曹 霖，生高凡，江詩琴，黃 民，金 晶

(中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

肺癌作為發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的生存和健康[1]。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占比約80%，但患者的5年生存率卻不足20%[2]。目前，NSCLC的治療手段主要以手術、化療、放療、介入、免疫療法和靶向治療等為主，其中化療仍是主要治療方式之一，但其不良反應也對患者的生活質量造成了較大影響[3]。奧希替尼(osimertinib，Osi)作為第三代表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)類藥物，針對廣泛存在的EGFR T790M突變導致的吉非替尼耐藥而開發(fā)，不僅具有比前兩代藥物更好的療效，同時對于中樞神經系統(tǒng)的腫瘤轉移也有一定的作用[4-5]。然而，Osi的耐藥依舊限制了其長期的臨床應用，并最終致使癌癥進展惡化。因此，探究Osi耐藥的產生機制顯得尤為重要。

轉錄組學是指在特定的細胞、組織或生物體中針對特定的發(fā)育階段或生理條件對完整的轉錄本進行研究，這套完整的轉錄本就稱為一個轉錄組，主要包括mRNA、rRNA、tRNA、ncRNA、miRNA和lncRNA等[6]。RNA-seq作為一種比較成熟的轉錄組學研究方法，主要通過將RNA轉化為cDNA片段文庫并進行深度高通量測序，從而獲得研究目標的轉錄組，具有檢測范圍廣、背景信號低、樣本用量少等優(yōu)點[7]。近年來，轉錄組學已被應用于識別疾病的生物標志物，以及研究各種刺激和應激導致的生物學反應，并在推動基因組和分子生物學研究中發(fā)揮著關鍵作用[8]。

本研究以人非小細胞肺癌細胞H1975細胞、及其Osi獲得性耐藥株H1975/OR細胞為研究對象，基于轉錄組學初步探討了鐵死亡通路在Osi耐藥中可能發(fā)揮的作用，為進一步進行Osi的耐藥機制研究提供支持，并為克服Osi治療肺癌出現(xiàn)的耐藥性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人肺成纖維細胞HLF-1和人非小細胞肺癌細胞H1975購自中國科學院上海細胞庫，人非小細胞肺癌Osi耐藥細胞H1975/OR由澳門大學陸金健教授課題組饋贈。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基(批號：10013043)、胎牛血清(批號：08020001)、青霉素-鏈霉素溶液(批號：30002351)購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒(批號：230078)購自上海畢傲圖生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：8121327)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(批號：2193232)、PBS緩沖液(批號：8120140)、BCA試劑盒(批號：VL319460)購自美國Thermo Fisher公司；RNAex Pro TRIzol試劑(批號：A2A0207)購自廣州瑞真生物科技有限公司；Osimertinib(批號：1-NJL-79-1)購自加拿大Toronto Research Chemicals(trc)公司；RSL3(批號：1219810-16-8)、Erastin(批號：571203-78-6)購自上海陶素生化科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購自上海博彩生物科技有限公司；PVDF膜(批號：R1CB59666)、ECL化學發(fā)光液(批號：2017802)購自美國Millipore公司; 兔抗TFR1抗體(批號：00026160)購自美國Proteintech公司；兔抗FPN(批號：A20180627764)、FTH(批號：A20180627766)、FTL(批號：A20180627765)抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；兔抗SLC7A11(批號：4000000753)、GPX4(批號：3561103009)抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔抗β-actin抗體(批號：18)、HRP標記的兔二抗(批號：30)購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司。

1.1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；IX73研究級倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；電泳及電轉系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);Image Quant LAS4000 曝光成像儀(美國General Electric公司)；多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HLF-1細胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，H1975細胞和H1975/OR細胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞存活率 將處于對數生長期的H1975細胞和H1975/OR細胞以5×107·L-1的密度分別接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，加入100 μL含不同濃度Osi、RSL3或Erastin的培養(yǎng)液，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋藥液，使其終濃度分別為：Osi(0.001、0.01、0.1、1、10 μmol·L-1)，RSL3(25 nmol·L-1)，Erastin(2 μmol·L-1)，并設置空白對照組，每組5個復孔。Osi培養(yǎng)72 h或RSL3、Erastin培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，另設3個空白復孔，每孔加入100 μL含10% CCK-8的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h后，酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度值OD，相對細胞存活率/%=(實驗組OD-空白孔OD)/(對照組OD-空白孔OD)×100%。

