張一凡，韓向暉，劉 萍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)1.附屬龍華醫(yī)院、2.中醫(yī)外科研究所，上海 200032)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，是脂質(zhì)在大、中型動脈內(nèi)膜沉積并導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊形成的過程[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，AS是由脂質(zhì)驅(qū)動炎癥反應(yīng)的病理過程。因此，改善脂質(zhì)代謝、緩解炎癥反應(yīng)仍然是治療AS的有效方法。而肝臟在脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。因此，本實驗擬觀察AS模型小鼠的肝臟炎癥變化。

丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是丹參的主要有效水溶性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，對心血管、肝臟、腦、肺、腎均有保護作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Sal B可有效改善肝損傷、抑制肝臟炎癥[5]。但是，Sal B在AS模型小鼠肝臟炎癥反應(yīng)中的具體機制尚不完善。因此，本研究以高脂飲食誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)敲除小鼠作為AS模型，觀察Sal B對AS模型小鼠肝臟組織炎癥因子及其蛋白表達的影響，并探討其對絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)/核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等炎癥相關(guān)信號通路蛋白的調(diào)控，明確Sal B對炎癥反應(yīng)的作用及其機制，為其抗動脈粥樣硬化臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 ♂ LDLR基因敲除小鼠，6周齡，體質(zhì)量為(18～23) g，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，動物合格證號：202000150，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008；飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級動物實驗室。

1.1.2實驗藥物與試劑 Sal B購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號19031101，純度98%。阿托伐他汀鈣片(atorvastatin calcium tablets，ATO)，購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院西藥房，批號CK2270。蛋白質(zhì)抽提試劑盒(批號P0013B)、BCA蛋白定量試劑盒(批號P0010)、SDS-PAGE電泳試劑(批號103019200702)、蘇木精-伊紅染液(批號052020200176)購自碧云天科技有限公司；油紅O染液(批號SLBH0251V)購于美國SIGMA公司；ERK1/2(批號28)、p-ERK1/2(批號28)、p38(批號9)、p-p38(批號13)、GAPDH(批號7)抗體購于CST公司；JNK(批號A1221)、P-JNK(批號A2621)、p-NF-κB(批號C0221)、NF-κB(批號K2320)、p-IκB(批號C1021)、IκB(批號B1621)抗體購于Santa Cruz公司；VCAM(批號GR257919-8)、iNOS(批號GR3205303-1)抗體購于Abcam公司；mRNA提取試劑盒購于中國上海海方生物技術(shù)有限公司，批號B4DP210121；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和 PCR反應(yīng)試劑盒購于日本TaKaRa公司，批號AJ10935A、AIF1686A；引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，批號111359735；ELISA試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司，批號2009101、2008251、2008261。

Tab 1 NAS histology scoring criteria

1.1.3儀器 垂直電泳儀、置膠架、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；StepOne Plus實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；SynergyH4 型酶標(biāo)儀，美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠干預(yù)與造模 LDLR-/-小鼠32只隨機分為對照組(CON)、模型組(MOD)、丹酚酸B組(Sal B)、阿托伐他汀組(ATO)，每組8只。CON給予普通飼料喂養(yǎng)，MOD、Sal B、ATO組給予高脂飼料(含脂肪21%，膽固醇0.15%)。12周后，分別給予CON、MOD組生理鹽水200 μL腹腔注射，Sal B組給予25 mg·kg-1Sal B溶液腹腔注射，ATO組給予阿托伐他汀1.3 mg·kg-1灌胃，療程12周。

1.2.2血清生化檢測 小鼠腹腔麻醉后，取腹主動脈血，靜置0.5 h后，離心，3 000 r·min-1，4 ℃，取上清。血清送上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗科，應(yīng)用全自動生化儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，AST)。

