李芳釗 霍瑞卿 韓宇帆 孫闊 田軍彪

腦梗死后及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)血流會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性和腦水腫和細(xì)胞凋亡等一系列聯(lián)級(jí)反應(yīng)，這一現(xiàn)象稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemic reperfusion injury，CIRI)。腦水腫會(huì)引起并加重遲發(fā)性神經(jīng)元損傷，是腦缺血再灌注過程中重要病理環(huán)節(jié)，影響患者功能恢復(fù)和愈后，是病情惡化、降低治療效果的重要原因[1]。水通道蛋白(aquaporin，AQP)作為一種跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外水平衡，其在腦水腫病理生理學(xué)機(jī)制中起到重要作用。在腦內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的AQPs中，AQP4與AQP9是腦內(nèi)表達(dá)量最多、與缺血性腦損傷發(fā)生后腦組織含水量增加密切相關(guān)的水通道蛋白[2-3]。由于大腦水通道蛋白主要作用機(jī)制為調(diào)節(jié)組織細(xì)胞內(nèi)水液代謝，因此當(dāng)腦組織出現(xiàn)水腫等異常水液代謝時(shí)，調(diào)控AQP4和AQP9的表達(dá)可能起著關(guān)鍵作用。本課題通過運(yùn)用經(jīng)驗(yàn)方化濁解毒活血通絡(luò)方，觀察大腦水通道蛋白表達(dá)水平，探究化濁解毒活血通絡(luò)方減輕腦缺血再灌注損傷急性期大鼠腦水腫的可能調(diào)節(jié)機(jī)制及潛在作用靶點(diǎn)，為臨床治療缺血性腦血管疾病提供廣闊思路和科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供動(dòng)物許可證：SCXK(京) 2016-0006。提供適宜生存環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水，定期更換墊料。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組

1.2.1 動(dòng)物模型建立 參照Longa法[4]并結(jié)合既往研究經(jīng)驗(yàn)制備大腦中腦動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型：術(shù)前12小時(shí)禁食不禁水。全程無菌操作。大鼠稱重嚴(yán)格控制在250～280 g范圍內(nèi)，通過腹腔注射10%的水合氯醛醛3 mL/kg麻醉，頸部備皮，碘伏消毒后做頸部正中切口，充分暴露并剝離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)、外分叉處系一活結(jié)，頸外動(dòng)脈分別于近頭端和靠近頸內(nèi)、外分叉處系2個(gè)死結(jié)，頸總動(dòng)脈系活結(jié)處和頸內(nèi)動(dòng)脈處使用微動(dòng)脈夾阻斷血流，在2個(gè)死結(jié)之間用動(dòng)脈剪斜行剪開一個(gè)“V”形小口，將實(shí)驗(yàn)前備好的魚線線栓(直徑0.26 mm、長(zhǎng)3 cm、過蠟2 mm)從開口處插入血管，輕系分叉處活結(jié)用來固定線栓，將線栓進(jìn)入到頸總動(dòng)脈時(shí)，剪斷頸外動(dòng)脈近頭端處死結(jié)，通過提起頸外動(dòng)脈上剩余所系死結(jié)并轉(zhuǎn)換方向?qū)⒕€栓從頸總動(dòng)脈轉(zhuǎn)至頸內(nèi)動(dòng)脈，取下頸內(nèi)動(dòng)脈微動(dòng)脈夾，將線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈送至大腦中動(dòng)脈始端，從分叉處起計(jì)算插入18～22 mm，栓塞大腦中動(dòng)脈，造成局灶性腦缺血，然后取下頸總動(dòng)脈處微動(dòng)脈夾進(jìn)行再灌注，用蘸取生理鹽水的濕棉球覆蓋頸部術(shù)口，再灌注2小時(shí)后取下棉球，并拔除線栓，然后將固定線栓活結(jié)系成死結(jié)，全面消毒處理，逐層進(jìn)行縫合。假手術(shù)組大鼠操作基本同上，但只將線栓插入10 mm即拔出。將術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，為保證大鼠術(shù)后正常進(jìn)食給予相對(duì)較為松軟鼠糧，以便降低死亡率。于腦缺血再灌注后1小時(shí)，采用Longa 5級(jí)4分制標(biāo)準(zhǔn)篩選MCAO大鼠，1～3分納入實(shí)驗(yàn)。0分、4分或術(shù)中、術(shù)后死亡的予以剔除，從備用組中隨機(jī)補(bǔ)充。