1.2.3轉錄組學樣本處理及數據分析 將處于對數生長期的H1975細胞和H1975/OR細胞以1×109·L-1的密度分別接種于6孔板中，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下確定細胞生長狀態(tài)良好，終止培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)基，加入PBS洗滌細胞2次。每孔加入500 μL TRIzol，反復吹打至細胞充分裂解，轉移至耐-192 ℃低溫的螺紋口凍存管后，立即于液氮中進行速凍，-80 ℃冰箱保存。

提取H1975和H1975/OR細胞的總RNA并進行質量檢測，質檢合格后進行mRNA純化、片段化及雙鏈cDNA的合成與純化。然后通過末端修復、接頭連接及PCR擴增等步驟，完成樣本文庫構建并上機進行測序。測序平臺采用高通量Illumina Hiseq 4000測序儀，產出原始數據并進行預處理，去除接頭和低質量reads，與參考基因組進行比對及統(tǒng)計，對基因和轉錄本進行表達豐度分析，根據FPKM值篩選獲得差異基因并對其表達譜進行分析，對差異基因進行GO功能富集性分析和KEGG通路富集性分析。樣本處理、上機測序及生物信息分析由杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司完成。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 將處于對數生長期的HLF-1細胞、H1975細胞和H1975/OR細胞以1×109·L-1的密度分別接種于6孔板中，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下確定細胞生長狀態(tài)良好，終止培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)基，加入PBS洗滌細胞2次。加入RIPA并于冰上裂解細胞30 min，刮取收集于1.5 mL EP管中超聲15 s，離心獲得總蛋白。進行BCA蛋白定量后，加入上樣緩沖液，于干式恒溫器100 ℃加熱變性10 min。10% SDS-PAGE電泳分離后，電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗TFR1、FPN、SLC7A11、FTL、FTH、GPX4、β-actin，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，顯影。采用ImageJ軟件進行灰度掃描分析結果。

2 結果

2.1 H1975細胞和H1975/OR細胞對Osi的敏感性差異為了驗證H1975細胞和H1975/OR細胞對于Osi的敏感性存在差異，采用CCK-8法考察不同濃度Osi對兩種細胞存活率的影響。結果如Fig 1所示，隨著Osi濃度的增加，H1975細胞的存活率明顯下降，顯微鏡視野下也可明顯觀察到死細胞數目的增多，Osi對其的IC50為0.06 μmol·L-1。與之相比，H1975/OR細胞在顯微鏡視野下狀態(tài)良好，其存活率只在Osi濃度高于1 μmol·L-1時才出現(xiàn)了較為顯著的下降趨勢，IC50為4.23 μmol·L-1，說明H1975細胞對Osi的敏感性遠強于獲得性耐藥的H1975/OR細胞。

Fig 1 Effect of Osi on cell viability of H1975 cells and

2.2 轉錄組學發(fā)現(xiàn)H1975細胞和H1975/OR細胞的鐵死亡通路存在差異為進一步探究H1975/OR細胞對于Osi可能存在的耐藥機制，采用轉錄組學技術對兩種細胞的基因表達差異進行了分析比較，以差異倍數FC≥2或FC≤0.5為變化閾值，P值<0.05作為篩選差異基因的標準。結果如Fig 2所示，H1975/OR細胞與H1975細胞相比，其中71個差異基因上調，48個差異基因下調。

Fig 2 Volcano diagram of differential gene numbers between H1975 and H1975/OR cells

對差異基因進行GO富集分析，主要包括生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)3類，結果如Fig 3所示。將GO富集分析結果繪制為氣泡圖，氣泡的顏色和大小分別表示每一項的P值大小和該項包含的差異基因數，如Fig 4所示。其中，生物學過程的富集結果顯示，H1975細胞和H1975/OR細胞的差異基因主要富集在DNA為模板的轉錄調控、多細胞組織發(fā)育、RNA聚合酶Ⅱ的轉錄調控、以及胞內蛋白代謝等生物過程。細胞組分的富集結果顯示，差異基因主要分布在細胞核、細胞膜、細胞質、胞質溶膠和核質等細胞部位。分子功能的富集結果顯示，差異基因主要是通過影響蛋白、金屬離子、核酸等分子的結合以及轉移酶和水解酶等的功能而發(fā)揮作用。

Fig 3 GO functional enrichment of differential genes between H1975 and H1975/OR cells