1.2.3小鼠主動脈、肝組織病理染色 小鼠主動脈、肝組織在4%中性甲醛溶液中固定48 h。主動脈移至蔗糖溶液中脫水，OCT膠包埋，切片厚度約10 μm，按照油紅O標(biāo)準(zhǔn)流程進行染色封片晾干后在顯微鏡下觀察并拍照。采用Image Pro Plus圖像分析軟件測量斑塊及官腔面積，比例(%)=斑塊面積/管腔面積×100%。肝組織脫水浸蠟后，進行石蠟包埋切片，厚度約10 μm，按照HE標(biāo)準(zhǔn)流程進行染色封片晾干后在顯微鏡下觀察并拍照。肝組織常規(guī)評分標(biāo)準(zhǔn)見Tab 1。

1.2.4ELISA檢測小鼠血清炎癥因子含量 取小鼠血清。配制標(biāo)準(zhǔn)品液、洗滌液。每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100 μL，37 ℃反應(yīng)45 min。洗板，加入第一抗體工作液，37 ℃反應(yīng)20 min。洗板，加入酶標(biāo)抗體工作液，37 ℃反應(yīng)10 min。洗板，加入底物工作液，37 ℃避光反應(yīng)15 min，加入終止液。在酶標(biāo)儀450 nm 處讀取吸光度值。

1.2.5實時定量RT-PCR測定肝組織炎癥因子mRNA表達 取小鼠肝組織，按照RNA提取試劑盒按說明書提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin 為內(nèi)參進行熒光定量PCR擴增以檢測各組小鼠肝組織中白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)mRNA的表達水平。以2-ΔΔ Ct法表示各目的基因的相對表達量。擴增引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，引物序列見Tab 2。

Tab 2 List of primers for real-time qPCR analysis

1.2.6Western blot檢測MAPKs/ NF-κB相關(guān)蛋白表達 取肝組織加入細胞裂解液，進行組織勻漿，離心收集上清提取細胞蛋白。采用BCA法進行蛋白定量。將蛋白樣品加入上樣緩沖液，95 ℃孵育5 min進行蛋白變性，上樣至聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。封閉1 h后，分別以一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育 1 h。電化學(xué)法顯影后，采集條帶并進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清血脂、轉(zhuǎn)氨酶水平AS模型組小鼠血清TC、TG、ALT、AST較正常對照明顯升高(P<0.05)。與MOD比較，Sal B、ATO明顯降低TC、TG、ALT、AST(P<0.05)(Tab 3)。

Tab 3 Comparison of serum lipids and transaminase levels in each group of

2.2 各組小鼠主動脈根部粥樣硬化斑塊面積、肝組織病理改變AS模型組小鼠主動脈粥樣斑塊面積較正常對照組明顯增大。與MOD比較，Sal B、ATO干預(yù)后明顯減小斑塊面積(P<0.05)。CON小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常且清晰，MOD小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)炎性細胞浸潤灶、氣泡性脂肪變。與MOD對比，Sal B、ATO組小鼠肝組織病理變化得到明顯改善(Fig 1)。

Fig 1 Histopathological figure of each group of

2.3 丹酚酸B對各組小鼠炎癥因子及肝組織炎癥蛋白表達的影響ELISA法檢測各組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量，結(jié)果顯示，MOD小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯升高(P<0.05)；Sal B、ATO明顯降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(P<0.05)。RT-PCR法檢測各組小鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達，結(jié)果顯示，MOD小鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達明顯升高(P<0.05)；Sal B、ATO明顯降低上述炎癥因子mRNA表達(P<0.05)(Tab 4)。

Tab 4 Comparison of serum inflammatory factors in each group of

Western blot 檢測肝組織炎癥蛋白血管細胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達水平。結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織VCAM、iNOS蛋白表達明顯升高(P<0.01)，Sal B干預(yù)后，VCAM、iNOS蛋白表達明顯降低(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Expression of inflammatory protein in liver tissues of mice in each