1.2.2 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組。待大鼠模型制備完畢后，再次用隨機(jī)數(shù)字表法將MCAO模型大鼠分為模型組、化濁解毒活血通絡(luò)方高劑量組、化濁解毒活血通絡(luò)方低劑量組和尼莫地平組，各組均有12只大鼠?；瘽峤舛净钛ńj(luò)方高和低劑量組造模后連續(xù)3天分別給25 g/(kg·d)、6.25 g/(kg·d)灌胃，尼莫地平組造模后連續(xù)3天給10 g/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組連續(xù)3天給等劑量生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

尼莫地平片，30 mg/片，拜爾醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號(hào)BJ27586。化濁解毒活血通絡(luò)方(配方顆粒)：石菖蒲15 g、地龍15 g、茯苓15 g、澤瀉6 g、黃連6 g、川芎9 g、丹參15 g、赤芍15 g、當(dāng)歸9 g、郁金15 g。購于河北省中醫(yī)院，廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)，密封保存?zhèn)溆茫辔盖凹訜嶂吝m宜溫度。

1.4 主要儀器及實(shí)驗(yàn)試劑

紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司，規(guī)格型號(hào)：756MC)；電動(dòng)勻漿機(jī)(IKA，規(guī)格型號(hào)：S25)；基因擴(kuò)增儀(美國AB，規(guī)格型號(hào)：2720)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD，規(guī)格型號(hào)：CFX96)；高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma，規(guī)格型號(hào)：1-15K)。DEPC(Sigma，貨號(hào)：D5758)；Eastep Super Total RNA ExtractionKit(Promega，貨號(hào)：LS1040)；GoTaq qPCR Master Mix(Promega，貨號(hào)：A6002)；Primers(生工上海總部合成部，貨號(hào)：260064816)；beta-Actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0061R)；AQP4(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0634R)；AQP9(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-2060R)。

1.5 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

每組大鼠于給藥3天后，應(yīng)用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分進(jìn)行評(píng)估。主要根據(jù)運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡、反射喪失和不正常運(yùn)動(dòng)四個(gè)項(xiàng)目展開評(píng)估，范圍為0～18分：13～18為重度神經(jīng)功能損傷，7～12分為中度神經(jīng)功能損傷，1～6分為輕度神經(jīng)功能損傷。

1.6 腦梗死體積測(cè)定

每組取3只大鼠于給藥3天后，通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉后迅速在3分鐘內(nèi)斷頭取腦,將腦組織置于-20℃冰箱,冷凍10分鐘后取出放置于特定腦膜裝置內(nèi)，在枕葉與額極之間，每間隔2 mm連續(xù)做5個(gè)大腦冠狀切片，將切片立即置于2%氯化-2,3,5-三氯苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)磷酸緩沖液中避光，37℃恒溫孵育30分鐘，期間每5分鐘搖勻組織，使腦組織與TTC溶液充分接觸。將染色后腦片置于4%多聚甲醛中固定24小時(shí)后數(shù)碼相機(jī)拍照，隨后應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行圖像處理，計(jì)算梗死灶體積(正常腦組織著深紅色，梗死腦組織成白色)。梗死灶體積=(正反面梗死面積之和/2)×腦片厚度, 以梗死體積占整腦體積百分比(梗死率)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 腦組織病理學(xué)觀察

每組取3只大鼠于給藥3天后，通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉后迅速斷頭取腦，4%多聚甲醛中固定，橫斷面切取5 mm厚切片，石蠟包埋，切片后常規(guī)脫蠟，進(jìn)行蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。

