/ACC信號(hào)通路激活，從而對(duì)脂肪酸氧化代謝進(jìn)行調(diào)控。