Fig 4 Bubble diagram of GO functional enrichment of differential genes between H1975 and H1975/OR cells

對差異表達基因進行KEGG通路富集分析，將結果繪制為氣泡圖，氣泡的顏色和大小分別表示每種信號通路的P值大小和該條信號通路包含的差異基因數，如Fig 5所示。結果顯示，差異基因主要參與了甲狀腺激素合成、鐵死亡、膽固醇代謝、單純皰疹病毒1感染、長壽調節(jié)途徑、AMPK等信號通路。其中，鐵死亡通路的富集程度和差異基因數均較高，提示鐵死亡信號通路的改變可能在Osi獲得性耐藥中扮演著重要角色。

Fig 5 Bubble diagram of KEGG enrichment of differential genes between H1975 and H1975/OR cells

2.3 HLF-1、H1975細胞和H1975/OR細胞的鐵死亡相關蛋白表達存在差異基于轉錄組學所獲得的結果，為進一步驗證鐵死亡通路在Osi敏感與耐藥肺癌細胞上的差異，采用Western blot技術檢測了HLF-1、H1975和H1975/OR細胞部分鐵死亡通路相關的蛋白表達差異。如Fig 6所示，其中，除TFR1以外的蛋白在Osi耐藥H1975/OR細胞上相比H1975細胞均具有顯著的表達水平升高。同時，除FTH以外的蛋白在肺癌細胞H1975和H1975/OR細胞上都顯示出了比人肺成纖維細胞HLF-1更高的表達水平。

Fig 6 Ferroptosis pathway proteins expression level of HLF-1, H1975 and H1975/OR cells n=3)

2.4 鐵死亡誘導劑對H1975細胞和H1975/OR細胞存活率的影響為進一步證實鐵死亡通路在Osi獲得性耐藥中的作用，采用CCK-8法考察兩種鐵死亡的誘導劑RSL3和Erastin對H1975細胞和H1975/OR細胞的存活率影響。如Fig 7所示，與對照組相比，RSL3在25 nmol·L-1時能明顯降低H1975/OR細胞的存活率，而對H1975細胞則只有略微的影響。同時，Erastin在2 μmol·L-1時也能明顯降低H1975/OR細胞的存活率，而對H1975細胞則無影響，表明Osi耐藥的H1975/OR細胞對于鐵死亡的誘導劑具有更高的敏感性。

Fig 7 Effect of RSL3 and Erastin on cell viability of H1975 cells and H1975/OR cells n=5)

3 討論

肺癌作為一種高發(fā)病率與高死亡率的惡性腫瘤，始終是影響人類健康與生存的一大難題，而現(xiàn)有的治療方式如化療和放療等均具有較嚴重的不良反應。近年來，靶向治療不僅具有較低的毒副作用，同時也顯示出了更好的療效，在改善肺癌病人的生存情況方面取得了巨大突破。以吉非替尼、阿法替尼等為代表的第一、二代EGFR-TKIs顯著延長了許多患者的生存期，已作為具有EGFR敏感型突變NSCLC患者的一線用藥[9]。然而，多數患者在接受10-14個月治療后均會顯示出耐藥性，其中50%以上是由于EGFR T790M突變所導致[10]。Osi作為第三代EGFR-TKI類靶向治療藥物，在對于具有EGFR T790M突變的非小細胞肺癌患者中具有顯著療效，同時，較少的不良反應和對中樞神經系統(tǒng)腫瘤轉移的治療能力也使其在臨床得到廣泛使用[4]。然而，長期使用后產生的耐藥性極大地限制了Osi在臨床的進一步應用，不同于前兩代EGFR-TKI較為普遍的T790M突變耐藥機制，目前對Osi的耐藥機制還存在著眾多說法。因此，探究Osi耐藥的機制并找到克服耐藥的方法是臨床研究急待解決的問題之一[11]。