1.8 腦組織含水率測(cè)定

每組取3只大鼠于給藥3天后，采用干濕重法，通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，在冰板上操作解剖，剝離顱骨，迅速取出腦組織，去除嗅腦、小腦、腦干等組織，使用濾紙吸盡腦表面血漬后，從中線分離左右兩側(cè)大腦半球，取病變側(cè)腦組織放在備用濾紙已調(diào)零的電子天平上，稱取濕重，然后置于80℃烤箱內(nèi)烘干至恒重后取出，再稱取干重，按照公式計(jì)算腦組織含水率：腦組織含水率=[(濕重-干重)/濕重] ×100%。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AQP4 mRNA、AQP9 mRNA含量

每組取3只大鼠于給藥3天后，通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉后迅速斷頭取腦，并選取缺血半暗帶腦組織，稱取5～20 mg動(dòng)物組織經(jīng)液氮研磨，轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管，加入0.3 M的LRNA裂解液,勻漿裂解樣品，按照試劑盒說明書提取總RNA。使用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cRNA，以 beta-actin作為內(nèi)參，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為20 μL：GoTaq qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cRNA模板2 μL，去離子水7.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10分鐘，95℃變性15秒，60℃退火60秒，共44個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用公式Q=2-ΔCq進(jìn)行處理,得到每個(gè)目的基因的Q值及Q均值，再以每個(gè)目的基因的Q值/Q均值，即各目的基因表達(dá)的相對(duì)定量(relative quantity，RQ)值，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。AQP4上游引物：5′-TGCATTTTCTAGCAGTGGCAG-3′，下游引物：5′-GAGAGGGATCAAATGGGGGTG-3′；AQP9上游引物：5′-TCACCTCCAGAGATCCGTGT-3′，下游引物：5′-CTCGGTTCCCTGCTTTCACT-3′； beta-actin上游引物：5′-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3′，下游引物：5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3′。

1.10 蛋白免疫印跡法檢測(cè)AQP4、AQP9蛋白表達(dá)量

每組取3只大鼠于給藥3天后，通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉后迅速斷頭取腦，并選取缺血半暗帶腦組織，加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用玻璃勻漿器將腦組織勻漿，以12000 g離心5分鐘后取上清。采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定提取液的蛋白濃度，煮沸變性后保存于-20℃。配制并灌注SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠，上樣量為8 μL，先60 V(8 v/cm)跑下成層膠，再120 V(16 v/cm)走分離膠。電泳結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane,NC膜)上，小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動(dòng)狀態(tài)下封閉2小時(shí)，再加入稀釋好的一抗工作液AQP4(12000)、AQP9(12000)和β-actin(12000)，4℃反應(yīng)過夜。取出NC膜，以1×PBST洗滌三次，(室溫下快速搖動(dòng)洗滌)每次10分鐘，放入二抗工作液中，作用90分鐘，用1×PBST洗滌三次，(室溫下快速搖動(dòng)洗滌)每次10分鐘。將NC膜平放至覆有保鮮膜的暗盒中，將1∶1(v/v)混合發(fā)光試劑盒中Luminol Reagent and Peroxide Solution液均勻鋪在NC膜表面，再將保鮮膜折疊，以包裹住NC膜。根據(jù)條帶的亮度適當(dāng)?shù)倪x擇曝光時(shí)間。電腦軟件直接讀片。對(duì)所采取的電腦圖片，調(diào)整好合適的對(duì)比度及光亮度，用Quantity one軟件測(cè)定目的條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損的影響

藥物治療3天后：假手術(shù)組大鼠無明顯的神經(jīng)功能缺損，模型組及各用藥組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。與假手術(shù)組相比，模型組及各用藥組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，中藥高劑量組、中藥低劑量組及尼莫地平組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著降低(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組及尼莫地平組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著下降(P<0.05)；中藥高劑量組與尼莫地平組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組腦缺血再灌注損傷大鼠給藥3天后神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.2 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病理形態(tài)的影響