2.4 丹酚酸B對小鼠肝臟MAPKs/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響MAPKs/NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中起到重要作用。Western blot檢測小鼠肝組織MAPKs/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，MOD組JNK、p38、ERK1/2、IκB、NF-κB蛋白的磷酸化水平均明顯升高(P<0.01)，Sal B明顯下調(diào)上述蛋白磷酸化水平(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 3 MAPKs/NF-kB signaling pathway related protein expression in liver tissues of mice in each

3 討論

AS的發(fā)病機制與脂質(zhì)代謝異常、炎癥、氧化應(yīng)激等有關(guān)[1]。血脂異常是AS發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素。肝臟在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，是脂肪酸合成和脂質(zhì)循環(huán)的樞紐[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝病是心血管疾病死亡率的獨立預(yù)測因素，并與頸動脈內(nèi)膜-中膜增厚和斑塊早發(fā)有關(guān)[6]。既往有研究發(fā)現(xiàn)，“瓜蔞-薤白”明顯減少AS小鼠主動脈斑塊，減輕肝臟脂滴積累[7]；甘草酸調(diào)節(jié)肝臟膽固醇代謝，有效阻抑Apo E-/-小鼠AS的發(fā)展[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方冠心康通過調(diào)控肝臟ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子等分子的表達，改善脂質(zhì)代謝紊亂，從而改善ApoE-/-小鼠AS[9]。本實驗結(jié)果顯示，Sal B降低高脂飲食誘導(dǎo)AS的LDLR-/-小鼠血清中的TC、TG水平，病理學(xué)觀察顯示，Sal B減少LDLR-/-小鼠主動脈斑塊、肝臟脂滴積累，改善肝組織病理改變。這提示Sal B通過改善血脂異常從而控制斑塊的形成。

研究發(fā)現(xiàn)[10]，肝臟炎癥在AS過程中發(fā)揮重要作用，導(dǎo)致AS的炎癥因子部分來源于肝臟。研究表明[11]，肝臟炎癥的發(fā)生早于主動脈早期病變形成。過量的脂質(zhì)攝入會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，激活干擾素γ、IL-1、TNF-α等炎癥信號通路，釋放炎癥因子C-反應(yīng)蛋白、IL-6等，促進動脈粥樣硬化。非酒精性脂肪性肝炎患者比單純脂肪變性患者更容易發(fā)生AS[12]。本實驗結(jié)果顯示，Sal B降低高脂飲食誘導(dǎo)AS的LDLR-/-小鼠血清中ALT、AST及炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，以及肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平和VCAM、iNOS蛋白表達水平，這提示Sal B通過減輕肝組織炎癥緩解動脈粥樣硬化。

MAPKs信號通路參與炎癥和AS的發(fā)展過程[13]。NF-κB是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[14]。當(dāng)Toll樣受體4受到內(nèi)毒素、脂肽的刺激，觸發(fā)骨髓分化因子88依賴途徑，快速激活MAPKs/ NF-κB信號通路，上調(diào)炎性因子的轉(zhuǎn)錄翻譯，增加VCAM、iNOS的表達，促進肝臟炎癥，從而加重AS[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)[17]，MAPKs/NF-κB信號通路的過度激活，會促進巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化，增加活性氧自由基、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進一步驅(qū)動肝臟炎癥。因此抑制MAPKs/NF-κB信號通路是減輕肝臟炎癥的有效途徑。龔勇珍等[18]研究發(fā)現(xiàn)乙酰水楊酸姜黃素酯抑制肝臟NF-κB p65表達，從而下調(diào)肝臟炎癥因子，改善AS。本研究結(jié)果顯示，相比于模型組，給予Sal B干預(yù)后的小鼠肝組織ERK1/2、JNK、p38、IκB、NF-κB蛋白磷酸化水平有不同程度的下調(diào)。說明Sal B可能通過抑制MAPKs/NF-κB信號通路，減輕肝臟炎癥。

綜上所述，本研究闡明Sal B通過抑制肝臟MAPKs/NF-κB信號通路，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，從而緩解動脈粥樣硬化，為抗炎性藥物、抗動脈粥樣硬化藥物篩選提供了實驗依據(jù)。