隨著高通量測序技術發(fā)展成熟，生命科學對遺傳信息的研究已進入了一個新的階段。RNA-seq作為研究轉錄組學的代表性方法，現(xiàn)在已廣泛應用于對生命體各個層面的機制研究[6]。目前，RNA-seq的主要研究步驟包括：提取RNA并將其逆轉錄為cDNA，對cDNA進行末端修復、接頭連接等步驟并擴增獲得cDNA文庫，對得到的cDNA文庫進行高通量測序，并與參考基因組進行比對分析獲得差異基因，以及差異基因的后續(xù)分析及可視化等步驟[7]。研究發(fā)現(xiàn)，通過對非小細胞肺癌H1975細胞及其Osi獲得性耐藥H1975/OR細胞的轉錄組學進行分析，證實二者在基因表達水平差異較大。進一步分析GO功能富集結果，二者在生物學過程、細胞組分、分子功能等方面均有著較大差異，而KEGG通路富集揭示了這些差異基因存在的信號通路，如甲狀腺激素合成、鐵死亡、膽固醇代謝、單純皰疹病毒1感染、長壽調節(jié)途徑、AMPK等信號通路。其中，鐵死亡相關信號通路的差異尤為明顯，可能預示著鐵死亡在Osi耐藥的形成中扮演著必要的角色。

鐵死亡是由脂質過氧化物的蓄積和隨后的質膜破裂引起的鐵依賴性的調節(jié)性細胞死亡，在形態(tài)、生化與基因調控上均不同于凋亡與壞死[12]。鐵死亡可由外源性或內源性途徑誘導，外源性途徑是通過抑制細胞膜轉運蛋白，如胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白(又稱system Xc-)或激活轉鐵蛋白等啟動，內源性途徑是通過阻斷胞內抗氧化酶(如GPX4)激活[13]。目前鐵死亡被認為是天然的腫瘤抑制機制，在許多癌癥療法，如放療、免疫療法和部分化療中發(fā)揮著重要作用，已發(fā)現(xiàn)部分癌癥相關通路與鐵死亡的發(fā)生發(fā)展密切相關[14]。鐵死亡誘導劑Erastin和RSL3可對工程性RAS突變的腫瘤細胞選擇性致死，抑制RAS或其下游信號分子可逆轉Erastin和RSL3的作用[15]。NRF2信號通路可通過激活與鐵代謝、GSH代謝以及ROS解毒酶相關基因抵御鐵死亡過程中的氧化損傷[16]。在上皮-間質-轉化(EMT)的過程中，鈣粘蛋白1介導的細胞間接觸可以保護細胞免遭鐵死亡，而SNAIL、TWIST1或ZEB1表達增加可恢復對鐵死亡的敏感性[17]。目前已發(fā)現(xiàn)多種獲批準上市的藥物(如索拉非尼、青蒿素和他汀類)、電離輻射和細胞因子(如TGF-β1和IFN-γ)等可誘導鐵死亡，從而抑制腫瘤生長[11]。但迄今為止，關于鐵死亡在腫瘤耐藥中發(fā)揮的作用還較少被研究。

鐵死亡相關的信號通路包含多種蛋白的調控作用，其中轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1，TFR1)介導的鐵攝取可促進鐵死亡，而鐵轉運蛋白(ferroportin，F(xiàn)PN)介導的鐵輸出則可抑制鐵死亡；組成鐵蛋白(ferritin)的FTH和FTL可介導胞內鐵的存儲，其自噬降解會通過增加胞質內鐵的蓄積促進鐵死亡的發(fā)生；SLC7A11所屬的system xc-負責將半胱氨酸導入細胞，隨后由GCL介導產生谷胱甘肽；GPX4可以直接將過氧化氫磷脂還原為羥基磷脂，從而作為癌細胞鐵死亡的中樞抑制因子[18]?；谵D錄組學的結果，通過比較兩株細胞以及正常細胞HLF-1的鐵死亡相關蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)負責鐵轉運的蛋白TFR1、FPN，鐵存儲相關的蛋白FTL、FTH，以及介導清除過氧化脂質相關的蛋白SLC7A11、GPX4等均有不同程度的變化，進一步證實了鐵死亡信號通路的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥的產生有著密不可分的關系。對于鐵死亡的誘導劑RSL3和Erastin，H1975/OR細胞均顯示出了比H1975細胞更強的敏感性，說明誘導耐藥細胞鐵死亡增強可能成為解決Osi耐藥的途徑之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了人非小細胞肺癌細胞H1975與其Osi耐藥細胞H1975/OR在多個細胞組分與信號通路中基因表達的差異，其中鐵死亡通路的變化顯著，并證實Osi耐藥細胞對鐵死亡誘導劑更加敏感。本研究為開展克服Osi耐藥的相關研究提供思路，并為誘導鐵死亡克服Osi耐藥提供實驗依據。

(致謝：本實驗在中山大學藥學院臨床藥理研究所完成，衷心感謝提供指導與幫助的各位老師及同學。)