光鏡下，假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊密整齊，層次分明，未見異常改變。模型組病灶中心壞死區(qū)范圍較大，神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏紊亂，大面積水腫疏松、空泡化，細(xì)胞核體積變小、深染，核固縮、核碎裂及溶解，胞漿染色變淡。與模型組相比，中藥各劑量組及尼莫地平組，病灶中心壞死區(qū)范圍減小，神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏紊亂減輕，大面積水腫疏松、空泡化、細(xì)胞核體積變小、深染及核固縮、核碎裂、溶解、胞漿染色變淡等均減輕，提示腦水腫明顯減輕。其中，中藥高劑量組及尼莫地平組梗死區(qū)減小更明顯。見圖1。

注：A假手術(shù)組，B模型組，C中藥低劑量組，D中藥高劑量組，E尼莫地平組。圖1 各組腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)比較(HE，×400)

2.3 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死率的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織未見梗死灶，模型組及各用藥組大鼠腦冠狀切面可見蒼白梗死區(qū)。與模型組相比，中藥高劑量組、中藥低劑量組與尼莫地平組梗死率均明顯降低(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組和尼莫地平組梗死率均明顯降低(P<0.05)；中藥高劑量組與尼莫地平組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表2。

表2 各組腦缺血再灌注損傷大鼠TTC染色梗死率比較

2.4 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦水腫的影響

缺血側(cè)大腦較對(duì)側(cè)蒼白腫脹，水腫區(qū)域略突出于大腦表面。假手術(shù)組大鼠兩側(cè)大腦半球無明顯區(qū)別，呈均勻一致的粉紅色腦組織，模型組及各用藥組均可見腦組織水腫。與假手術(shù)組相比，模型組及各用藥組腦組織含水率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，中藥高劑量組、中藥低劑量組和尼莫地平組腦組織含水率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組及尼莫地平組腦組織含水率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥高劑量組與尼莫地平組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織含水率的比較

2.5 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織AQP4 mRNA和AQP9 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組及各用藥組AQP4 mRNA和AQP9 mRNA表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，中藥高劑量組、中藥低劑量組及尼莫地平組AQP4 mRNA和AQP9 mRNA表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組相比，中藥高劑量組與尼莫地平組AQP4 mRNA和AQP9 mRNA表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥高劑量組與尼莫地平組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織AQP4 mRNA和AQP9 mRNA表達(dá)的比較

2.5 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織AQP4和AQP9蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組及各用藥組AQP4和AQP9蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，中藥高劑量組、中藥低劑量組及尼莫地平組AQP4和AQP9蛋白表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組相比，中藥高劑量組與尼莫地平組AQP4和AQP9蛋白表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥高劑量組與尼莫地平組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖3。

注：A假手術(shù)組，B模型組，C中藥低劑量組，D中藥高劑量組，E尼莫地平組。圖2 各組腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死面積的比較

表5 各組腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織AQP4和AQP9蛋白表達(dá)的比較

注：A假手術(shù)組，B模型組，C中藥高劑量組，D中藥低劑量組，E尼莫地平組圖3 各組腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織AQP4和AQP9的蛋白表達(dá)

3 討論

腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)與心臟病和腫瘤并列為引起人類死亡的三大主要原因[5]。CVD又分為缺血性腦血管病和出血性腦血管病，臨床上以前者為主。腦梗死又稱缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)，是一種發(fā)病率、致死率及致殘率極高的疾病。臨床上以CIS最為多見。治療上以盡早促進(jìn)血液重新再灌注，盡快恢復(fù)血氧供應(yīng)，清除有害代謝物質(zhì)，盡可能減輕缺血腦組織損傷。缺血腦組織再灌注治療時(shí)不僅會(huì)有正向反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)加重其病理損傷，即CIRI。CIRI涉及復(fù)雜的病理機(jī)制，主要有能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、鈣超載、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥損傷、自噬、腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。其基本病理改變?yōu)槿毖X組織壞死和周圍組織水腫。有研究表明腦水腫會(huì)加重腦組織損傷[6]。目前有許多關(guān)于腦水腫發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究，例如細(xì)胞膜能量代謝障礙、鈣超載、自由基、細(xì)胞內(nèi)乳酸中毒學(xué)說及神經(jīng)分子學(xué)說等。腦水腫是指腦內(nèi)水分增加、導(dǎo)致腦容積增大的病理現(xiàn)象，是腦組織對(duì)各種致病因素的反應(yīng)，可致顱內(nèi)高壓，損傷腦組織。在CIS中，血栓的形成閉塞了腦動(dòng)脈，損害了細(xì)胞代謝，導(dǎo)致細(xì)胞毒性水腫，隨后血腦屏障滲漏形成血管源性水腫，且缺血過程中導(dǎo)致 Na+-K+ATP 酶的功能不足[7]。

據(jù)報(bào)道，腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成與AQPs密切相關(guān)[8]。研究發(fā)現(xiàn)AQPs是各種細(xì)胞類型和生物中普遍表達(dá)的水通道蛋白家族，可使水在質(zhì)膜的磷脂雙層上雙向流動(dòng)，是駐留在細(xì)胞膜上的選擇性水通道[9]。AQPs的一個(gè)重要亞型AQP4廣泛存在于大腦中，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的水通道蛋白，在維持大腦水平衡、調(diào)節(jié)滲透及代謝，以及改善缺血性中風(fēng)后腦水腫中起關(guān)鍵作用[10]。AQP9作為AQPs的另一個(gè)重要亞型，具有相對(duì)選擇通透性，參與組織中水轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外間隙與體循環(huán)之間的信號(hào)傳遞[11-14]。其中AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要水通道，廣泛分布于腦組織，與腦水腫形成的生理病理過程密切相關(guān)，參與腦組織水的運(yùn)輸調(diào)節(jié)。AQP4作為血腦屏障重要組成成分，對(duì)血腦屏障的發(fā)育成熟與功能起重要作用，與細(xì)胞毒性水腫和血管源性水腫均密切相關(guān)[15]。AQP4在細(xì)胞毒性水腫早期會(huì)促進(jìn)水腫液形成，在血管性腦水腫中會(huì)加速消除水腫。Kiening等[16]及Manley等[17]發(fā)現(xiàn)AQP4基因敲除小鼠局灶性腦梗死后，梗死灶周圍水腫明顯減輕。大量研究表明在腦水腫的各種病理過程中，AQP4的表達(dá)起著很關(guān)鍵的作用[18-21]。因此AQP4可作為治療CIS引起腦水腫的潛在靶點(diǎn)。AQP9作為AQPs一員，是一組與組織中水的轉(zhuǎn)運(yùn)、水電解質(zhì)的平衡調(diào)節(jié)等有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在調(diào)節(jié)腦和脊髓組織的水代謝過程中發(fā)揮著重要作用[22-23]。有研究表明，AQP-9的表達(dá)與腦水腫的程度呈正相關(guān)[24-25]。因此可通過調(diào)控AQP4和AQP9表達(dá)來減輕腦水腫損傷，保護(hù)腦組織。

腦缺血再灌注損傷造成的神經(jīng)功能損傷癥狀，如言語不利、偏癱、偏身感覺障礙、突然昏倒不省人事等與中醫(yī)“缺血性中風(fēng)”癥狀相似，屬于其范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性中風(fēng)基本病機(jī)為陰陽失調(diào)，氣血逆亂，上犯于腦。本病病位在腦，與心、肝、脾、腎密切相關(guān)。病理性質(zhì)多屬本虛標(biāo)實(shí)，上盛下虛。以肝腎陰虛、氣血衰少為本虛，以風(fēng)火相扇、痰濕壅盛、氣血逆亂為標(biāo)實(shí)。聯(lián)系現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理機(jī)制研究，認(rèn)為腦組織缺血半暗帶可作為瘀血的微觀指標(biāo)，腦水腫為痰阻的微觀指標(biāo)。臨床上筆者團(tuán)隊(duì)認(rèn)為缺血性中風(fēng)的病機(jī)為，腦絡(luò)受損影響血液正常運(yùn)行，血不利則為水，水邪既生，蓄積增多，淀為水濁，久濁不散，蘊(yùn)釀成毒，即“濁凝閉阻清竅，瘀毒損傷腦絡(luò)”。因此在治法上以化濁解毒活血通絡(luò)為主。筆者團(tuán)隊(duì)根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出化濁解毒活血通絡(luò)中藥復(fù)方，方中石菖蒲芳香辟穢、化濕祛痰、醒神開竅，黃連清心解毒以助開竅，郁金化濁活血、清心開竅，三藥合而為君，共奏化濁解毒、活血通絡(luò)之功；地龍性善走竄、善于搜風(fēng)刮絡(luò)、清熱熄風(fēng)，丹參、赤芍涼血活血，當(dāng)歸養(yǎng)血活血化瘀，共為臣藥活血化瘀通絡(luò)；茯苓健脾滲濕，使痰濁無以生成。澤瀉滲濕泄熱，使?jié)岫局皬南露?，為方中之佐。川芎活血行氣，引藥直達(dá)病所而為使藥。共奏化濁解毒、活血通絡(luò)之效。本方兼顧化濁、解毒、活血，使痰濁得化，熱毒得除，瘀血得消，腦竅得通，從而改善缺血性中風(fēng)癥狀。現(xiàn)代藥理研究表明，該方中單味藥物經(jīng)現(xiàn)代藥理研究顯示多對(duì)CIRI具有神經(jīng)保護(hù)作用，如石菖蒲其揮發(fā)油化學(xué)成分中β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚均有中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用，且石菖蒲有效成分透過血腦屏障才能發(fā)揮藥效[26]。牛憲立等[27]發(fā)現(xiàn)黃連浸出液可以改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能。郭銀玲[28]研究發(fā)現(xiàn)黃連素能夠明顯減少腦組織含水量，進(jìn)而改善腦損傷。齊越等[29]發(fā)現(xiàn)溫郁金揮發(fā)油可改善神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂、水腫等現(xiàn)象，減少神經(jīng)元死亡。徐丙超等[30]發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液通過顯著降低患者血清P-選擇素和膠質(zhì)纖維酸性蛋白水平，提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，促進(jìn)神經(jīng)缺損功能恢復(fù)。川芎生物堿可改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能損傷、減小腦梗死面積、減輕自由基損傷，進(jìn)而減少腦缺血再灌注后腦組織的傷害[31]。曾嘉豪等[32]發(fā)現(xiàn)芍藥苷通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路而上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[32]。

本研究表明化濁解毒活血通絡(luò)中藥復(fù)方制劑能明顯降低CIRI模型大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分，改善病變腦組織病理形態(tài)學(xué)損傷，明顯縮小腦梗死面積，通過調(diào)節(jié)大腦水通道蛋白AQP4、AQP9的表達(dá)減輕腦水腫。通過一系列結(jié)果證明，化濁解毒活血通絡(luò)法對(duì)CIRI具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，也進(jìn)一步證實(shí)了“濁凝閉阻清竅，瘀毒損傷腦絡(luò)”。另外，中藥高劑量組效果明顯優(yōu)于中藥低劑量組，但同尼莫地平組相比較無顯著差異，這一情況表明化濁解毒活血通絡(luò)中藥復(fù)方制劑對(duì)CIRI的療效與藥物濃度存在一定關(guān)系，但同西藥相比，中藥的療效作用是否存在優(yōu)勢(shì)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。腦水腫致病機(jī)制存在多樣性，并且化濁解毒活血通絡(luò)中藥復(fù)方治療CIRI的潛在靶點(diǎn)也具有多元性，因此還需進(jìn)一步探索，以便為本方在臨床廣泛應(yīng)用提供有力證據(jù)。